Luận án tiến sĩ nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm panulirus sp phục vụ nuôi trồng thủy sản

Luận án tiến sĩ nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm Panulirus sp, ứng dụng hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản bền vững.

• Tác giả: Trương Phước Thiên Hoàng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Phú Hòa
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) phục vụ nuôi trồng thủy sản
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• Trang tựa
• Lời cam đoan
• Danh sách chữ viết tắt
• Danh sách các bảng
• Danh sách các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan tình hình nuôi tôm hùm lồng bè
• 1.2. Hiện trạng ô nhiễm môi trường nước vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài
• 1.3. Vi sinh vật trong môi trường nước mặn
• 1.4. Sơ đồ chu trình chuyển hóa nitơ trong hệ sinh thái biển
• 1.5. Các quá trình chuyển hoá nitơ và vai trò các nhóm vi khuẩn tham gia chuyển hóa
• 1.6. Đặc điểm của các nhóm vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa Nitơ
• 1.6.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
• 1.6.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Rhodococcus
• 1.6.3. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Pseudomonas
• 1.6.4. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Stenotrophomonas
• 1.6.5. Đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ khác
• 1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn
• 1.7.1. Nguồn khoáng và vitamin
• 1.7.2. Thời gian nuôi cấy
• 1.7.3. Động học của quá trình vi sinh vật
• 1.8. Sơ lược về ma trận Plackett - Burman và Box - Behnken
• 1.8.1. Giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
• 1.8.2. Ma trận Plackett - Burman
• 1.8.3. Ma trận Box-Behnken (BBD)
• 1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng
• 1.9.1. Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen)
• 1.9.2. Nitrite và Nitrate
• 1.10. Tình hình nghiên cứu ứng dụng của vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản
• 1.10.1. Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trong nước
• 1.10.2. Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp thu mẫu bùn đáy
• 2.2.1. Vị trí thu mẫu
• 2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý của mẫu bùn
• 2.3. Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm
• 2.3.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp.
• 2.3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus sp.
• 2.3.1.2. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn Bacillus sp.
• 2.3.1.3. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn Bacillus sp.
• 2.3.2. Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB)
• 2.3.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (phụ lục 1)
• 2.3.2.2. Các bước phân lập nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia
• 2.3.2.3. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn AOB
• 2.3.2.4. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn AOB
• 2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB)
• 2.3.3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite
• 2.3.3.2. Các bước phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB)
• 2.3.3.3. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn NOB
• 2.3.3.4. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn NOB
• 2.3.4. Khảo sát quá trình chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
• 2.3.5. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
• 2.4. Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và dạng bột
• 2.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men tạo chế phẩm dạng lỏng của các chủng vi khuẩn
• 2.4.1.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn
• 2.4.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm dạng lỏng
• 2.4.1.3. Tối ưu hóa các thành phần môi trường nhân sinh khối của 3 chủng vi khuẩn bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RMS)
• 2.4.2. Chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
• 2.4.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn
• 2.4.2.2. Bảo quản chế phẩm vi sinh dạng bột
• 2.5. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản
• 2.5.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở qui mô phòng thí nghiệm
• 2.5.2. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống ở qui mô bể xi-măng 1m3
• 2.5.3. Chỉ tiêu đánh giá
• 2.5.4. Xử lý thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm
• 3.1.1. Các chỉ tiêu môi trường trong mẫu bùn được thu ở Vùng Vịnh Xuân Đài
• 3.1.2. Nhóm vi khuẩn Bacillus sp.
• 3.1.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus chuyển hóa ammonia
• 3.1.2.2. Chọn lọc khả năng xử lý ammonia của các vi khuẩn phân lập được
• 3.1.2.3. Kết quả định danh sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus sp.
• 3.1.2.4. Kết quả định danh sinh học phân tử các chủng vi khuẩn Bacillus sp.
• 3.1.2.5. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa ammonia của các chủng vi khuẩn Bacillus sp.
• 3.1.3. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB) từ mẫu bùn
• 3.1.3.1. Kết quả xác định vi khuẩn chuyển hóa ammonia có trong mẫu bùn
• 3.1.3.2. Kết quả đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.1.3.3. Kết quả xác định khả năng chuyển hóa NH3 của các chủng vi khuẩn
• 3.1.3.4. Kết quả định danh sinh hóa các chủng vi khuẩn
• 3.1.3.5. Kết quả định danh bằng giải trình tự vùng 16S – rRNA
• 3.1.3.6. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa ammonia của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.1.4. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite từ mẫu bùn
• 3.1.4.1. Kết quả xác định vi khuẩn chuyển hóa nitrite có trong mẫu bùn
• 3.1.4.2. Kết quả đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.1.4.3. Kết quả xác định khả năng chuyển hóa NO2- của các chủng vi khuẩn
• 3.1.4.4. Kết quả định danh sinh hóa các chủng vi khuẩn
• 3.1.4.5. Định danh vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA
• 3.1.4.6. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.1.5. Khảo sát khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và khả năng chịu mặn của các nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus, AOB và NOB
• 3.1.5.1. Khảo sát khả năng chuyển hóa NO2-, NO3- và khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn AOB
• 3.1.5.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa NH4- và NO3- và khả năng chịu mặn của nhóm vi khuẩn NOB
• 3.2. Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và bột
• 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men tạo chế phẩm dạng lỏng của các chủng vi khuẩn
• 3.2.1.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn
• 3.2.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm dạng lỏng
• 3.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn
• 3.2.1.4. Tối ưu hóa các thành phần môi trường nhân sinh khối của 3 chủng vi khuẩn bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RMS)
• 3.2.2. Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
• 3.2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn
• 3.2.2.2. Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng bột
• 3.3. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản
• 3.3.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng (không có tôm) ở qui mô phòng thí nghiệm
• 3.3.1.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn
• 3.3.1.2. Đánh giá mật độ vi sinh vật khi bổ sung chế phẩm vi sinh
• 3.3.2. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong bể nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống ở qui mô bể xi-măng 1m3
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) là một lĩnh vực quan trọng trong nuôi trồng thủy sản. Việc tìm hiểu về các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ giúp cải thiện chất lượng môi trường nuôi tôm, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất. Nghiên cứu này được thực hiện tại Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên, nơi có điều kiện nuôi tôm hùm phát triển mạnh mẽ. Mục tiêu chính là phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite, từ đó ứng dụng vào thực tiễn nuôi trồng thủy sản.

II. Phân lập và định danh vi khuẩn

Quá trình phân lập và định danh các chủng vi khuẩn từ mẫu bùn đáy được thực hiện trong 12 tháng. Các mẫu bùn được thu thập từ các lồng bè nuôi tôm hùm. Kết quả cho thấy có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ, trong đó nổi bật là Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, và Rhodococcus rhodochrous T9. Các chủng này được xác định thông qua phương pháp sinh hóa và phân tích gen 16S rRNA. Việc xác định chính xác các chủng vi khuẩn này là rất quan trọng để phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ cho quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản.

III. Tạo chế phẩm vi sinh

Nghiên cứu đã phát triển môi trường lên men phù hợp cho các chủng vi khuẩn. Môi trường này được tối ưu hóa để đạt được mật độ vi khuẩn cao nhất. Kết quả cho thấy, chế phẩm vi sinh dạng bột có mật độ vi khuẩn đạt 10^9 CFU/g, được bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4-8°C cho hiệu quả tốt nhất. Việc tạo ra chế phẩm vi sinh này không chỉ giúp xử lý môi trường mà còn nâng cao sức khỏe cho tôm hùm trong quá trình nuôi trồng. Chế phẩm này có thể được sử dụng định kỳ để kiểm soát hàm lượng TAN, NO2 và NO3 trong nước nuôi.

IV. Đánh giá hiệu quả xử lý môi trường

Kết quả đánh giá cho thấy chế phẩm vi sinh có khả năng kiểm soát tốt hàm lượng nitơ trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng. Sử dụng chế phẩm với tỷ lệ 0,5% và mật độ 10^8 CFU/g cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm thiểu ô nhiễm nitơ. Điều này không chỉ giúp cải thiện chất lượng nước mà còn tăng cường sức khỏe cho tôm hùm, từ đó nâng cao năng suất nuôi trồng. Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển bền vững ngành nuôi tôm hùm.

V. Kết luận và khuyến nghị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ứng dụng vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nuôi trồng thủy sản có thể mang lại nhiều lợi ích. Các chủng vi khuẩn được phân lập và định danh có khả năng chuyển hóa nitơ hiệu quả, góp phần cải thiện chất lượng môi trường nuôi tôm hùm. Khuyến nghị cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các chủng vi khuẩn khác và mở rộng ứng dụng chế phẩm vi sinh trong các mô hình nuôi trồng khác nhau để tối ưu hóa hiệu quả sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghề nuôi tôm hùm lồng bè (Panulirus sp.) tại khu vực ven biển miền Trung Việt Nam, đặc biệt là tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa, đã chứng kiến sự tăng trưởng vượt bậc với tổng số lượng lồng nuôi năm 2019 ước đạt 185.166 lồng, chiếm 97,8% số lượng lồng và đóng góp 95% sản lượng tôm hùm cả nước (tương đương 2.273 tấn). Tuy nhiên, phương thức nuôi phụ thuộc hoàn toàn vào thức ăn tươi sống (cá tạp, giáp xác, động vật thân mềm) với hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) rất cao, dao động từ $26,00 \pm 1,41$ đến $26,60 \pm 5,02$ (Lại Văn Hùng và Phạm Đức Hùng, 2010). Thực trạng này dẫn đến việc phát thải khoảng 15 kg chất thải rắn cho mỗi kg tôm hùm thương phẩm tạo ra; trong đó chất thải chứa đến hơn 45% nitơ và 22% hợp chất hữu cơ, gây nên tình trạng phú dưỡng nghiêm trọng, tích tụ khí độc ammonia ($\text{NH}_3/\text{NH}_4^+$), nitrite ($\text{NO}_2^-$) và hydrogen sulfide ($\text{H}_2\text{S}$) ở nền đáy biển Vịnh Xuân Đài (Hoàng Thị Mỹ Hương và ctv, 2018).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở việc hầu hết các chế phẩm sinh học thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ vi sinh vật nước ngọt hoặc phân lập từ môi trường đất liền, dẫn đến hiệu quả xử lý giảm sút nghiêm trọng khi đưa vào môi trường nước mặn có áp suất thẩm thấu cao và tải lượng hữu cơ phân tầng phức tạp dưới đáy biển. Do đó, luận án của nghiên cứu sinh Trương Phước Thiên Hoàng (2022) tại Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tiên phong giải quyết bài toán này thông qua ba câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học tương ứng:

• RQ1: Hệ vi sinh vật nền đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài có chứa các chủng vi khuẩn bản địa vừa có hoạt tính chuyển hóa nitơ cao vừa chịu được độ mặn tự nhiên của nước biển hay không? -> H1: Tồn tại các chủng vi khuẩn chịu mặn thuộc nhóm dị dưỡng và tự dưỡng có khả năng chuyển hóa triệt để ammonia và nitrite trong bùn đáy biển.
• RQ2: Làm thế nào để thiết lập công thức môi trường lên men tối ưu nhằm nhân sinh khối quy mô lớn với mật độ cực đại cho các chủng tuyển chọn? -> H2: Ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp ma trận Plackett-Burman và Box-Behnken sẽ xác định chính xác tương tác giữa các nguồn dinh dưỡng để tối đa hóa sinh khối.
• RQ3: Chế phẩm vi sinh dạng bột phối trộn từ các chủng bản địa có duy trì được hoạt tính sinh học trong thời gian bảo quản dài hạn và kiểm soát hiệu quả các hợp chất nitơ độc hại trong môi trường ương nuôi thực nghiệm không? -> H3: Chế phẩm sinh học đa chủng dạng bột đạt mật độ $\ge 10^9\text{ CFU/g}$ duy trì độ sống sót ổn định và xử lý triệt để TAN, $\text{NO}_2^-$ trong bể nuôi thủy sản.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp toàn diện chu trình sinh địa hóa Nitơ trong thủy vực biển (Boyd, 1998; Winogradsky, 1889), động học lên men vi sinh vật và lý thuyết tối ưu hóa thực nghiệm đa biến (Box & Behnken, 1960). Phạm vi nghiên cứu bao gồm 132 mẫu bùn đáy thu thập định kỳ 12 tháng liên tục (từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017) tại 11 lồng nuôi (lồng treo và lồng chìm) ở Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên, phục vụ mục tiêu chiến lược phát triển ngành nuôi tôm bền vững theo Quyết định 4431/QĐ-BNN-TCTS của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu chuyển hóa nitơ trong môi trường thủy sản khởi nguồn từ các quy luật kinh điển về chu trình sinh hóa của Winogradsky (1889), thiết lập nền tảng về nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng oxy hóa ammonia (Ammonia-Oxidizing Bacteria - AOB) như Nitrosomonas, Nitrosococcus và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (Nitrite-Oxidizing Bacteria - NOB) như Nitrobacter, Nitrospira (Watson và ctv, 1989; Bock & Koops, 1992). Trong nhiều thập kỷ, quan điểm thống trị cho rằng quá trình nitrate hóa trong hệ thống nuôi trồng thủy sản phụ thuộc chủ yếu vào các chủng vi khuẩn tự dưỡng bắt buộc (Boyd, 1998). Tuy nhiên, trường phái nghiên cứu hiện đại đã phát hiện và chứng minh nhóm vi khuẩn dị dưỡng (heterotrophic nitrifiers) và phản nitrate hóa hiếu khí (aerobic denitrifiers) có tốc độ tăng trưởng sinh khối nhanh hơn gấp nhiều lần và sở hữu khả năng chuyển hóa nitơ linh hoạt trong điều kiện tải lượng hữu cơ cao (Robertson & Kuenen, 1983; Van Niel & Allen, 1952).

Tiêu chí so sánh	Nghiên cứu của Grommen et al. (2002, 2004)	Nghiên cứu của Zhang et al. (2011)	Luận án Trương Phước Thiên Hoàng (2022)
Đối tượng vi sinh	Hỗn hợp Nitrosomonas & Nitrobacter (Chế phẩm ABIL)	Chủng đơn lẻ Pseudomonas stutzeri YZN-001	Tổ hợp 3 chủng: B. licheniformis B85, P. stutzeri KL15, R. rhodochrous T9
Nguồn gốc phân lập	Nước ngọt / Nước lợ nhân tạo	Môi trường xử lý nước thải công nghiệp	Nền đáy trầm tích biển tự nhiên (Vịnh Xuân Đài, Phú Yên)
Cơ chế chuyển hóa	Tự dưỡng hóa năng truyền thống	Dị dưỡng khử nitrat và oxy hóa ammonia	Đa cơ chế: Amylase/Protease phân giải hữu cơ + Dị dưỡng chuyển hóa TAN/$\text{NO}_2^-$
Độ mặn thích ứng	0 - 15‰ (hiệu quả giảm ở độ mặn cao)	Không khảo sát dải mặn biển sâu	15 - 35‰ (thích nghi tối ưu độ mặn nước biển tự nhiên)
Mật độ tối ưu hóa	Quy mô phòng thí nghiệm chuẩn	Nuôi cấy bình tam giác cơ bản	Box-Behnken RSM đạt $3,14 \times 10^{11}$ CFU/mL (B85) và $2,37 \times 10^{11}$ CFU/mL (KL15)
Dạng thương phẩm	Dung dịch lỏng (Inoculum liquid)	Chưa định hình chế phẩm ứng dụng	Chế phẩm sinh học dạng bột mang chất mang bán rắn ($10^9$ CFU/g)

Khi đặt cạnh các công trình quốc tế, luận án đã định vị rõ rệt sự đột phá: trong khi Grommen và ctv (2002, 2004) tập trung vào vi khuẩn tự dưỡng trong chế phẩm lỏng ABIL đòi hỏi thời gian khởi động bể lọc từ 4 đến 14 ngày và kém bền vững trước dao động độ mặn, hay Sarmila Muthukrishnan và ctv (2015) chỉ khảo sát khả năng xử lý TAN (73,80%) và nitrite (91,61%) của vi khuẩn nước thải tôm sau thu hoạch ở quy mô bình 25L, thì luận án này đã đi từ giải mã hệ vi sinh đáy biển sâu, giải trình tự gen 16S rRNA, đến xây dựng mô hình toán học tối ưu hóa môi trường lên men rẻ tiền và chế tạo thành công chế phẩm dạng bột có thời hạn bảo quản lên tới 360 ngày.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng học thuyết sinh thái học vi sinh biển (Marine Microbial Ecology Theory) và làm sâu sắc thêm cơ chế chuyển hóa nitơ dị dưỡng đồng thời (Simultaneous Nitrification and Denitrification - SND). Nghiên cứu thách thức giả định truyền thống cho rằng quá trình chuyển hóa nitơ trong môi trường mặn chỉ do nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng chi phối. Các bằng chứng thực nghiệm đã xác lập 3 mệnh đề lý thuyết (propositions):

• Proposition 1: Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 sinh bào tử phân lập từ trầm tích biển sâu sở hữu con đường chuyển hóa ammonia hiệu suất cao kết hợp tiết enzyme ngoại bào (protease, amylase) bền vững ở dải độ mặn 1,5% - 3,5% NaCl.
• Proposition 2: Pseudomonas stutzeri KL15 đóng vai trò kép vừa là vi khuẩn phản nitrate hóa hiếu khí vừa có khả năng đồng hóa ammonium trực tiếp mà không gây tích tụ trung gian nitrite độc hại trong điều kiện nồng độ muối cao.
• Proposition 3: Rhodococcus rhodochrous T9 đại diện cho nhóm vi khuẩn Actinobacteria có khả năng thích nghi chuyển hóa nitrite chuyên biệt ở pha hiếu khí trong điều kiện nghèo dinh dưỡng đáy biển.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án được xây dựng dựa trên sự liên kết chặt chẽ giữa ba trường phái lý thuyết: (1) Lý thuyết sinh thái học chu trình nitơ biển (Boyd, 1998), (2) Động học sinh trưởng và tạo sản phẩm của vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 1998), và (3) Lý thuyết tối ưu hóa bề mặt đáp ứng RSM (Myers và ctv, 1989; Ferreira và ctv, 2007).

Phương pháp tiếp cận phân tích mới nằm ở quy trình sàng lọc ma trận hai bước: sử dụng thiết kế Plackett-Burman để loại bỏ các yếu tố dinh dưỡng không có ý nghĩa thống kê, sau đó áp dụng ma trận Box-Behnken 3 yếu tố bậc hai để mô hình hóa chính xác phương trình hồi quy đa thức $y = f(x)\beta + \varepsilon$. Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác lập rõ: độ mặn dao động từ 15‰ đến 35‰ (1,5 - 3,5% NaCl), pH từ 7,0 đến 8,5, nhiệt độ từ 28°C đến 32°C, nồng độ oxy hòa tan $\text{DO} > 2\text{ mg/L}$.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ thế giới quan thực chứng (positivism) với phương pháp tiếp cận định lượng thực nghiệm nghiêm ngặt. Thiết kế nghiên cứu đa tầng tích hợp ba giai đoạn:

1. Nghiên cứu in vitro: Phân lập, định danh phân tử, sàng lọc sinh hóa hệ vi sinh vật từ 132 mẫu trầm tích.
2. Nghiên cứu công nghệ sinh học: Tối ưu hóa lên men lỏng và bán rắn bằng mô hình toán học RSM.
3. Nghiên cứu in vivo (Mesocosm): Thử nghiệm kiểm chứng khả năng xử lý nước trong hệ thống ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giai đoạn Postlarvae 5 (PL5) quy mô bể xi măng $1\text{ m}^3$.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6663-3:2016 và TCVN 6663-15:2004. Mẫu bùn được lấy bằng ống PVC vô trùng tại 3 vị trí đại diện (dưới lồng, mép lồng, cách lồng 5m) ở 11 cụm lồng nuôi, bảo quản lạnh ở 4°C và xử lý trong vòng 2 giờ.

Các chỉ tiêu hóa lý được phân tích theo phương pháp chuẩn quốc tế APHA (2012):

• Đo ammonia bằng phương pháp trắc quang $4500\text{ NH}_3\text{-F}$.
• Đo nitrite bằng phương pháp trắc quang $4500\text{ NO}_2^-\text{-B}$.
• Đo nitrate bằng phương pháp trắc quang $4500\text{ NO}_3^-\text{-D}$.
• Đo nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 6638:2000.

Định danh vi sinh vật kết hợp ba mức độ: hình thái khuẩn lạc, sinh hóa bằng kit API 20E, API 20NE và API Coryne (bioMérieux), cùng phân tích sinh học phân tử trích xuất DNA bằng kit AccuPrep Genomic DNA Extraction (Bioneer, Hàn Quốc). Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi phổ biến 27F ($5'\text{-AGATTTGATCCTGGCTCAG-}3'$) và 1492R ($5'\text{-GGTTACCTTGTTACGACTT-}3'$). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 0,5X, giải trình tự theo phương pháp Sanger (1977). Cây phả hệ di truyền được xây dựng trên phần mềm MEGA X bằng thuật toán Neighbor-Joining với hệ số lặp lại bootstrap 1000 chu kỳ (Kumar và ctv, 2018). Mật độ vi khuẩn AOB và NOB được xác định chuẩn xác theo phương pháp Most Probable Number (MPN) dựa trên bảng thống kê MacCrady (Ehrlich, 1975).

Data và phân tích

Số liệu thu thập từ ma trận Box-Behnken được phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Design-Expert để đánh giá độ tương thích của mô hình bậc hai thông qua hệ số xác định ($R^2$), giá trị $F$-value và mức ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$). Độ tin cậy của mô hình được kiểm chứng thông qua việc kiểm tra độ phân tán phần dư (residual plots) và các điểm thí nghiệm lặp tại tâm ($C_0$). Dữ liệu thử nghiệm xử lý nitơ trên bể nuôi tôm được phân tích thống kê One-way ANOVA và kiểm định Duncan để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức ($p < 0,05$).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phân lập và định danh chính xác 3 chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ ưu việt chịu mặn cao: Từ 132 mẫu bùn đáy Vịnh Xuân Đài, nghiên cứu đã tuyển chọn thành công 3 chủng có hoạt tính cao nhất gồm Bacillus licheniformis B85 (sinh bào tử, chịu nhiệt $>80^\circ\text{C}$, phân giải ammonia), Pseudomonas stutzeri KL15 (oxy hóa ammonia và khử nitrite/nitrate), và Rhodococcus rhodochrous T9 (chuyển hóa nitrite chuyên biệt), tất cả đều sinh trưởng tối ưu ở dải độ mặn 2,0% - 3,5% NaCl.
2. Thiết lập công thức môi trường lên men tối ưu đạt sinh khối kỷ lục: Bằng mô hình tối ưu hóa Box-Behnken, luận án đã xác định thành phần môi trường lỏng giúp tăng sinh khối vượt bậc:
   • B. licheniformis B85 đạt mật độ $3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ với 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men và 1,13 g/L NaCl.
   • P. stutzeri KL15 đạt mật độ $2,37 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ với 4,95 g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men và 1,13 g/L $\text{MgSO}_4$.
   • R. rhodochrous T9 đạt mật độ $2,52 \times 10^{10}\text{ CFU/mL}$ với 7,93 g/L glucose, 6,10 g/L peptone và 2,95 g/L NaCl.
3. Làm chủ quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột: Đã tối ưu hóa thành công quá trình nuôi cấy trên cơ chất bán rắn, sấy và nghiền mịn để thu được chế phẩm dạng bột đạt mật độ đồng nhất $10^9\text{ CFU/g}$.
4. Xác lập động học suy giảm mật số vi sinh vật theo nhiệt độ bảo quản: Ở điều kiện lạnh 4 - 8°C sau 360 ngày, B. licheniformis B85 duy trì mật độ xuất sắc ở mức $10^7\text{ CFU/g}$ (nhờ khả năng sinh nội bào tử chịu hạn), R. rhodochrous T9 đạt $10^6\text{ CFU/g}$. Ở nhiệt độ phòng 28 - 32°C sau 360 ngày, B. licheniformis B85 vẫn đạt $10^6\text{ CFU/g}$, trong khi P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 duy trì ở mức $10^5\text{ CFU/g}$.
5. Kiểm chứng hiệu quả in vivo vượt trội trong mô hình ương tôm thẻ chân trắng: Thử nghiệm trên bể xi măng $1\text{ m}^3$ ương tôm thẻ PL5 với liều lượng bổ sung 0,5% chế phẩm vi sinh ($10^8\text{ CFU/g}$) định kỳ 6 ngày/lần đã kiểm soát hàm lượng TAN luôn duy trì $\le 0,1\text{ mg/L}$, $\text{NO}_2^- < 0,23\text{ mg/L}$, đồng thời ức chế mật độ vi khuẩn gây bệnh Vibrio sp. so với nghiệm thức đối chứng.

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật: Công trình bổ sung dữ liệu phân loại học phân tử và đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đáy biển nhiệt đới vào ngân hàng dữ liệu GenBank (NCBI), mở rộng hiểu biết về vai trò sinh thái của chi Rhodococcus và Pseudomonas trong môi trường biển siêu tải trọng hữu cơ.
• Về mặt công nghệ: Đột phá trong việc sử dụng mật rỉ đường – phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ – thay thế các nguồn carbon đắt tiền trong môi trường nhân sinh khối công nghiệp, giúp hạ giá thành sản xuất chế phẩm sinh học quy mô thương mại.
• Về mặt thực tiễn nuôi trồng: Cung cấp giải pháp an toàn sinh học thay thế hóa chất và kháng sinh, giải quyết triệt để sự tích tụ khí độc tầng đáy, giảm tỷ lệ chết ở giai đoạn ương giống nhạy cảm (Postlarvae).
• Về mặt chính sách và môi trường: Đóng góp trực tiếp vào mục tiêu của Quyết định 4431/QĐ-BNN-TCTS về phát triển bền vững ngành nuôi tôm hùm, cung cấp luận cứ khoa học để cơ quan quản lý ban hành quy chuẩn kiểm soát môi trường trầm tích các vùng vịnh kín ven biển.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn ghi nhận 3 giới hạn nghiên cứu chính:

1. Phạm vi thử nghiệm in vivo: Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh mới chỉ dừng lại ở quy mô mesocosm trong bể xi măng $1\text{ m}^3$ trên đối tượng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giai đoạn PL5, chưa thể triển khai thử nghiệm thực địa trực tiếp dưới các lồng nuôi tôm hùm mở ngoài vịnh biển do khó khăn trong việc kiểm soát dòng chảy tự nhiên và kinh phí vận hành.
2. Phương pháp phân tích hệ vi sinh: Nghiên cứu tập trung vào phương pháp nuôi cấy truyền thống kết hợp giải trình tự Sanger gen 16S rRNA của từng chủng đơn lẻ, chưa áp dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS Metagenomics) để phân tích toàn diện biến động của toàn bộ quần xã vi sinh vật đáy biển.
3. Cơ chế chuyển hóa sâu: Chưa thực hiện phân tích biểu hiện gen chức năng (functional gene expression như amoA, nirS, nosZ) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR để định lượng tốc độ phiên mã enzyme chuyển hóa nitơ trong các điều kiện ức chế môi trường khác nhau.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối trong tương lai cần tập trung vào 4 định hướng:

• Nghiên cứu công nghệ cố định vi khuẩn (microbial cell immobilization) trên các chất mang sinh học xốp (bio-carrier/beads) tỷ trọng cao để đưa chế phẩm chìm thẳng xuống bề mặt trầm tích đáy lồng nuôi biển mà không bị dòng triều cuốn trôi.
• Triển khai thử nghiệm quy mô pilot và field-trial tại các bè nuôi tôm hùm thương phẩm ở đầm Cù Mông, Vịnh Xuân Đài và Vịnh Cam Ranh.
• Ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) của 3 chủng B. licheniformis B85, P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 để giải mã chi tiết các cụm gen chuyển hóa thứ cấp và gen kháng stress thẩm thấu.
• Tối ưu hóa công nghệ sấy thăng hoa (lyophilization) kết hợp bổ sung chất bảo vệ màng tế bào nhằm nâng cao tỷ lệ sống của tế bào sinh dưỡng P. stutzeri và R. rhodochrous trong chế phẩm bột bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động lan tỏa mạnh mẽ trên nhiều phương diện:

• Tác động học thuật: Kết quả công trình là tài liệu tham khảo quan trọng cho các nghiên cứu thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học môi trường, Vi sinh học biển và Nuôi trồng thủy sản; dự kiến thu hút trích dẫn khoa học cao trong hệ thống Scopus/Web of Science đối với các chủ đề về xử lý sinh học (bioremediation) vùng nước mặn.
• Chuyển dịch ngành công nghiệp sinh học: Mở ra khả năng tự chủ công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học xử lý môi trường biển tại Việt Nam, giảm sự phụ thuộc vào các sản phẩm men vi sinh nhập khẩu đắt đỏ từ Mỹ, Thái Lan hay Ấn Độ, tiết kiệm chi phí xử lý môi trường từ 30% - 40% cho các trang trại nuôi tôm.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Giúp người nuôi tôm hùm và tôm thẻ chân trắng nâng cao tỷ lệ sống của con giống từ 15% - 25%, giảm thiểu rủi ro dịch bệnh bùng phát do ô nhiễm khí độc đáy ao/lồng, bảo vệ sinh kế bền vững cho hàng vạn hộ dân ven biển Nam Trung Bộ.
• Giá trị bảo tồn sinh thái: Góp phần giảm thiểu hiện tượng phú dưỡng, hạn chế sự bùng phát của tảo độc và hiện tượng suy giảm oxy tầng đáy, bảo vệ các rạn san hô và hệ sinh thái đa dạng sinh học tại các vùng vịnh tự nhiên của Việt Nam.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên đại học: Tiếp cận phương pháp luận mẫu mực trong việc ứng dụng công cụ thống kê toán học (Plackett-Burman, Box-Behnken RSM) để giải quyết các bài toán tối ưu hóa lên men phức tạp trong công nghệ sinh học vi sinh.
• Bộ phận R&D của các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Tiếp nhận quy trình công nghệ chi tiết từ khâu phối trộn cơ chất lên men lỏng giá rẻ (mật rỉ đường, cao nấm men) đến kỹ thuật sản xuất chế phẩm bán rắn dạng bột đạt mật độ $10^9\text{ CFU/g}$.
• Cộng đồng người nuôi trồng thủy sản: Sở hữu giải pháp công nghệ sinh học bản địa hiệu quả cao để quản lý chất lượng nước và nền đáy ao/bể ương, loại bỏ triệt để khí độc $\text{NH}_3$ và $\text{NO}_2^-$.
• Cơ quan hoạch định chính sách: Các Chi cục Thủy sản, Sở Tài nguyên và Môi trường các tỉnh ven biển có cơ sở khoa học xác đáng để xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quan trắc trầm tích đáy và hướng dẫn quy trình nuôi tôm an toàn sinh học.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc mở rộng Học thuyết Chu trình Nitơ Biển (Marine Nitrogen Cycle Theory) và cơ chế Chuyển hóa Nitơ Dị dưỡng Đồng thời (SND) trong trầm tích biển nhiệt đới. Luận án chứng minh chủng Bacillus licheniformis B85 và Pseudomonas stutzeri KL15 phân lập từ đáy biển sâu có khả năng oxy hóa ammonia và khử nitrate/nitrite trực tiếp trong điều kiện hiếu khí ở độ mặn lên tới 3,5% NaCl, phá vỡ định kiến cho rằng quá trình làm sạch nitơ trong môi trường mặn bắt buộc phải dựa vào các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng sinh trưởng chậm.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì?

So với nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) chỉ dừng lại ở khảo sát bình tam giác đơn biến truyền thống hay Grommen và ctv (2002) thử nghiệm chế phẩm dạng lỏng không tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, luận án đã thiết lập quy trình tích hợp 2 cấp độ: sàng lọc yếu tố ảnh hưởng bằng ma trận Plackett-Burman và tối ưu hóa đa biến bằng ma trận Box-Behnken (RSM). Phương pháp này giúp mô hình hóa chính xác tương tác phức tạp giữa nguồn carbon, nitơ và muối khoáng, đẩy mật độ sinh khối lên mức kỷ lục $3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ với chi phí cơ chất thấp nhất.

3. Phát hiện bất ngờ nhất (counter-intuitive) có số liệu chứng minh là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là sự duy trì mật độ tế bào sống sót của Bacillus licheniformis B85 trong chế phẩm dạng bột sau 360 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng ($28 - 32^\circ\text{C}$) vẫn đạt mức $10^6\text{ CFU/g}$, và ở nhiệt độ mát ($4 - 8^\circ\text{C}$) đạt $10^7\text{ CFU/g}$, trong khi các chủng không sinh bào tử như P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 bị suy giảm từ $10^9$ về $10^5\text{ CFU/g}$. Điều này khẳng định ưu thế tuyệt đối của vi khuẩn sinh nội bào tử trong công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học thương mại lưu kho dài hạn mà không cần dây chuyền sấy đông khô đắt đỏ.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp (replication protocol) đầy đủ không?

Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết và minh bạch tuyệt đối, bao gồm: thành phần môi trường phân lập chọn lọc (Ammonium-Calcium-Carbonate agar, TSA bổ sung NaCl theo dải nồng độ), công thức thuốc thử Griess-Ilosvay, thông số chu nhiệt PCR khuếch đại gen 16S rRNA với mồi 27F/1492R, ma trận thí nghiệm 15 nghiệm thức Box-Behnken cho từng chủng, tỷ lệ phối trộn cơ chất lên men bán rắn, thông số sấy và phác đồ định liều 0,5% chế phẩm ($10^8\text{ CFU/g}$) định kỳ 6 ngày/lần trong bể nuôi $1\text{ m}^3$.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào?

Lộ trình 10 năm hướng tới: (1) Hoàn thiện công nghệ vi bọc (microencapsulation) và hạt chìm giải phóng chậm để ứng dụng trực tiếp tại nền đáy lồng hở ngoài biển, (2) Xây dựng hệ thống lên men tự động công nghiệp (Bioreactor 500L - 1000L), (3) Đăng ký sở hữu trí tuệ và thương mại hóa chế phẩm đa chủng xử lý môi trường nước mặn phục vụ đề án phát triển tôm hùm xuất khẩu 200 triệu USD của quốc gia.

Kết luận

1. Phân lập, định danh và lập bản đồ phả hệ di truyền 16S rRNA thành công cho 3 chủng vi khuẩn bản địa ưu việt từ 132 mẫu bùn đáy Vịnh Xuân Đài: Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, và Rhodococcus rhodochrous T9 có hoạt tính chuyển hóa ammonia, nitrite cao và chịu mặn tối ưu từ 1,5% - 3,5% NaCl.
2. Ứng dụng thành công mô hình toán học bề mặt đáp ứng Box-Behnken (RSM) để tối ưu hóa môi trường lên men lỏng giá trị gia tăng cao, đạt mật độ sinh khối cực đại $3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ đối với B85, $2,37 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ đối với KL15, và $2,52 \times 10^{10}\text{ CFU/mL}$ đối với T9 từ nguồn mật rỉ đường và cao nấm men.
3. Hoàn thiện công nghệ lên men bán rắn tạo chế phẩm sinh học dạng bột đạt mật số $10^9\text{ CFU/g}$; giải mã quy luật động học sống sót của vi khuẩn sau 360 ngày bảo quản ở hai dải nhiệt độ $4 - 8^\circ\text{C}$ và $28 - 32^\circ\text{C}$.
4. Chứng minh hiệu quả xử lý môi trường vượt trội của chế phẩm trong bể ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng PL5 quy mô $1\text{ m}^3$ với liều lượng 0,5% ($10^8\text{ CFU/g}$) định kỳ 6 ngày/lần, kiểm soát an toàn tuyệt đối các chỉ số TAN, $\text{NO}_2^-$, $\text{NO}_3^-$ và ức chế vi khuẩn Vibrio gây bệnh.
5. Mở ra hướng nghiên cứu đột phá về công nghệ xử lý sinh học (bioremediation) tại chỗ cho các vùng biển nuôi thủy sản kín gió, cung cấp giải pháp căn cơ giảm thiểu ô nhiễm đáy vịnh và thúc đẩy nền kinh tế biển phát triển bền vững.
6. Xác lập nền tảng khoa học vững chắc phục vụ việc thương mại hóa chế phẩm sinh học chịu mặn “Made in Vietnam”, đóng góp thiết thực vào mục tiêu hiện đại hóa và nâng cao giá trị kim ngạch xuất khẩu của ngành thủy sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan tình hình nuôi tôm hùm lồng bè Theo nguồn cung cấp của FAO (2014) lượng tôm hùm của các nước như Philippine, Indosesia, Australia liên tục tăng trưởng trong vòng 10 năm liên tục từ 2004-2014, từ vài chục tấn tăng lên gần 1000 tấn/năm. Hầu hết nghiên cứu về nuôi tôm hùm được thực hiện ở Nhật Bản, Úc, Mỹ, New Zealand, Mexico, Nam Phi, Ấn Độ và Việt Nam. Nguồn giống tôm hùm thả nuôi có thể từ khai thác tự nhiên hoặc nhân tạo.

Do giai đoạn biến thái của ấu trùng tôm hùm quá dài, nên quá trình sản xuất giống tương đối phức tạp, chi phí cao; vì vậy nguồn giống (giai đoạn ấu trùng puerulus và tôm con nhỏ) do khai thác tự nhiên vẫn chiếm ưu thế (Võ Văn Nha, 2006; Phillips và Matsuda, 2011). Nuôi tôm hùm gai đã được nhiều nước quan tâm, nhưng chỉ có vài nước nuôi thương phẩm thành công. Trong khu vực Đông Nam Á, nuôi thương phẩm tôm hùm gai chủ yếu tập trung vào 7 loài: tôm hùm bông P. ornatus, tôm hùm đá P.

homarus, tôm hùm sen P. versicolor, tôm hùm đỏ P. longipes, tôm hùm ma P.penicillatus, tôm hùm sỏi P. stimpsoni và tôm hùm tre P.

Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm gai phát triển đáng kể, phần lớn dựa vào nguồn giống tự nhiên. Nghề khai thác tôm hùm có sản lượng dưới 100 tấn mỗi năm (Thuy và Ngoc, 2004), chủ yếu từ nghề lặn và cung cấp cho thị trường nội địa. Tỉnh Phú Yên có hàng loạt vũng vịnh kín, hoặc nửa kín có mũi đá, đảo che chắn các tác động sóng và nước đủ sâu nên rất phù hợp cho nuôi tôm hùm (đầm Cù Mông, Vịnh Xuân Đài, Vũng Rô) (Tống Phước Hoàng Sơn, 2015). Theo kết quả báo cáo của Tổng cục thủy sản (2015), sản lượng tôm hùm dao động từ 20 tấn (Bình Định) với 500 lồng, 450 tấn (Phú Yên) đến 650 tấn (Khánh Hòa).

Thị xã Sông Cầu có khoảng 1.000 ha diện tích mặt biển được sử dụng để nuôi tôm hùm, sản lượng tôm hùm thương phẩm vào khoảng 400-500 tấn/năm, chiếm gần 70% sản lượng của toàn tỉnh (Tổng cục thủy sản, 2015). Nghề nuôi tôm hùm ở Vịnh Xuân Đài có 3 hình thức là nuôi trong lồng treo, lồng chìm và kết hợp cả hai hình thức (Hoàng Thị Mỹ Hương 6 và ctv, 2018). Hiện trạng ô nhiễm môi trường nước vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài Vịnh Xuân Đài thuộc thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên có diện tích mặt nước hơn 13. Đây là vùng chứa đựng hệ sinh thái đa dạng, phong phú và là vùng nước lý tưởng phát triển nghề nuôi tôm hùm bằng lồng, bè với sản lượng hàng năm vài trăm tấn.

Tuy nhiên, trong những năm gần đây, tình trạng phát triển quá nhanh diện tích nuôi trồng thuỷ sản trên vịnh kết hợp với các hoạt động sản xuất và đời sống của con người đã gây sức ép lên môi trường vịnh Xuân Đài. Chất thải từ lồng, bè nuôi trồng thủy sản thải ra, đổ vào Vịnh. Lượng chất thải này tích tụ qua nhiều năm tháng sẽ ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước nơi đây. Các hoạt động khai thác và đánh bắt thủy sản trên Vịnh cũng gây ô nhiễm và suy thoái môi trường.

Số tàu thuyền hiện có trên Vịnh khi hoạt động thường xuyên sẽ thải ra một lượng chất thải đáng kể như váng dầu, mỡ từ động cơ. Một số hoạt động khai thác trái phép như khai thác san hô, sử dụng phương tiện khai thác hủy diệt hàng loạt, gây nguy cơ ô nhiễm biển, ô nhiễm vùng nuôi và giảm đa dạng sinh học (Bùi Hồng Long, 2001). Việc sử dụng thức ăn tươi đã làm cho môi trường nuôi ngày càng phì dưỡng, chất lượng nước giảm đi, tạo điều kiện cho dịch bệnh bùng phát (Tuan và Mao, 2005). Kết quả lấy mẫu môi trường nước vùng nuôi tôm hùm của Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh thủy sản khu vực miền Trung của Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III cho thấy trầm tích tại vùng nuôi đang bị ô nhiễm hữu cơ, sulfur, hợp chất nitơ và các chất độc hại (Fe2+, Fe3+.

Nuôi tôm hùm lồng sản sinh một lượng lớn chất thải vào trong môi trường nước như phân tôm, nguồn thức ăn dư thừa thối rửa bị phân huỷ, các chất tồn dư từ các loại vật liệu đầu vào như hoá chất, vôi và các loại khoáng chất diatomit, dolomit, lưu huỳnh lắng đọng, các chất độc hại có trong đất phèn Fe2+, Fe3+, Al3+, SO42-, các thành phần chứa H2S, NH3. là sản phẩm của quá trình phân hủy yếm khí ngập nước tạo thành. Đối với các lồng nuôi công nghiệp chất thải trong quá trình nuôi có thể chứa đến trên 45% nitơ và 22% là các chất hữu cơ khác. Các loại chất thải chứa nitơ và phốt pho ở hàm lượng cao gây nên hiện tượng phú dưỡng môi trường nước, phát sinh tảo độc trong môi trường nước nuôi trồng thủy sản (Tổng cục thủy sản, 2015).

Chất lượng nước tại các vùng 7 nuôi tôm hùm cũng bị suy giảm nghiêm trọng do hàm lượng NH3 và H2S cao trong tầng nước sát đáy và tầng đáy, được coi là những nguyên nhân chủ yếu làm cho tôm hùm chết hàng loạt (Tổng cục thủy sản, 2015). Theo Hoàng Thị Mỹ Hương và ctv (2018), chất lượng nước ở Vịnh Xuân Đài, đặc biệt là ở tầng đáy, đang diễn biến ngày càng xấu hơn. Nồng độ ammonia (NH3) hầu hết vượt tiêu chuẩn cho phép, đặc biệt là ở tầng đáy. Nồng độ nitrite (NO2-) có xu hướng tăng ở tầng đáy, nồng độ nitrate (NO3-) hầu như ổn định.

Giá trị Nitơ tổng ở tầng đáy tương đối cao hơn các tầng còn lại. Vi sinh vật trong môi trường nước mặn Môi trường nước biển ở đại dương chiếm 97,2% tổng lượng nước toàn cầu. Đại dương có độ sâu khá lớn, phần nước ở độ sâu 1000 m trở xuống chiếm 75% thể tích đại dương. Nơi sâu nhất của đại dương là 11000 m.

Phần nước dưới độ sâu 100 m thường có nhiệt độ ổn định là 3oC. Cứ xuống sâu 10 m thì áp suất nước biển tăng 1 atm, ở nơi sâu nhất của đại dương áp suất có thể đạt tới sấp xỉ 1000 atm. Môi trường nước biển còn được đặc trưng bởi độ mặn (3,3 - 3,7%). Sự hòa trộn và chuyển động của nước biển là do thủy triều, chủng chảy, chuyển động nổi lên theo nhiệt độ, gió.

Vi sinh vật sống trong môi trường nước biển chịu tác động của áp suất, có thể thấy được mối tương quan giữa vi sinh vật và áp suất. Một số vi khuẩn có khả năng tồn tại trong phạm vi dao động áp suất từ 0 - 400 atm, tuy nhiên chúng thường phát triển tốt nhất ở áp suất khí quyển. Nhiều vi khuẩn sinh trưởng tốt ở áp suất cao và được gọi là vi sinh vật ưa áp (barophile). Vi sinh vật ưa áp trung bình (moderate barophile) sinh trưởng tốt nhất ở 400 atm, tuy nhiên chúng có thể tồn tại ở 1 atm.

Vi sinh vật ưa áp cực đoan (extreme barophile) chỉ có thể phát triển ở áp suất cao. Sự thay đổi áp suất có ảnh hưởng rất lớn tới các quá trình sinh học của vi sinh vật như phân bào, lắp ráp tiên mao, tổng hợp DNA, vận chuyển chất qua màng, sinh tổng hợp protein. Các protein hình thành kênh vận chuyển vật chất ở màng thường hoạt động có hiệu quả ở một áp suất nhất định. Ngoài ra, vi sinh vật biển còn chịu ảnh hưởng của ánh sáng, người ta chia đại dương thành 2 vùng: vùng có ánh sáng (có thể quang hợp) và vùng không có ánh sáng (không thể quang hợp).

8 Hầu hết chất dinh dưỡng ở đại dương xuất hiện trong vùng nước từ bề mặt tới độ sâu 300 m. Đây là vùng ánh sáng có thể xuyên tới, ở đây có sự phát triển của thực vật phù du (tảo và vi khuẩn lam). Chỉ có 1% chất hữu cơ có nguồn gốc quang tổng hợp tới được thềm đại dương, phần còn lại bị phân huỷ trong quá trình rơi xuống. Nguồn dinh dưỡng tại đáy đại dương rất hạn chế vì vậy đây là vùng tồn tại các vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

Chu trình nitơ và lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng trong môi trường nước biển và tác động lớn đến các quá trình ở mức độ toàn cầu. Hàm lượng nitơ trong nước biển thường dao động, ở vùng nước biển chứa nồng độ oxi thấp thì sẽ xảy ra hiện tượng phản nitrate hóa (sử dụng NO3- và NO2- là chất oxi hóa và giải phóng nitơ vào khí quyển) dẫn đến làm giảm tỷ lệ N: P trong nước. Ngược lại, sự cố định nitơ xảy ra mạnh mẽ sẽ làm tăng lượng nitơ trong nước. Điều này cho thấy nitơ chứ không phải phospho đã hạn chế các hoạt động sinh học trong môi trường biển.

Chu trình Cacbon ở trong môi trường biển vẫn chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên một điều rõ ràng là vi sinh vật có ảnh hưởng lớn tới chu trình cacbon ở đây. Vi sinh vật ở đại dương tác động đến chu trình cacbon toàn cầu và mối liên hệ giữa đại dương và khí quyển. Hầu hết sự biến đổi của cacbon xảy ra ở vùng nước bề mặt, chất hữu cơ không tan (POC), chất hữu cơ hòa tan (DOC) và mêtan hydrat là nguồn cacbon chính ở đại dương. Đại dương còn chứa HCO3- và CO2 hòa tan có nguồn gốc từ khí quyển.

Do sự bổ sung chất hữu cơ từ đất liền nên số lượng vi sinh vật tổng số ở vùng bờ biển nhiều hơn là ở vùng giữa biển (Prescott, 2002; Nguyễn Lân Dũng, 2006). Sơ đồ chu trình chuyển hóa nitơ trong hệ sinh thái biển Mô hình chu trình chuyển hoá Nitơ trong hệ sinh thái biển được biểu diễn trên sơ đồ hình 1. Trong chu trình, nguyên tố Nitơ được chuyển hoá qua 5 hợp phần: thực vật nổi (Phytoplankton- sinh khối được ký hiệu là PHY), động vật nổi (Zooplankton - ZOO), chất hữu cơ hoà tan (Dissolved Organic Matter - DOM), Amoni (Amonium - AMO), Nitrit (Nitrite - NIT), Nitrat (Nitrate – NAT) (Đoàn Bộ, 1997, 1998; Nguyễn Ngọc Tiến và ctv, 2011). Sơ đồ chu trình chuyển hoá Nitơ trong hệ sinh thái biển Chú giải: PHY: Phytoplankton; ZOO: Zooplankton; DOM: Chất hữu cơ hoà tan; AMO: Amoni; NIT: Nitrat; 1.

9: Các quá trình chuyển hoá; →: Hướng chuyển hoá Quá trình chuyển hoá 1: Quang hợp của Phytoplankton. Trong quá trình này dưới tác động của năng lượng ánh sáng mặt trời, Phytoplankton đã sử dụng khí CO2, nước và các muối dinh dưỡng trong đó có amoni, nitrit và nitrat của môi trường để tổng hợp chất hữu cơ. Quá trình này đã chuyển hoá nitơ vô cơ từ môi trường thành nitơ liên kết trong tế bào tảo (làm giảm AMO, NIT và NAT và làm tăng PHY).