Đặt vấn đề Ngày nay, acid lactic được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trường. Trong ngành công nghiệp nhẹ, acid lactic là tiền chất sản xuất polymer tự huỷ sinh học. Trong y học và dược học, acid lactic và các nhóm chức có tính tương thích sinh học là thành phần điều chế các nhóm dược phẩm thiết yếu [1]. Trong ngành công nghệ thực phẩm, acid lactic được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm, góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng, chất lượng và sự an toàn của sản phẩm.
Quá trình lên men acid lactic mang lại hiệu quả tốt hơn tổng hợp công nghiệp. Trong tự nhiên, lên men acid lactic là một trong các quá trình tái tạo năng lượng kỵ khí thông dụng nhất được thực hiện bởi vi khuẩn lactic [2]. Vi khuẩn lactic (LAB) thường tồn tại trong môi trường sống giàu chất dinh dưỡng như thịt, sữa, phô mai, đồ uống. Chúng cũng có thể được phân lập từ các nguyên liệu tự nhiên như rau, hoa quả, các loại thực phẩm lên men chua… Trong thời kì cách mạng công nghiệp, quá trình lên men acid lactic diễn ra không chỉ ở quy mô thủ công mà ngày càng mở rộng theo xu hướng gắn với công nghiệp, trong các hệ thống lên men quy mô lớn.
Để duy trì nhiệt độ lên men tối ưu, ngành công nghiệp lên men đã tốn kém nhiều chi phí xây dựng các hệ thống làm mát vốn có hiệu quả hạn chế nhưng tốn kém nhiều năng lượng. Từ thực tế cho thấy, việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt độ cao có tiềm năng rất lớn trong việc đáp ứng với nhiệt lượng sinh ra trong lên men công nghiệp. Từ đó, có thể làm giảm chi phí sản xuất và năng lượng tiêu tốn, đồng thời phục vụ phát triển bền vững. Tuy nhiên, theo tìm hiểu của chúng tôi, hiện nay số lượng nghiên cứu về các chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt độ cao còn hạn chế.
Hướng nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn cao bởi lẽ việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng lên men lactic và kháng khuẩn sẽ giúp mở ra tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực phẩm và công nghiệp. Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao và chịu nhiệt tốt ứng dụng trong sản xuất thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu tổng quát Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic cao và chịu nhiệt tốt có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm lên men.
Mục tiêu cụ thể - Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu nhiệt cao. - Nghiên cứu chất mang phù hợp để tạo chế phẩm chứa chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh acid lactic và có khả năng chịu nhiệt tốt đã được tuyển chọn. - Thử nghiệm chế phẩm trong sản xuất sữa chua. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.
Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên có cơ hội áp dụng những kiến thức đã học vào thực hành nghiên cứu khoa học, bổ sung những kiến thức chưa được học trong chương trình chính khoá. - Phát huy khả năng phân tích, đánh giá, tư duy phản biện về các vấn đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất ở quy mô lớn. - Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng LAB cho khả năng tạo acid lactic cao, có thể lên men ở nhiệt độ cao ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đem lại năng suất, chất lượng cao.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 2. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) là nhóm các vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương không đồng thống nhất về đặc điểm hình thái (gồm các vi khuẩn dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu và dạng que ngắn đứng đơn độc) nhưng lại tương đối đồng nhất về đặc điểm sinh lí, sinh hoá: không sinh khí, không di động, không sinh bào tử, catalase âm tính.
Chúng thường được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic. Acid lactic là sản phẩm chính của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng phổ biến trong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng [3]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 – 35oC, ưa nhiệt là 40 – 45oC.
Khi gia nhiệt khoảng 60 – 80oC thì hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút [4]; [5]. Đặc điểm hình thái Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng (heterogene) gồm nhiều giống rất khác nhau. Tế bào của chúng có thể là hình cầu như Steptococcus hay Lactococcus, Entrococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus, người ta phân biệt chủng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium [6].
1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [6] Tế bào DNA Giống Kiểu lên men Hình Sắp xếp (%GC) Streptococus Cầu Chuỗi Đồng hình 34 – 46 Leuconoctoc Cầu Chuỗi Dị hình 36 – 43 Pedicoccus Cầu Tứ cầu Đồng hình 34 – 42 Lactobacsillus Que Chuỗi Đồng hình và dị hình 32 – 53 Khác nhau Nhiều Lên men lactic và Bifidobacterium 55 – 67 tuỳ loại dạng acetic 4 2. Đặc điểm sinh lí Vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về mặt sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), nói chung là bất động, không sinh bào tử, oxidaza âm tính, nitratoreductaza âm và không có cytochrome.
Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình lên men glucid và sinh acid lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL [7]. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic [3] Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra acid lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc; không chứa enzyme catalase và cytochrome; hô hấp tuỳ tiện. Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn đòi hỏi nhu cầu cao về môi truờng dinh dưỡng do khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều acid amin, muối khoáng và hàng loạt các loại vitamin (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) [7]. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydratcacbon.
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường do chúng không có khả năng tự tổng hợp các hợp chất chứa nitơ. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng là: dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, trypton, cao thịt, cao nấm men. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào.
Chính vì vậy, chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường môi trường nuôi cấy các loại vitamin như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… 5 2. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các muối vô cơ để cung cấp đầy đủ các nguyên tố khoáng. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic là loại vi khuẩn có khả năng sống được cả trong môi trường có oxy và môi trường không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. + Trong điều kiện hiếu khí, từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, quá trình đó tạo ra 36 hoặc 38 ATP.
+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hoá sinh học đuờng thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Ở vi khuẩn lactic, người ta đã tìm thấy các enzyme peptidaza ngoại bào và các peptidaza của thành tế bào, đó là các exopeptidaza. Các vi khuẩn lactic có peptidaza nội bào làm nhiệm vụ thuỷ phân các peptit ở bên trong tế bào.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường. Đường được vi khuẩn lactic lên men chủ yếu thành acid lactic. Khi lên men đồng hình, đường sẽ đi theo con đường EMP để biến thành acid lactic, còn khi lên men lactic dị hình thì con đường Pentosophosphat sẽ được sử dụng để hình thành lactat, ethanol và acetat. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit yếu pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại.
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 – 50oC. Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80oC vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [6]. 6 Dựa vào sản phẩm lên men sinh ra, chia lên men lactic thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Lên men lactic đồng hình Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6 → 2CH3 – CHOH – COOH + 94 Kcal Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm tạo ra chủ yếu là axit lactic.
Trong lên men lactic đồng hình, sự hình thành acid lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của enzyme tương ứng.