Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang Litsea cubeba

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang litsea cubeba, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Vũ Thị Thùy
• Người hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến - Phó Viện Trưởng Viện Công Nghệ Sinh Học
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba)
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
• 2.2. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
• 2.3. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
• 2.3.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
• 2.3.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử
• 2.3.1.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
• 2.3.2. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 2.4. Phân lập xạ khuẩn nội sinh
• 2.5. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Lấy mẫu cây Màng tang
• 3.6.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu
• 3.6.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
• 3.6.4. Đánh giá khả năng sinh anthracycline
• 3.6.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25
• 3.6.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ
• 4.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang
• 4.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang
• 4.4. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập
• 4.5. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty
• 4.6. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh
• 4.7. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
• 4.8. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline
• 4.9. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT25
• 4.9.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25
• 4.9.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT25
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn nội sinh là một nhóm vi sinh vật có khả năng sống trong mô thực vật mà không gây hại cho cây chủ. Chúng có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất sinh học, bao gồm kháng sinh và các chất kích thích tăng trưởng. Theo Bacon và White (2000), xạ khuẩn nội sinh được định nghĩa là những vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế bào thực vật mà không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong thực vật rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học. Nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh đang trở thành một hướng đi triển vọng trong việc tìm kiếm các chất kháng sinh mới, đặc biệt trong bối cảnh kháng thuốc ngày càng gia tăng.

II. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes, có khả năng sống trong các cơ quan khác nhau của cây chủ như rễ, thân, lá. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn bao gồm hình dạng tế bào, bào tử và màu sắc khuẩn ty. Hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA đã trở thành phương pháp phổ biến, cho phép xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài. Việc phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây Màng tang (Litsea cubeba) có thể giúp phát hiện các chủng mới với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.

III. Phân lập xạ khuẩn nội sinh

Quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây Màng tang đòi hỏi phải xử lý bề mặt mẫu thực vật kỹ lưỡng để tránh nhiễm tạp. Các phương pháp khử trùng như sử dụng sodium hypochlorite và ethanol được áp dụng để loại bỏ vi sinh vật không mong muốn. Sau khi khử trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thạch thích hợp. Việc sử dụng các môi trường chọn lọc và bổ sung kháng sinh giúp nâng cao khả năng phát triển của xạ khuẩn. Nghiên cứu này không chỉ giúp phân lập các chủng xạ khuẩn mới mà còn mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật từ thực vật.

IV. Đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25

Chủng xạ khuẩn MPT25 được phân lập từ cây Màng tang cho thấy khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh. Đặc điểm sinh học của chủng này bao gồm khả năng đồng hóa nguồn carbon và nitơ, cũng như khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khác nhau. Phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy MPT25 có sự tương đồng cao với các loài xạ khuẩn đã được biết đến. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng MPT25 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

V. Ứng dụng và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn. Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới, giúp giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc tổng hợp hóa học. Đồng thời, nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao nhận thức về vai trò của xạ khuẩn trong hệ sinh thái và trong việc bảo tồn đa dạng sinh học. Việc khai thác các hợp chất sinh học từ xạ khuẩn nội sinh có thể mở ra hướng đi mới trong ngành dược phẩm và nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong bối cảnh y học hiện đại, tình trạng vi khuẩn gây bệnh gia tăng khả năng kháng thuốc kháng sinh đang trở thành một thách thức nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Để đối phó với hiện tượng này, việc tìm kiếm các hợp chất kháng sinh mới từ các nguồn tự nhiên nhằm thay thế hoặc bổ sung cho các loại thuốc tổng hợp hóa học (vốn thường đi kèm nhiều tác dụng phụ) là một định hướng ưu tiên. Theo các công bố khoa học, ước tính có khoảng 70% các chất kháng sinh tự nhiên được ứng dụng trong y học lâm sàng có nguồn gốc từ xạ khuẩn (Actinobacteria), và khoảng 80% các tác nhân kháng sinh được biết đến trên thế giới do nhóm vi sinh vật này sinh tổng hợp.

Bên cạnh xạ khuẩn đất, xạ khuẩn nội sinh (cư trú bên trong các mô tế bào thực vật mà không gây hại cho cây chủ) được xác định là nguồn tài nguyên sinh học phong phú. Chúng có khả năng tạo ra các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng như kháng vi sinh vật, kháng nấm, chống ung thư, kích thích sinh trưởng thực vật và kiểm soát sinh học. Trong số các loài thực vật dược liệu, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.)) thuộc họ Long não (Lauraceae) là loài cây bụi hoặc gỗ nhỏ phân bố phổ biến ở vùng rừng thứ sinh khu vực Đông Nam Á và các tỉnh miền núi Việt Nam. Màng tang từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa cảm mạo, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp, đau nhức xương khớp; tinh dầu của cây chứa các hợp chất monoterpene và sesquiterpene có hoạt tính kháng khuẩn và độc tính đối với tế bào ung thư. Tuy nhiên, các nghiên cứu về hệ vi sinh vật nội sinh nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói riêng trên cây Màng tang tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Thị Thùy tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu sau:

1. Mục đích nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn và nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại của một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.
2. Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.)) thu thập tại tỉnh Phú Thọ.
3. Nhiệm vụ/Nội dung nghiên cứu:
   • Nội dung 1: Phân lập và đánh giá sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ.
   • Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn nội sinh.
   • Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của 01 chủng xạ khuẩn có tiềm năng ứng dụng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ các bộ phận (rễ, thân, lá) của cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.)) và 9 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 11105, Proteus vulgaris CNLM, Salmonella enterica ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Pseudomonas aeruginosa CNLM), vi khuẩn Gram dương (Sarcina lutea CNLM, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus cereus ATCC 11778) và nấm men (Candida albicans ATCC 10231).
• Phạm vi không gian: Mẫu cây Màng tang được thu thập tại tỉnh Phú Thọ (tọa độ: 21°24’25’’N; 105°04’05’’E); các thí nghiệm phân lập, thử hoạt tính sinh học và phân loại phân tử được thực hiện tại Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện từ tháng 12/2015 đến tháng 05/2016.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học và phân loại học xạ khuẩn:

• Khái niệm xạ khuẩn nội sinh: Định nghĩa theo Bacon và White (2000), vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế bào thực vật mà không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, siêu giới nhân sơ (Prokaryota).
• Hệ thống phân loại hình thái và sinh lý - sinh hóa: Dựa trên các tiêu chuẩn phân loại truyền thống của Gauze và cộng sự (1957, 1983), Pridham và cộng sự, Shirling và Gottlieb (1966), cùng bảng màu chuẩn của Tresner và Danga (1958) để phân nhóm khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), cấu trúc cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử.
• Phân loại học phân tử: Sử dụng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA (kích thước khoảng 1540 bp). Ngưỡng tương đồng 98,0% - 98,6% của trình tự 16S rDNA được áp dụng làm tiêu chuẩn để phân biệt các loài vi sinh vật nhân sơ theo Keswani và cộng sự.
• Nhóm kháng sinh anthracycline: Khung lý thuyết về các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư (như daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin). Cấu trúc vòng anthraquinone có đặc tính hóa lý đổi màu phụ thuộc vào pH môi trường (màu da cam ở pH acid và chuyển sang màu tím ở pH kiềm).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Xử lý bề mặt mẫu thực vật: Mẫu rễ, thân, lá Màng tang sau khi rửa sạch được khử trùng bề mặt bằng dung dịch $\text{NaClO } 5,0%$ trong 5 phút, trung hòa $\text{NaClO}$ dư bằng $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3\text{ } 2,0%$ trong 1 phút, ngâm cồn $\text{Ethanol } 70%$ trong 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng và tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng.
• Phân lập chọn lọc: Sử dụng 8 loại môi trường thạch phân lập (HV, SA, STA, TWYE, SPA, TA, CA, ISP5) có bổ sung kháng sinh ức chế vi khuẩn và nấm tạp nhiễm gồm acid nalidixic ($15\text{ mg/mL}$) và nystatin ($15\text{ mg/mL}$). Thời gian nuôi cấy phân lập kéo dài từ 4 đến 6 tuần ở nhiệt độ 28–30°C.
• Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật: Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion). Xạ khuẩn được lên men lắc trên môi trường YIM38 lỏng (tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 30°C trong 5 ngày), ly tâm thu dịch nổi ($6.000\text{ vòng/phút}$, 10 phút, 4°C) và nạp $100\text{ }\mu\text{L}$ dịch lên các đĩa thạch đã trải vi sinh vật kiểm định ($5 \times 10^8\text{ CFU/mL}$). Hoạt tính được xác định qua đường kính vòng kháng khuẩn: $V_{kk} = D - d\text{ (mm)}$ (trong đó $D$ là đường kính vòng vô khuẩn, $d$ là đường kính lỗ thạch).
• Sàng lọc khả năng sinh anthracycline: Nhỏ vi lượng $50\text{ }\mu\text{L NaOH } 2\text{N}$ và $50\text{ }\mu\text{L HCl } 1\text{N}$ vào hai giếng thạch nuôi cấy xạ khuẩn 5 ngày tuổi trên môi trường YIM38; quan sát sự đổi màu xung quanh khuẩn lạc.
• Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý - sinh hóa: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên các môi trường ISP1 đến ISP7; quan sát chuỗi bào tử bằng kính hiển vi quang học và bề mặt bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) tại Viện 69 - Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh. Khảo sát khả năng đồng hóa 13 nguồn carbon và 12 nguồn nitơ trên môi trường ISP9 ($1,0%\text{ w/v}$); kiểm tra sinh trưởng ở các dải nhiệt độ (10–55°C), pH (3,0–12,0) và nồng độ $\text{NaCl}$ (1,0–10,0%).
• Phân loại bằng sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số; khuếch đại gen 16S rDNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi $27\text{F}$ (5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’) và $1429\text{R}$ (5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’); kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,0%; tinh sạch bằng kit PureLink™ DNA Purification; giải trình tự trên máy ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer; tra cứu và so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần mở đầu trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm nguồn chất kháng sinh và kháng ung thư mới từ vi sinh vật nội sinh trong cây dược liệu trước thực trạng kháng thuốc. Tác giả xác định đối tượng nghiên cứu là cây Màng tang (Litsea cubeba), nêu rõ mục đích, mục tiêu, 3 nội dung nghiên cứu chính cùng ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu ích tại Việt Nam.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về:

• Khái niệm, vị trí phân loại học, đặc điểm hình thái học, sinh lý học và phân loại học phân tử của xạ khuẩn dựa trên gen 16S rDNA.
• Cơ chế xâm nhập và nội sinh của xạ khuẩn trong mô thực vật thông qua các lỗ khí khổng, vết nứt tự nhiên hoặc vết thương cơ học.
• Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong y dược và nông nghiệp: khả năng sinh chất kháng sinh, hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kiểm soát sinh học mầm bệnh thực vật và sinh tổng hợp enzyme.
• Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới (phân lập hàng nghìn chủng từ các loài cây dược liệu tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna, Ấn Độ, Thái Lan...) và các nghiên cứu bước đầu tại Việt Nam (Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Sinh học).
• Cấu trúc và cơ chế tác dụng của các kháng sinh chống ung thư nhóm anthracycline (DOX, DNR, EPI, IDA).
• Đặc điểm thực vật học, phân bố sinh thái, thành phần hóa học và tiềm năng dược lý của cây Màng tang.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật (rễ, thân, lá cây Màng tang thu thập tại Phú Thọ do TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định danh), 9 chủng vi sinh vật chỉ thị, hóa chất thí nghiệm và hệ thống máy móc chuyên dụng (máy PCR Applied Biosystems, máy giải trình tự ABI PRISM® 3100, máy SEM). Tác giả trình bày tường minh toàn bộ quy trình thực nghiệm gồm phương pháp khử trùng bề mặt mô thực vật, kỹ thuật phân lập trên 8 môi trường đặc hiệu, phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn khuếch tán giếng thạch, thử nghiệm sinh anthracycline, khảo sát đặc tính hình thái - sinh lý - sinh hóa và quy trình nhân bản, giải trình tự đoạn gen 16S rDNA.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận phản ánh các số liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn: Phân lập thành công 45 chủng xạ khuẩn nội sinh (ký hiệu từ MPT01 đến MPT45). Mật độ xạ khuẩn phân bố không đều giữa các bộ phận cây: rễ chiếm tỷ lệ cao nhất với $44,5%$, tiếp theo là lá ($31,1%$) và thân ($24,4%$). Tỷ lệ phân lập trên các môi trường đạt cao nhất ở môi trường HV và SA ($17,8%$), tiếp đến là STA ($15,5%$), TWYE ($13,3%$), SPA ($13,3%$), TA ($8,9%$), CA và ISP5 ($6,7%$). Phân nhóm màu sắc khuẩn ty khí sinh gồm 4 nhóm: màu vàng chiếm ưu thế ($48,9%$), màu trắng ($28,9%$), màu xám ($11,1%$) và màu xanh ($11,1%$).
• Khả năng sinh kháng sinh và anthracycline: Xác định được 28/45 chủng ($62,2%$) có khả năng kháng ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định. Trong đó, tỷ lệ chủng kháng S. epidermidis là $48,9%$, kháng P. aeruginosa là $44,4%$, kháng B. cereus là $44,4%$, kháng P. vulgaris là $33,3%$, kháng S. enterica là $11,1%$, kháng E. aerogenes là $8,9%$, kháng S. lutea là $6,7%$, kháng E. coli là $4,4%$ và không có chủng nào kháng nấm men C. albicans. Trong 28 chủng có hoạt tính kháng khuẩn, có 20 chủng cho phản ứng dương tính chuyển màu đặc trưng của nhóm anthracycline.
• Nghiên cứu đặc điểm chủng MPT25: Chủng MPT25 được lựa chọn do có phổ kháng khuẩn mạnh trên 5 chủng chỉ thị (S. epidermidis: $22,23\text{ mm}$, P. aeruginosa: $18,2\text{ mm}$, B. cereus: $15,73\text{ mm}$, P. vulgaris: $15,03\text{ mm}$, S. enterica: $12,93\text{ mm}$) và dương tính với thử nghiệm anthracycline. Chủng MPT25 có khuẩn ty khí sinh màu vàng, không sinh sắc tố, chuỗi 20–25 bào tử lượn sóng (RF), bề mặt bào tử trơn nhẵn (Sm). Về sinh lý, chủng đồng hóa được nhiều nguồn carbon (D-Glucose, D-Galactose, D-Maltose, D-Mannitol, D-Fructose, D-Saccharose, D-Sorbitol...) và nguồn nitơ (L-Asparagin, L-Leucin, L-Arginin, L-Valin, L-Threonin...); sinh trưởng thích hợp ở 22–37°C, pH 6–12 và chịu nồng độ muối $\text{NaCl } 0–3%$.
• Định danh phân tử chủng MPT25: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA cho băng đơn kích thước xấp xỉ $1,4\text{ kb}$. Kết quả so sánh trình tự trên GenBank cho thấy gen 16S rDNA của chủng MPT25 đạt độ tương đồng $98%$ với loài Streptomyces cavourensis SY224 (HQ610450.1). Kết hợp các đặc điểm hình thái và sinh hóa, chủng MPT25 được định danh là Streptomyces cavourensis MPT25.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm lược các chỉ số định lượng về số lượng chủng xạ khuẩn phân lập (45 chủng), mức độ phân bố theo mô cây và môi trường nuôi cấy, tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng khuẩn (28 chủng), tỷ lệ sinh anthracycline (20 chủng) và định danh thành công chủng Streptomyces cavourensis MPT25. Đồng thời, đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo về di truyền phân tử và công nghệ lên men.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm tổng hợp

Chỉ tiêu phân tích	Phân loại / Chủng kiểm định	Số lượng / Tỷ lệ ghi nhận
Phân bố theo bộ phận cây	Rễ Lá Thân	$44,5%$ (cao nhất) $31,1%$ $24,4%$ (thấp nhất)
Môi trường phân lập hiệu quả	HV và SA STA TWYE và SPA TA CA và ISP5	$17,8%$ (cao nhất) $15,5%$ $13,3%$ $8,9%$ $6,7%$
Phân nhóm màu khuẩn ty khí sinh	Màu vàng Màu trắng Màu xám Màu xanh	$48,9%$ (22/45 chủng) $28,9%$ (13/45 chủng) $11,1%$ (5/45 chủng) $11,1%$ (5/45 chủng)
Hoạt tính kháng khuẩn tổng số	Kháng $\ge 1$ chủng VSV kiểm định	$62,2%$ (28/45 chủng)
Phổ kháng khuẩn chi tiết	Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Pseudomonas aeruginosa CNLM Bacillus cereus ATCC 11778 Proteus vulgaris CNLM Salmonella enterica ATCC 14028 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Sarcina lutea CNLM Escherichia coli ATCC 11105 Candida albicans ATCC 10231	$48,9%$ (22/45 chủng) $44,4%$ (20/45 chủng) $44,4%$ (20/45 chủng) $33,3%$ (15/45 chủng) $11,1%$ (5/45 chủng) $8,9%$ (4/45 chủng) $6,7%$ (3/45 chủng) $4,4%$ (2/45 chủng) $0%$ (0/45 chủng)
Khả năng sinh Anthracycline	Phản ứng đổi màu theo pH	$71,4%$ (20/28 chủng kháng khuẩn)
Định danh chủng MPT25	Tương đồng 16S rDNA GenBank	$98%$ với Streptomyces cavourensis

Kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục thực hiện các phản ứng PCR khuếch đại các gen chức năng liên quan trực tiếp đến con đường sinh tổng hợp kháng sinh như gen polyketide synthase loại I và loại II (PKS-I, PKS-II) và gen peptide synthetase không ribosome (NRPS).
• Nghiên cứu tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng và các thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy lắc, thời gian nuôi cấy) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hợp chất kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis MPT25.
• Tiến hành tách chiết, tinh sạch và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất kháng sinh sinh ra từ chủng MPT25.

Đóng góp khoa học của đề tài

• Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên về thành phần và mức độ đa dạng của xạ khuẩn nội sinh cư trú trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.)) tại khu vực tỉnh Phú Thọ, Việt Nam.
• Thiết lập bộ sưu tập gồm 45 chủng xạ khuẩn nội sinh, sàng lọc được các chủng có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và tiềm năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline.
• Tuyển chọn và định danh thành công chủng Streptomyces cavourensis MPT25 có hoạt tính ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Staphylococcus epidermidis và Pseudomonas aeruginosa, tạo nguồn vật liệu sinh học phục vụ công tác nghiên cứu phát triển dược phẩm sinh học.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận từ phạm vi nghiên cứu

• Mẫu thực vật Màng tang chỉ mới được thu thập tại một địa điểm duy nhất (tỉnh Phú Thọ) và vào một thời điểm cụ thể (tháng 01/2016), do đó chưa phản ánh được sự biến động của hệ vi sinh vật nội sinh theo mùa, theo độ tuổi của cây cũng như sự khác biệt về điều kiện địa lý - thổ nhưỡng giữa các vùng sinh thái khác nhau.
• Nghiên cứu dừng lại ở mức độ sàng lọc hoạt tính sinh học sơ bộ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và phản ứng màu hóa học đối với nhóm anthracycline, chưa thực hiện phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học chính xác của các hợp chất kháng sinh trong dịch lên men.
• Nghiên cứu định danh vi sinh vật chỉ mới hoàn thiện phân loại đối với 01 chủng tiêu biểu (MPT25), 44 chủng còn lại chưa được giải mã trình tự gen để định danh cụ thể tới mức độ loài.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu cây Màng tang tại các vùng sinh thái khác nhau trên cả nước để đánh giá toàn diện tính đa dạng sinh học của xạ khuẩn nội sinh.
• Triển khai các nghiên cứu sinh học phân tử chuyên sâu nhằm dò tìm và phân tích các cụm gen sinh tổng hợp kháng sinh (PKS-I, PKS-II, NRPS).
• Ứng dụng các phương pháp hóa học phân tích hiện đại (sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR) để chiết tách và giải mã cấu trúc phân tử các hoạt chất kháng sinh do chủng Streptomyces cavourensis MPT25 sinh ra.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo hữu ích cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Hóa dược học, Khoa học Cây trồng và Bảo vệ thực vật.
• Quy trình kỹ thuật có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình khử trùng bề mặt mô thực vật nhiều bước (kết hợp $\text{NaClO}$, $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ và Ethanol) cùng công thức phối hợp kháng sinh ức chế tạp nhiễm (acid nalidixic và nystatin) trên 8 hệ môi trường chọn lọc, là tài liệu tham khảo chuẩn xác cho các nghiên cứu phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây rừng và cây dược liệu.
  • Phương pháp kiểm tra nhanh khả năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline thông qua phản ứng đổi màu theo pH môi trường (kiềm - acid).
  • Khung quy trình đánh giá hình thái học kết hợp giải trình tự gen 16S rDNA bằng cặp mồi $27\text{F}/1429\text{R}$ phục vụ công tác phân loại học vi sinh vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây Màng tang có sự chênh lệch như thế nào?
Trong số 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập được, xạ khuẩn xuất hiện ở tất cả các bộ phận của cây Màng tang nhưng tập trung nhiều nhất ở rễ ($44,5%$, tương ứng 20 chủng), tiếp theo là ở lá ($31,1%$, tương ứng 14 chủng) và thấp nhất ở thân cây ($24,4%$, tương ứng 11 chủng).

2. Khả năng kháng 9 chủng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn phân lập được thể hiện ra sao?
Có 28/45 chủng ($62,2%$) thể hiện hoạt tính kháng ít nhất 1 chủng kiểm định. Tỷ lệ kháng cao nhất ghi nhận trên Staphylococcus epidermidis ($48,9%$), Pseudomonas aeruginosa ($44,4%$) và Bacillus cereus ($44,4%$). Tỷ lệ kháng trung bình và thấp đối với Proteus vulgaris ($33,3%$), Salmonella enterica ($11,1%$), Enterobacter aerogenes ($8,9%$), Sarcina lutea ($6,7%$), Escherichia coli ($4,4%$). Toàn bộ 45 chủng đều không thể hiện hoạt tính kháng nấm men Candida albicans ($0%$).

3. Nguyên lý sàng lọc sơ bộ khả năng sinh kháng sinh nhóm anthracycline của các chủng xạ khuẩn là gì?
Phương pháp dựa vào đặc tính hóa lý của vòng anthraquinone có trong cấu trúc phân tử anthracycline. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trên đĩa thạch YIM38 sau 5 ngày, nhỏ $50\text{ }\mu\text{L NaOH } 2\text{N}$ và $50\text{ }\mu\text{L HCl } 1\text{N}$ vào các giếng thạch. Chủng có khả năng sinh anthracycline sẽ biểu hiện phản ứng chuyển sang màu da cam ở môi trường acid (pH acid) và chuyển sang màu tím ở môi trường kiềm (pH kiềm). Thử nghiệm ghi nhận 20/28 chủng kháng khuẩn cho kết quả dương tính.

4. Chủng xạ khuẩn MPT25 có những đặc điểm hình thái và sinh lý - sinh hóa điển hình nào?
Chủng MPT25 thuộc nhóm xạ khuẩn có khuẩn ty khí sinh màu vàng (trên môi trường ISP1–ISP5), không sinh sắc tố tan, chuỗi mang 20–25 bào tử dạng hơi lượn sóng (RF), bề mặt bào tử hình trụ trơn nhẵn (Sm). Về sinh lý, chủng đồng hóa được hầu hết các nguồn carbon (trừ D-Glucosamine, L-Rhamnose, D-Trehalose) và nguồn nitơ thử nghiệm (trừ L-Tryptophan, L-Cystein); sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 22–37°C, dải pH rộng 6–12 và chịu được nồng độ muối $\text{NaCl}$ từ 0 đến $3%$.

5. Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA đã định danh chủng MPT25 thuộc loài nào?
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của chủng MPT25 cho sản phẩm đặc hiệu kích thước khoảng $1,4\text{ kb}$. Kết quả so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) qua công cụ BLAST cho thấy đoạn gen có độ tương đồng $98%$ với loài Streptomyces cavourensis SY224 (mã số truy cập HQ610450.1). Kết hợp các đặc tính hình thái và sinh hóa, chủng MPT25 được định danh chính thức là Streptomyces cavourensis MPT25.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã phân lập thành công 45 chủng xạ khuẩn nội sinh từ rễ, thân, lá cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.)) thu thập tại tỉnh Phú Thọ trên 8 môi trường đặc hiệu. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học đã sàng lọc được 28 chủng ($62,2%$) có khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định, trong đó có 20 chủng mang tiềm năng sinh tổng hợp kháng sinh chống ung thư nhóm anthracycline. Bằng phương pháp nghiên cứu vi sinh thái kết hợp sinh học phân tử phân tích gen 16S rDNA, đề tài đã tuyển chọn và định danh chính xác chủng Streptomyces cavourensis MPT25 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và phổ ức chế rộng. Công trình là cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị, mở ra triển vọng ứng dụng xạ khuẩn nội sinh từ nguồn dược liệu Việt Nam trong lĩnh vực y dược và công nghệ sinh học lên men.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu, xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu 2. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957) đã phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp.

có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxyporum f. Từ đó, có rất nhiều định nghĩa khác nhau về vi sinh vật (VSV) nội sinh, theo Bacon và White (2000) định nghĩa: “VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [9]. Xạ khuẩn nội sinh ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà phân loại học, sinh thái học, nông học, hóa học và sinh học tiến hóa bởi khả năng sản xuất ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm: kháng sinh, kháng u và kích thích sự tăng trưởng của thực vật - yếu tố quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [21]. Xạ khuẩn cũng đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [3].

Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng. Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ nhóm Prokaryota [51].

Xạ khuẩn nội sinh sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào. Đáng chú ý, trong số gần 300.000 loài thực vật trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của một hoặc nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo ra sự đa dạng sinh học rất lớn [56]. Tuy nhiên, mới chỉ có một vài loài thực vật được nghiên cứu để tìm ra các loài xạ khuẩn mới. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới.

Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 [26]. Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần. Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.

Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [42]. * Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác n 6 nhau nhờ hệ thống enzyme. Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.

Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1].

Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [41]. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV. Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất.

Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ. Ribosome ở VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1]. Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S n 7 rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn.

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [57]. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá tri này là 98%. Phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ.

Trên bề mặt tế bào thực vật chứa rất nhiều vi khuẩn, nấm. Do đó, trong quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh, ta cần xử lý bề mặt mẫu thực vật thật kỹ, tránh bị nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội sinh phân lập. Trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu, đầu tiên ta rửa mẫu dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn, vi nấm bề mặt, để khô, cắt nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt.

Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt n 8 hiệu quả [38]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol và một số chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh.

Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [11]. Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, hai tuần đầu tiên VSV phát triển mạnh là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men,… [12, 32, 36].

Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [27]. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, ngày càng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn thường xâm nhập vào mô thực vật qua lỗ khí, vết thương, lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ phụ và biểu bì bị phân cắt bằng cách hình thành cụm tế bào của chúng [28]. Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên và các vết thương do cơ học hoặc côn trùng.

Chủng xạ khuẩn Streptomyces scabies hình n 9 thành mạng lưới phủ trên bề mặt khoai tây. Sợi nấm xâm nhập vào củ khoai tây thông qua lỗ hổng trên bề mặt cây non và các vết thương khi khoai tây đang ở giai đoạn phát triển mạnh. Sau khi xâm nhập, các tác nhân gây bệnh phát triển trong các khoảng trống của tế bào và phý hủy các tế bào mà chúng tiếp xúc.