MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1, Cx, β- clucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose. Enzyme cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzyme công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzyme cellulase, hemicelluse và pectinase. Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường.
Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự công nghiệp hóa hiện đại hóa của đất nước, ô nhiễm môi trường ngày càng trở thành nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn có trong nông nghiệp, lâm nghiệp là cellulase. Việc phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu celluloase như rơm rạ, bã mía, gỗ mục đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc [3].
Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò quan trọng trong chu trình tuần. Vì vậy tôi chọn đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase của một số vi sinh vật bản đia”. Mục đích nghiên cứu - Phân lập và đánh giá được khả năng sinh enzyme cellulose từ một số vi sinh vật bản địa, làm tiền đề cho nghiên cứu xử lí các phụ phẩm chứa cellulose. Yêu cầu của đề tài - Phân lập được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase.
- Đánh giá được vi sinh vật có hoạt tính sinh enzyme cellulase. - Thử nghiệm được vi sinh vật có hoạt tính cellulase trong phân giải cellulose. Ý nghĩa khoa học 1.Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được bộ sưu tập nguồn gene vi sinh vật bản địa có khả năng phân giải cellulose. - Tuyển chọn được chủng vi sinh vật phân giải cellulose cao.
Ý nghĩa thực tiễn - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa và phân loại các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn. Nghiên cứu được các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình phân giải cellulose của vi sinh vật. - Bước đầu ứng dụng vào việc hạn chế ô nhiễm môi trường và hạn chế chất thải. - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế.
Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu Các công trình nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase. Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và Aspergillus.
Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983). Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g.
Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật. Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.
Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn. Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC.
Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, n 4 vỏ cà phê. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của A. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương pháp lên men bán rắn.
Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T. niger trên MT lên men bán rắn. Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [20]. Giới thiệu về cellulose Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.
Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…[2], [3]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose.
Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ. Cellulose là polysacarit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta thấy chúng nó nhiều ở tế bào ở một số loài vi sinh vật.
Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với axit sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose [11]. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose.
Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành.
Cellulose thường chứa 10000-14000 gốc đường và được cấu tạo như sau [11]: Hình 2. Cấu trúc phân tử cellulose n 6 Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vadervan và liên kết hydro. Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm.
Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng: Vùng kết tinh: Các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Enzyme cellulose chỉ tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này.
Vùng vô định hình: Các mạch liên kết với nhau nhờ Vandervan. Ở vùng này cellulóe có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulose sẽ dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng. Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose.
Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH. Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ nước. Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật. Cấu trúc của enzyme cellulase Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-.
Ngoài ra, n 7 trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: Cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nửa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose.
Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Cấu trúc không gian của enzme cellulase n 8 2.
Tính chất của enzyme cellulase Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D- glucan của ngũ cốc. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5.
Nhiệt độ tối ưu từ 40-50 độ C. Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong 10 đến 15 phút. Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ.
Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30-110 KDa (Begunin, 1990; Gilkes và cộng sự, 1991).