đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu, xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu 2. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957) đã phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp.
có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxyporum f. Từ đó, có rất nhiều định nghĩa khác nhau về vi sinh vật (VSV) nội sinh, theo Bacon và White (2000) định nghĩa: “VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [9]. Xạ khuẩn nội sinh ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà phân loại học, sinh thái học, nông học, hóa học và sinh học tiến hóa bởi khả năng sản xuất ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm: kháng sinh, kháng u và kích thích sự tăng trưởng của thực vật - yếu tố quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [21]. Xạ khuẩn cũng đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [3].
Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ nhóm Prokaryota [51].
Xạ khuẩn nội sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào. Đáng chú ý, trong số gần 300.000 loài thực vật trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của một hoặc nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo ra sự đa dạng sinh học rất lớn [56]. Tuy nhiên, mới chỉ có một vài loài thực vật được nghiên cứu để tìm ra các loài xạ khuẩn mới. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới.
Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 [26]. Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.
Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [42]. * Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác n 6 nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1].
Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [41]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất.
Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome ở VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1]. Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S n 7 rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn.
Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [57]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá tri này là 98%. Phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ.
Trên bề mặt tế bào thực vật chứa rất nhiều vi khuẩn, nấm. Do đó, trong quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh, ta cần xử lý bề mặt mẫu thực vật thật kỹ, tránh bị nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội sinh phân lập. Trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu, đầu tiên ta rửa mẫu dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn, vi nấm bề mặt, để khô, cắt nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt.
Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt n 8 hiệu quả [38]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol và một số chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh.
Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [11]. Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, hai tuần đầu tiên VSV phát triển mạnh là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men,… [12, 32, 36].
Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [27]. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, ngày càng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn thường xâm nhập vào mô thực vật qua lỗ khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ phụ và biểu bì bị phân cắt bằng cách hình thành cụm tế bào của chúng [28]. Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên và các vết thương do cơ học hoặc côn trùng.
Chủng xạ khuẩn Streptomyces scabies hình n 9 thành mạng lưới phủ trên bề mặt khoai tây. Sợi nấm xâm nhập vào củ khoai tây thông qua lỗ hổng trên bề mặt cây non và các vết thương khi khoai tây đang ở giai đoạn phát triển mạnh. Sau khi xâm nhập, các tác nhân gây bệnh phát triển trong các khoảng trống của tế bào và phý hủy các tế bào mà chúng tiếp xúc.