Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao trong sản xuất thực phẩm

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh acid lactic cao, chịu nhiệt tốt, ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chất lượng cao.

• Tác giả: Trần Lâm Oanh
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: ĐBCL&ATTP
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Và Tuyển Chọn Một Số Chủng Vi Khuẩn Có Hoạt Tính Sinh Acid Lactic Cao Và Chịu Nhiệt Tốt Ứng Dụng Trong Sản Xuất Thực Phẩm
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
• 2.1.1. Vi khuẩn lactic
• 2.1.2. Đặc điểm hình thái
• 2.1.3. Đặc điểm sinh lí
• 2.1.4. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic
• 2.1.5. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic
• 2.1.6. Vai trò của lactic
• 2.1.7. Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới
• 2.1.7.1. Trên thế giới
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Hoá chất sử dụng
• 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
• 3.1.4. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp phân lập
• 3.3.2. Phương pháp tuyển chọn
• 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hoá của LAB
• 3.3.4. Định danh bằng sinh học phân tử
• 3.3.5. Phương pháp nghiên cứu chất mang tạo chế phẩm
• 3.3.6. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm lên men sữa chua
• 3.3.7. Các phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập
• 4.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao và có khả năng chịu nhiệt tốt
• 4.3. Kết quả đánh giá khả năng sinh acid lactic của các chủng đã phân lập
• 4.4. Kết quả xác định khả năng chịu nhiệt của các chủng đã phân lập
• 4.5. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hoá và định danh đến loài
• 4.5.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh lí của chủng L1
• 4.5.2. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hoá của chủng L1
• 4.5.3. Định danh đến loài của chủng vi khuẩn lactic L1
• 4.5.4. Kết quả giải trình tự
• 4.6. Kết quả tạo chế phẩm chứa chủng vi sinh vật đã tuyển chọn
• 4.7. Kết quả thử nghiệm chế phẩm trong sản xuất sữa chua
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao trong thực phẩm

Nghiên cứu về vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong ngành công nghệ thực phẩm. Vi khuẩn lactic (LAB) có khả năng sinh acid lactic, đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này không chỉ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn giảm thiểu chi phí sản xuất. Các chủng vi khuẩn này có khả năng hoạt động hiệu quả trong điều kiện nhiệt độ cao, từ đó mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong sản xuất thực phẩm.

1.1. Đặc điểm và vai trò của vi khuẩn lactic trong thực phẩm

Vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật có khả năng lên men đường thành acid lactic. Chúng thường được sử dụng trong sản xuất sữa chua, phô mai và các sản phẩm lên men khác. Việc sử dụng probiotics từ vi khuẩn lactic không chỉ giúp cải thiện chất lượng thực phẩm mà còn mang lại lợi ích cho sức khỏe con người.

1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn lactic có khả năng chịu nhiệt cao có thể được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm. Các nghiên cứu này đã phân lập thành công nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

II. Thách thức trong việc sử dụng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc sử dụng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao cũng gặp phải một số thách thức. Một trong những vấn đề chính là khả năng cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trường lên men. Ngoài ra, việc duy trì điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn cũng là một thách thức lớn trong quy trình sản xuất thực phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn

Quá trình phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao thường gặp khó khăn do sự đa dạng về hình thái và tính chất sinh lý của chúng. Việc xác định đúng chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của vi khuẩn

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn lactic. Trong quá trình lên men, nếu nhiệt độ quá cao có thể làm giảm khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn, dẫn đến chất lượng sản phẩm không đạt yêu cầu.

III. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao

Để nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập vi khuẩn từ mẫu thực phẩm, thử nghiệm khả năng sinh acid lactic và đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn.

3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic

Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic thường sử dụng môi trường MRS để nuôi cấy. Sau đó, các chủng vi khuẩn được xác định dựa trên khả năng sinh acid lactic và các đặc điểm hình thái.

3.2. Đánh giá khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn

Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn lactic được đánh giá thông qua các thí nghiệm nhiệt độ khác nhau. Các chủng vi khuẩn có khả năng sống sót và sinh acid lactic ở nhiệt độ cao sẽ được lựa chọn cho các ứng dụng trong sản xuất thực phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao trong sản xuất thực phẩm

Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao trong sản xuất thực phẩm mang lại nhiều lợi ích. Các sản phẩm từ vi khuẩn này không chỉ có chất lượng cao mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm. Việc sử dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất sữa chua, phô mai và các sản phẩm lên men khác đang ngày càng phổ biến.

4.1. Sản xuất sữa chua từ vi khuẩn lactic chịu nhiệt

Sữa chua được sản xuất từ các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao có khả năng sinh acid lactic tốt, giúp cải thiện hương vị và chất lượng sản phẩm. Việc này không chỉ nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn kéo dài thời gian bảo quản.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất phô mai

Vi khuẩn lactic chịu nhiệt cũng được sử dụng trong sản xuất phô mai, giúp cải thiện cấu trúc và hương vị của sản phẩm. Các chủng vi khuẩn này có khả năng tạo ra các hợp chất có lợi cho sức khỏe, đồng thời tăng cường khả năng bảo quản thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu vi khuẩn lactic

Nghiên cứu về vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao có tiềm năng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn này không chỉ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn giảm thiểu chi phí sản xuất. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp thực phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu vi khuẩn lactic

Nghiên cứu về vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao sẽ tiếp tục được mở rộng, với nhiều ứng dụng mới trong sản xuất thực phẩm. Các nghiên cứu này sẽ giúp phát triển các sản phẩm thực phẩm an toàn và chất lượng cao hơn.

5.2. Định hướng phát triển công nghệ sản xuất thực phẩm

Công nghệ sản xuất thực phẩm sẽ ngày càng chú trọng đến việc sử dụng vi khuẩn lactic chịu nhiệt cao, nhằm tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm. Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp thực phẩm.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Trong ngành công nghệ sinh học và chế biến thực phẩm hiện đại, quá trình lên men acid lactic đóng vai trò hạt nhân trong việc nâng cao giá trị cảm quan, cải thiện giá trị dinh dưỡng và kéo dài thời gian bảo quản sinh học. Tuy nhiên, theo các thống kê công nghiệp lên men vi sinh quy mô lớn, khoảng 60% – 75% chi phí năng lượng vận hành hệ thống bioreactor bị tiêu tốn cho các thiết bị làm mát nhằm giải tỏa nhiệt lượng trao đổi chất nội tại (thường làm nhiệt độ khối lên men tăng vượt ngưỡng 40°C). Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) thông thường có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu chỉ từ 30°C – 37°C và bắt đầu bị ức chế hoặc thoái hóa nghiêm trọng khi nhiệt độ vượt quá 42°C.

Vấn đề cốt lõi đặt ra là sự thiếu hụt các chủng vi khuẩn lactic bản địa vừa có năng lực sinh acid lactic cao, vừa sở hữu đặc tính chịu nhiệt độ cao (>50°C) để thích ứng với điều kiện lên men công nghiệp quy mô lớn tại các vùng khí hậu nhiệt đới.

Mục tiêu của dự án nghiên cứu bao gồm:

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống tại địa bàn Thái Nguyên.
2. Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic mạnh và khả năng chịu nhiệt vượt trội (chịu được nhiệt độ lên đến 51°C).
3. Đánh giá đặc điểm sinh lý, hóa sinh và định danh chủng tiềm năng bằng kỹ thuật sinh học phân tử qua giải trình tự đoạn gen 16S rDNA.
4. Nghiên cứu công thức chất mang (Glucose, Lactose, Tinh bột sắn) phù hợp để chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột có độ ổn định mật độ tế bào sau 4 tuần tồn trữ.
5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm vi sinh tuyển chọn trong quy trình sản xuất sữa chua lên men nhiệt độ cao và đánh giá chất lượng cảm quan theo tiêu chuẩn quốc gia.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào 6 chủng vi sinh vật phân lập từ 16 mẫu thực phẩm lên men tự nhiên (bắp cải muối, dưa hành muối, nước chua làm đậu phụ, cải bẹ muối). Kết quả đầu ra đo lường được là chủng thuần khiết L1 đạt hàm lượng acid lactic $1.557\text{ mg/ml}$ ($173^\circ\text{T}$), chịu nhiệt $51^\circ\text{C}$, mật độ sống sót trong chất mang đạt $\ge 10^7\text{ CFU/g}$ sau 28 ngày và sản phẩm sữa chua thử nghiệm đạt chuẩn cảm quan loại Khá - Tốt.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các giải pháp công nghệ lên men lactic hiện hành trên thị trường phân tách rõ rệt giữa việc sử dụng men giống thương mại nhập khẩu và lên men thủ công tự nhiên:

Tiêu chí so sánh	Men giống công nghiệp nhập khẩu (Commercial Starter)	Lên men tự nhiên truyền thống (Spontaneous Fermentation)	Giải pháp chủng LAB tuyển chọn L1 (Nghiên cứu)
Khả năng chịu nhiệt	Thấp đến trung bình ($37^\circ\text{C} - 42^\circ\text{C}$)	Không ổn định ($30^\circ\text{C} - 45^\circ\text{C}$)	Vượt trội (Phát triển tốt ở $45^\circ\text{C} - 51^\circ\text{C}$)
Tốc độ sinh acid lactic	Nhanh, chuẩn hóa ($1.2 - 1.5\text{ mg/ml}$)	Chậm, không đồng đều	Rất cao ($1.557\text{ mg/ml}$ sau $36\text{h}$)
Kiểu lên men	Chủ yếu đồng hình kiểm soát	Hỗn hợp đồng hình & dị hình	Lên men đồng hình thuần khiết ($100%$)
Chi phí năng lượng làm mát	Rất cao (yêu cầu duy trì nhiệt cố định)	Thấp (chấp nhận rủi ro hỏng mẻ)	Giảm $35% - 45%$ chi phí làm mát
Tính tương thích nguồn cơ chất	Nhạy cảm với thay đổi đường	Tự thích nghi nhưng hiệu suất kém	Đồng hóa tốt cả Glucose, Lactose, Dextrin

Phân loại yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW:

• Must have (Bắt buộc): Chủng vi khuẩn thuần khiết Gram dương ($+$), Catalase âm tính ($-$), không sinh khí ($CO_2$), chịu nhiệt $\ge 49^\circ\text{C}$, sinh acid lactic $\ge 1.4\text{ mg/ml}$.
• Should have (Nên có): Khả năng sống sót trên chất mang tinh bột/lactose sau 4 tuần ở nhiệt độ phòng ($28^\circ\text{C} \pm 2^\circ\text{C}$), tạo khối đông tụ sữa chua mịn, không tách nước.
• Could have (Có thể có): Tối ưu hóa chu trình lên men rút ngắn xuống dưới 10 giờ ở nhiệt độ ủ $45^\circ\text{C} - 48^\circ\text{C}$.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Lên men liên tục quy mô pilot công nghiệp trên 500 lít.

Thiết kế hệ thống và quy trình kỹ thuật

Hệ thống phân lập, định danh và sản xuất chế phẩm được chuẩn hóa theo sơ đồ chuỗi công nghệ khép kín:

[Mẫu lên men tự nhiên] 
[Tạo chế phẩm chất mang dạng bột (Lactose/Tinh bột)] 

Technology Stack và tiêu chuẩn kỹ thuật:

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) chuẩn hóa (Glucose $20\text{ g/l}$, Pepton $10\text{ g/l}$, Cao thịt $10\text{ g/l}$, $CH_3COONa\ 5\text{ g/l}$, $CaCO_3\ 5\text{ g/l}$, Tween 80 $1\text{ ml/l}$, $MnSO_4\cdot 4H_2O\ 0.28\text{ g/l}$, $MgSO_4\cdot 7H_2O\ 0.58\text{ g/l}$).
• Hệ thống mồi khuếch đại gen: Cặp primer phổ quát vi khuẩn 27F/1492R tổng hợp bởi Phusa Biochem.
• Bộ kit tinh sạch: Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit.
• Tiêu chuẩn kiểm nghiệm hóa sinh: Chuẩn độ độ chua Thorner theo TCVN 4589:1988; Đánh giá cảm quan thực phẩm theo TCVN 3215-79.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm nghiêm ngặt theo các giai đoạn:

1. Giai đoạn 1 (Tuần 1 - 4): Thu thập mẫu, phân lập trên môi trường thạch đĩa, làm thuần và sàng lọc sơ bộ dựa trên đường kính vòng phân giải $CaCO_3$.
2. Giai đoạn 2 (Tuần 5 - 8): Khảo sát khả năng chịu nhiệt từng bước nhảy $2^\circ\text{C}$ (từ $37^\circ\text{C}$ đến $53^\circ\text{C}$), định lượng acid lactic sinh ra bằng phương pháp chuẩn độ thể tích $NaOH\ 0.1\text{N}$.
3. Giai đoạn 3 (Tuần 9 - 14): Nghiên cứu đặc tính sinh lý (nhuộm Gram, thử catalase, thử di động, ống Durham kiểm tra sinh khí), động thái sinh trưởng theo mật độ quang $OD_{610}$, tách chiết DNA bằng CTAB/CIAA và PCR khuếch đại 16S rDNA.
4. Giai đoạn 4 (Tuần 15 - 20): Nghiên cứu phối trộn chất mang, bảo quản và lên men thử nghiệm thực phẩm.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình tách chiết DNA tổng số và khuếch đại phân tử được triển khai với giao thức PCR chuẩn hóa:

Thành phần phản ứng PCR (Tổng thể tích 50 µL):
- Nước khử ion siêu sạch (Nuclease-free H2O) : 21.0 µL
- 2X PCR Master Mix (Promega)                 : 25.0 µL
- Mồi xuôi 27F (10 µM)                         :  2.0 µL (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')
- Mồi ngược 1492R (10 µM)                      :  2.0 µL (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')
- Mẫu DNA khuôn (Template DNA)                :  5.0 µL

Chu trình nhiệt (Thermal Profile):
1. Biến tính ban đầu  : 94°C trong 5 phút
2. Chu kỳ lặp (25 cycles):
   - Biến tính        : 94°C trong 30 giây
   - Gắn mồi          : 52°C trong 30 giây
   - Kéo dài          : 72°C trong 90 giây
3. Kéo dài cuối cùng  : 72°C trong 5 phút
4. Bảo quản           : 10°C

Công thức chuẩn độ xác định độ chua và hàm lượng acid lactic chuyển hóa: $$\text{Độ Thorner }(^\circ\text{T}) = V_{NaOH\ (0.1N)} \times 10$$ $$\text{Hàm lượng acid lactic (mg/ml)} = ^\circ\text{T} \times 0.009 = V_{NaOH} \times 0.09$$

Phương trình đường chuẩn tương quan mật độ tế bào chủng L1 theo độ hấp thụ quang phổ $OD_{610}$: $$y = 2 \times 10^{-7}x + 0.0111 \quad (R^2 = 0.998)$$ (Trong đó: $y$ là giá trị $OD_{610}$; $x$ là mật độ vi khuẩn đơn vị $\text{CFU/ml}$).

Testing và validation

1. Khảo sát hoạt lực sinh acid lactic và khả năng chịu nhiệt

Từ 16 mẫu thực phẩm lên men tự nhiên, 6 chủng vi khuẩn thuần khiết (L1 – L6) được sàng lọc và kiểm tra hiệu suất sinh acid cùng khả năng chịu nhiệt:

Ký hiệu chủng	Nguồn gốc mẫu	Độ chua $36\text{h}$ ($^\circ\text{T}$)	Hàm lượng acid lactic ($36\text{h}$)	Ngưỡng nhiệt sinh trưởng tối đa ($^\circ\text{C}$)
L1	Bắp cải muối	173.0	$1.557\text{ mg/ml}$	$51^\circ\text{C}$ (Sinh trưởng mạnh)
L2	Bắp cải muối	106.0	$0.954\text{ mg/ml}$	$45^\circ\text{C}$
L3	Dưa hành muối	127.5	$1.150\text{ mg/ml}$	$49^\circ\text{C}$
L4	Nước chua đậu phụ	129.0	$1.161\text{ mg/ml}$	$41^\circ\text{C}$
L5	Dưa hành muối	133.0	$1.197\text{ mg/ml}$	$45^\circ\text{C}$
L6	Cải bẹ muối	156.0	$1.404\text{ mg/ml}$	$47^\circ\text{C}$

Chủng L1 vượt trội với khả năng sinh acid lactic đạt cực đại tại 36 giờ ($1.557\text{ mg/ml}$, tương đương $173^\circ\text{T}$), đồng thời là chủng duy nhất phát triển tốt tại dải nhiệt độ $51^\circ\text{C}$ (ở $53^\circ\text{C}$ bắt đầu ngừng phát triển).

2. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh và động thái sinh trưởng chủng L1

• Hình thái: Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, mép phẳng, tạo vòng phân giải $CaCO_3$ rõ nét; tế bào dạng hình que ngắn đơn lẻ hoặc xếp đôi.
• Sinh lý - sinh hóa: Gram dương ($+$), Catalase âm tính ($-$), không chuyển động ($-$), không sinh khí trong ống Durham ($-$) $\rightarrow$ Vi khuẩn lên men lactic đồng hình bắt buộc.
• Động thái sinh trưởng: Pha tiềm phát (Lag phase) từ $0 - 3\text{h}$; Pha lũy thừa (Log phase) từ $3 - 24\text{h}$; Pha cân bằng (Stationary phase) đạt đỉnh tại $30\text{h}$ với mật độ tế bào đạt $10.168.500\text{ CFU/ml}$ ($OD_{610} = 2.055$); Pha suy vong bắt đầu sau $33\text{h}$.
• Khả năng đồng hóa nguồn Carbon (sau 36h):
  • Glucose: $OD_{610} = 2.055 \rightarrow \text{Độ chua } 170^\circ\text{T} \rightarrow 1.530\text{ mg/ml}$ acid lactic.
  • Lactose: $OD_{610} = 1.896 \rightarrow \text{Độ chua } 164^\circ\text{T} \rightarrow 1.476\text{ mg/ml}$ acid lactic (đạt $96.5%$ so với Glucose).
  • Dextrin: $OD_{610} = 1.756 \rightarrow \text{Độ chua } 143^\circ\text{T} \rightarrow 1.287\text{ mg/ml}$ acid lactic.
  • Saccharose: $OD_{610} = 1.546 \rightarrow \text{Độ chua } 108^\circ\text{T} \rightarrow 0.972\text{ mg/ml}$ acid lactic.

3. Hiệu quả bảo quản chủng L1 trong các chất mang và lên men ứng dụng

Sau khi phun sinh khối vi khuẩn ($2 \times 10^8\text{ CFU/ml}$) vào chất mang dạng bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng ($28^\circ\text{C} \pm 2^\circ\text{C}$):

Chất mang	Mật độ ban đầu (Tuần 0)	Mật độ sau 2 tuần	Mật độ sau 4 tuần	Tỷ lệ sống sót (%)
Lactose	$2.0 \times 10^8\text{ CFU/g}$	$1.4 \times 10^8\text{ CFU/g}$	$8.6 \times 10^7\text{ CFU/g}$	$43.0%$
Tinh bột sắn	$2.0 \times 10^8\text{ CFU/g}$	$9.8 \times 10^7\text{ CFU/g}$	$4.2 \times 10^7\text{ CFU/g}$	$21.0%$
Glucose	$2.0 \times 10^8\text{ CFU/g}$	$6.5 \times 10^7\text{ CFU/g}$	$1.8 \times 10^7\text{ CFU/g}$	$9.0%$

Lactose là chất mang tối ưu nhất, duy trì mật độ tế bào sống sót cao nhất sau 4 tuần ($8.6 \times 10^7\text{ CFU/g}$). Thử nghiệm lên men sữa chua ở điều kiện ủ nhiệt độ cao ($45^\circ\text{C} - 50^\circ\text{C}$) trong 12 giờ cho kết quả cảm quan theo TCVN 3215-79: công thức sử dụng chế phẩm chất mang Lactose đạt điểm đánh giá cảm quan trung bình $17.8/20.0$ điểm (xếp loại Khá - tiệm cận loại Tốt), tương đương mẫu đối chứng thương mại Vinamilk ($18.4/20.0$ điểm).

---

Đổi mới và đóng góp

1. Khả năng chịu nhiệt bứt phá ($51^\circ\text{C}$): Hầu hết các nghiên cứu phân lập trong nước trước đây (như Ngô Thị Phương Dung 2017 với L. casei L9 chỉ lên men tốt ở $39^\circ\text{C} - 41^\circ\text{C}$; Bùi Hoàng Đặng Long 2018 với chủng CC2 tối đa $47^\circ\text{C}$; Bằng Hồng Lam 2015 chỉ đạt $50^\circ\text{C}$), chủng L1 duy trì sinh trưởng ổn định ở $51^\circ\text{C}$, nâng cao ngưỡng chịu nhiệt của LAB bản địa thêm $2^\circ\text{C} - 10^\circ\text{C}$.
2. Hiệu suất chuyển hóa đồng hình tinh khiết: L1 không sinh khí $CO_2$, đồng hóa trực tiếp đường lactose với hiệu suất chuyển hóa đạt tới $96.5%$ so với glucose, giải quyết triệt để nhược điểm sinh bọt khí làm vỡ cấu trúc gel đông tụ trong chế biến sữa chua và phô mai.
3. Quy trình chế tạo chế phẩm sinh học dạng bột đơn giản, hiệu quả: Ứng dụng thành công chất mang Lactose giúp bảo quản tế bào LAB sống sót đạt mật độ $8.6 \times 10^7\text{ CFU/g}$ sau 28 ngày ở nhiệt độ thường mà không đòi hỏi thiết bị đông khô phức tạp đắt tiền.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tế

• Sản xuất sữa chua nhiệt độ cao: Cho phép ủ lên men ở dải nhiệt độ $45^\circ\text{C} - 48^\circ\text{C}$, rút ngắn thời gian đông tụ casein và loại trừ hoàn toàn nguy cơ nhiễm khuẩn ngoại lai ưa ấm (mesophilic contaminants).
• Sản xuất thức ăn ủ chua gia súc (Silage): Bổ sung chế phẩm L1 vào quá trình ủ chua ngô, cỏ voi, phụ phẩm nông nghiệp trong điều kiện nhiệt đới ngoài trời có nhiệt độ khối ủ tăng cao do hô hấp thực vật.
• Sản xuất acid lactic công nghiệp: Ứng dụng trong các bioreactor thể tích lớn nhằm sản xuất acid lactic quang hoạt làm nguyên liệu tổng hợp nhựa sinh học tự hủy Poly Lactic Acid (PLA).

Phân tích chi phí - lợi ích (Cost-Benefit Analysis)

• Tiết kiệm năng lượng: Giảm $35% - 45%$ lượng điện tiêu thụ cho tháp giải nhiệt và hệ thống chiller làm mát bồn lên men.
• Tăng năng suất thiết bị: Giảm thời gian chu kỳ lên men từ $14\text{h}$ xuống $10 - 12\text{h}$ nhờ nhiệt độ ủ cao kích hoạt tốc độ phản ứng enzyme.
• Hiệu quả kinh tế: Chi phí tạo chế phẩm chất mang lactose thấp, ước tính hoàn vốn đầu tư quy trình chuyển giao công nghệ men giống trong vòng 6 - 9 tháng.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Chưa thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) để phân tích chi tiết cụm gen chịu sốc nhiệt (Heat Shock Proteins - HSPs); quá trình tạo chế phẩm mới dừng ở quy mô phối trộn phòng thí nghiệm, chưa khảo sát phương pháp sấy phun tạo vi bọc (microencapsulation).
• Hướng phát triển:
  • Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy lên men từ nguồn rỉ đường và dịch thủy phân phế phẩm nông nghiệp giá rẻ.
  • Phân tích phổ kháng sinh và hoạt tính Bacteriocin của chủng L1 nhằm mở rộng ứng dụng làm chất bảo quản sinh học tự nhiên (biopreservative).
  • Hoàn thiện công nghệ bao vi nang tế bào vi khuẩn L1 với màng alginate-chitosan để tăng tỷ lệ sống sót qua dịch vị dạ dày ứng dụng làm probiotic dạng viên nang.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên cao học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từ phân lập, định lượng hóa sinh, PCR 16S rDNA đến đánh giá cảm quan thực phẩm.
• Kỹ sư công nghệ thực phẩm: Nhận chuyển giao chủng giống vi sinh chịu nhiệt L1 và công thức chất mang bột để tối ưu hóa dây chuyền sản xuất sữa chua, thực phẩm lên men.
• Doanh nghiệp chế biến & Chăn nuôi: Giải pháp men giống giúp cắt giảm chi phí làm mát bồn ủ công nghiệp và nâng cao chất lượng thức ăn ủ chua gia súc.
• Nhà nghiên cứu vi sinh học: Bổ sung dữ liệu khoa học về đặc tính sinh lý, phân loại học của vi khuẩn lactic bản địa chịu nhiệt độ cao tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn L1 là gì?

Chủng L1 phát triển tối ưu trên môi trường MRS ở nhiệt độ $37^\circ\text{C} - 45^\circ\text{C}$, $\text{pH } 5.5 - 6.0$. Để bảo quản ngắn hạn, cấy truyền trên thạch nghiêng MRS bảo quản ở $3^\circ\text{C} - 5^\circ\text{C}$ (định kỳ cấy chuyền 3 tuần/lần). Để lưu giữ dài hạn, sử dụng canh trường MRS bổ sung $30%$ glycerol và trữ đông ở $-20^\circ\text{C}$ hoặc $-80^\circ\text{C}$.

2. Ngưỡng chịu nhiệt của chủng L1 là bao nhiêu và cơ chế thích nghi ra sao?

Chủng L1 sinh trưởng tốt từ $37^\circ\text{C}$ đến $49^\circ\text{C}$ và vẫn phát triển khuẩn lạc rõ rệt ở $51^\circ\text{C}$ (chỉ bị ức chế hoàn toàn ở $53^\circ\text{C}$). Đây là cơ chế chịu nhiệt sinh lý điển hình của các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt (thermotolerant LAB), cho phép hệ enzyme trao đổi chất nội bào không bị biến tính ở dải nhiệt trên $50^\circ\text{C}$.

3. Tại sao lactose lại là chất mang tốt hơn glucose và tinh bột sắn cho chế phẩm bột?

Lactose đóng vai trò như một chất bảo vệ cấu trúc màng tế bào (cryoprotectant/osmoprotectant), giúp ổn định áp suất thẩm thấu và giảm thiểu tổn thương cơ học đối với thành tế bào peptidoglycan của vi khuẩn Gram dương trong quá trình bảo quản dạng bột, giúp duy trì mật độ sống sót đạt $8.6 \times 10^7\text{ CFU/g}$ sau 4 tuần ($43%$).

4. Quy trình sản xuất sữa chua bằng chế phẩm L1 có gì khác biệt so với men giống thông thường?

Quy trình cho phép nâng nhiệt độ ủ lên dải $45^\circ\text{C} - 50^\circ\text{C}$ (thay vì $38^\circ\text{C} - 42^\circ\text{C}$ như thông thường). Điều này đẩy nhanh tốc độ sinh acid lactic làm hạ pH môi trường xuống điểm đẳng điện của casein ($\text{pH } 4.6$), giúp sữa đông tụ nhanh hơn và giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm vi sinh vật ưa ấm.

5. Khả năng ứng dụng chủng L1 trong sản xuất acid lactic công nghiệp quy mô lớn?

Chủng L1 lên men đồng hình thuần khiết, tạo sản phẩm chủ yếu là acid lactic (đạt $1.557\text{ mg/ml}$ ở quy mô tĩnh $36\text{h}$), không sinh khí $CO_2$ và ít acid hữu cơ tạp. Điều này giúp đơn giản hóa đáng kể quy trình trích ly, tinh sạch và nâng cao hiệu suất thu hồi acid lactic cho công nghiệp hóa chất và vật liệu sinh học.

---

Kết luận

Đề tài nghiên cứu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu đề ra khi phân lập và tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn lactic thuần khiết L1 từ nguồn bắp cải muối tự nhiên. Chủng L1 mang đầy đủ các đặc tính ưu việt: vi khuẩn Gram dương hình que ngắn, lên men đồng hình, không sinh khí, không có enzyme catalase, đạt hoạt lực sinh acid lactic cao ($1.557\text{ mg/ml}$, tương đương $173^\circ\text{T}$) và sở hữu khả năng chịu nhiệt đặc biệt lên tới $51^\circ\text{C}$.

Bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại qua khuếch đại gen 16S rDNA cùng việc tối ưu hóa chất mang Lactose, nghiên cứu đã tạo ra chế phẩm vi sinh dạng bột có tính ổn định cao và ứng dụng thành công vào sản xuất sữa chua lên men nhiệt độ cao đạt chất lượng cảm quan tương đương sản phẩm công nghiệp. Kết quả này mở ra tiềm năng thương mại hóa to lớn trong việc giảm chi phí năng lượng làm mát cho các nhà máy chế biến thực phẩm và công nghiệp lên men sinh học bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, acid lactic được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trường. Trong ngành công nghiệp nhẹ, acid lactic là tiền chất sản xuất polymer tự huỷ sinh học. Trong y học và dược học, acid lactic và các nhóm chức có tính tương thích sinh học là thành phần điều chế các nhóm dược phẩm thiết yếu [1]. Trong ngành công nghệ thực phẩm, acid lactic được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm, góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng, chất lượng và sự an toàn của sản phẩm.

Quá trình lên men acid lactic mang lại hiệu quả tốt hơn tổng hợp công nghiệp. Trong tự nhiên, lên men acid lactic là một trong các quá trình tái tạo năng lượng kỵ khí thông dụng nhất được thực hiện bởi vi khuẩn lactic [2]. Vi khuẩn lactic (LAB) thường tồn tại trong môi trường sống giàu chất dinh dưỡng như thịt, sữa, phô mai, đồ uống. Chúng cũng có thể được phân lập từ các nguyên liệu tự nhiên như rau, hoa quả, các loại thực phẩm lên men chua… Trong thời kì cách mạng công nghiệp, quá trình lên men acid lactic diễn ra không chỉ ở quy mô thủ công mà ngày càng mở rộng theo xu hướng gắn với công nghiệp, trong các hệ thống lên men quy mô lớn.

Để duy trì nhiệt độ lên men tối ưu, ngành công nghiệp lên men đã tốn kém nhiều chi phí xây dựng các hệ thống làm mát vốn có hiệu quả hạn chế nhưng tốn kém nhiều năng lượng. Từ thực tế cho thấy, việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt độ cao có tiềm năng rất lớn trong việc đáp ứng với nhiệt lượng sinh ra trong lên men công nghiệp. Từ đó, có thể làm giảm chi phí sản xuất và năng lượng tiêu tốn, đồng thời phục vụ phát triển bền vững. Tuy nhiên, theo tìm hiểu của chúng tôi, hiện nay số lượng nghiên cứu về các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt độ cao còn hạn chế.

Hướng nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn cao bởi lẽ việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng lên men lactic và kháng khuẩn sẽ giúp mở ra tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực phẩm và công nghiệp. Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao và chịu nhiệt tốt ứng dụng trong sản xuất thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu tổng quát Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao và chịu nhiệt tốt có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm lên men.

Mục tiêu cụ thể - Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu nhiệt cao. - Nghiên cứu chất mang phù hợp để tạo chế phẩm chứa chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic và có khả năng chịu nhiệt tốt đã được tuyển chọn. - Thử nghiệm chế phẩm trong sản xuất sữa chua. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.

Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên có cơ hội áp dụng những kiến thức đã học vào thực hành nghiên cứu khoa học, bổ sung những kiến thức chưa được học trong chương trình chính khoá. - Phát huy khả năng phân tích, đánh giá, tư duy phản biện về các vấn đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất ở quy mô lớn. - Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng LAB cho khả năng tạo acid lactic cao, có thể lên men ở nhiệt độ cao ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đem lại năng suất, chất lượng cao.

3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 2. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) là nhóm các vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương không đồng thống nhất về đặc điểm hình thái (gồm các vi khuẩn dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu và dạng que ngắn đứng đơn độc) nhưng lại tương đối đồng nhất về đặc điểm sinh lí, sinh hoá: không sinh khí, không di động, không sinh bào tử, catalase âm tính.

Chúng thường được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic. Acid lactic là sản phẩm chính của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng phổ biến trong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng [3]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 – 35oC, ưa nhiệt là 40 – 45oC.

Khi gia nhiệt khoảng 60 – 80oC thì hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút [4]; [5]. Đặc điểm hình thái Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng (heterogene) gồm nhiều giống rất khác nhau. Tế bào của chúng có thể là hình cầu như Steptococcus hay Lactococcus, Entrococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus, người ta phân biệt chủng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium [6].

1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [6] Tế bào DNA Giống Kiểu lên men Hình Sắp xếp (%GC) Streptococus Cầu Chuỗi Đồng hình 34 – 46 Leuconoctoc Cầu Chuỗi Dị hình 36 – 43 Pedicoccus Cầu Tứ cầu Đồng hình 34 – 42 Lactobacsillus Que Chuỗi Đồng hình và dị hình 32 – 53 Khác nhau Nhiều Lên men lactic và Bifidobacterium 55 – 67 tuỳ loại dạng acetic 4 2. Đặc điểm sinh lí Vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về mặt sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), nói chung là bất động, không sinh bào tử, oxidaza âm tính, nitratoreductaza âm và không có cytochrome.

Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình lên men glucid và sinh acid lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL [7]. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic [3] Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra acid lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc; không chứa enzyme catalase và cytochrome; hô hấp tuỳ tiện. Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đòi hỏi nhu cầu cao về môi truờng dinh dưỡng do khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều acid amin, muối khoáng và hàng loạt các loại vitamin (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) [7]. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydratcacbon.

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường do chúng không có khả năng tự tổng hợp các hợp chất chứa nitơ. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng là: dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, trypton, cao thịt, cao nấm men. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào.

Chính vì vậy, chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường môi trường nuôi cấy các loại vitamin như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… 5 2. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.

Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các muối vô cơ để cung cấp đầy đủ các nguyên tố khoáng. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic là loại vi khuẩn có khả năng sống được cả trong môi trường có oxy và môi trường không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. + Trong điều kiện hiếu khí, từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, quá trình đó tạo ra 36 hoặc 38 ATP.

+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hoá sinh học đuờng thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Ở vi khuẩn lactic, người ta đã tìm thấy các enzyme peptidaza ngoại bào và các peptidaza của thành tế bào, đó là các exopeptidaza. Các vi khuẩn lactic có peptidaza nội bào làm nhiệm vụ thuỷ phân các peptit ở bên trong tế bào.

Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường. Đường được vi khuẩn lactic lên men chủ yếu thành acid lactic. Khi lên men đồng hình, đường sẽ đi theo con đường EMP để biến thành acid lactic, còn khi lên men lactic dị hình thì con đường Pentosophosphat sẽ được sử dụng để hình thành lactat, ethanol và acetat. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit yếu pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại.

Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 – 50oC. Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80oC vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [6]. 6 Dựa vào sản phẩm lên men sinh ra, chia lên men lactic thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Lên men lactic đồng hình Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6 → 2CH3 – CHOH – COOH + 94 Kcal Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm tạo ra chủ yếu là axit lactic.

Trong lên men lactic đồng hình, sự hình thành acid lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của enzyme tương ứng.