MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hạn hán được biết tới như là một trong những yếu tố bất lợi phi sinh học ảnh hưởng tiêu cực tới năng suất cây trồng và an ninh lương thực trên toàn thế giới. Hơn nữa, hạn hán là nguyên nhân gây ra một số ảnh hưởng bất lợi khác nhau về quá trình trao đổi chất ở thực vật như sự co giãn tế bào, phá hủy màng tế bào, giảm chức năng của các enzyme tham gia quá trình liên kết màng, oxy hóa lipid và các protein bởi việc tích lũy sản phẩm dư thừa của các phản ứng oxy hóa, và ức chế khả năng quang hợp. Để đối phó với hạn, cây trồng kích hoạt một số cơ chế đáp ứng với bất lợi ở các mức độ sinh hóa, sinh lý và phân tử khác nhau để giúp chúng sống sót.
Hơn nữa, thực vật cũng có thể đáp ứng với hạn hán một cách gián tiếp thông qua một số mạng lưới điều khiển khác nhau, trong đó các yếu tố phiên mã (TF) đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện của các gen mục tiêu. Các protein NAC được biết tới như là một siêu họ trong số các họ TF và có mặt ở hầu hết các loài thực vật. Các TF NAC tham gia vào tất cả các quá trình sinh trưởng, phát triển và đáp ứng với các môi trường bất lợi khác nhau ở thực vật. Trong những năm gần đây, nhiều công bố đã chỉ ra vai trò của các TF NAC tham gia quá trình đáp ứng hạn ở thực vật.
Cụ thể, một vài gen NAC đã được phát hiện và nghiên cứu chức năng trong điều kiện stress hạn hoặc stress thẩm thấu ở cây mô hình Arabidopsis (ANAC019, ANAC055, ANAC072/RD26 và ANAC016), và một số cây trồng quan trọng như cây lúa (OsNAC5, OsNAC6 và OsNAC10), cây lúa mỳ (TaNAC2, TaNAC29 và TaNAC67), cho thấy tiềm năng trong việc cải thiện khả năng chống chịu hạn cho cây trồng. Tuy nhiên, có rất ít các công bố nghiên cứu chức năng cụ thể của các TF NAC trên đối tượng cây họ đậu. Trong khi, cây đậu tương (Glycine max L.) và đậu gà (Cicer arietinum L.) được biết tới như là những cây trồng họ đậu quan trọng được trồng ở nhiều vùng trên thế giới và là nguồn thực phẩm cung cấp 1 dinh dưỡng thiết yếu cho con người và vật nuôi cũng đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán. Cụ thể, hạn hán ảnh hưởng tới tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây họ đậu dẫn đến làm giảm năng suất và sản lượng cây đậu tương và đậu gà trên toàn thế giới.
Chính từ những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng nói chung và cây họ đậu nói riêng; cùng với đó là vai trò và tầm quan trọng của cây họ đậu, cụ thể là cây đậu tương và đậu gà đối với nền nông nghiệp của Việt Nam cũng như trên thế giới, chúng tôi đã xây dựng một luận án nghiên cứu khoa học với tiêu đề “Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu”. Trong đó, nghiên cứu sẽ tập trung làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với hạn hán trên đối tượng cây mô hình Arabidopsis thaliana. Sau đó, dựa trên các kết quả nghiên cứu chức năng cụ thể của gen GmNAC085 được làm sáng tỏ, sẽ tiếp tục sàng lọc và phân tích để phát hiện ra các gen NAC khác có tiềm năng đáp ứng tốt với hạn trên đối tượng cây họ đậu quan trọng khác, cụ thể là cây đậu gà. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 2.
Mục tiêu tổng quát Mục tiêu của đề tài nhằm làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây mô hình Arabidopsis và tìm ra các gen CaNAC tiềm năng liên quan đến đáp ứng với điều kiện hạn ở cây đậu gà. Mục tiêu cụ thể Nghiên cứu để làm rõ chức năng của gen GmNAC085trong quá trình đáp ứng với điều kiện xử lý hạn ở cây mô hình Arabidopsis, từ đó tìm ra các cơ chế chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085. Phân tích, đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống đậu gà chịu hạn kém Hashem và chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước và ABA bằng kỹ thuật qRT-PCR để tìm ra các gen CaNAC tiềm năng có 2 khả năng đáp ứng tốt với hạn hán. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3.
Ý nghĩa khoa học Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy GmNAC085 là gen đáp ứng với bất lợi ở cây đậu tương đóng vai trò như một yếu tố hoạt hóa phiên mã. Sự biểu hiện liên tục của GmNAC085 trong cây Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter 35S đã làm tăng cường khả năng chống chịu hạn của các cây chuyển gen thông qua sự điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây, giảm tỷ lệ thoát hơi nước và sự phá hủy màng tế bào, nhưng tăng mức độ hoạt động của các enzyme chống oxy hóa và tăng sự biểu hiện của các gen đáp ứng tới bất lợi trong các cây chuyển gen. Kết quả của luận án cũng đã cung cấp các dữ liệu khoa học về sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC ở cả hai giống đậu gà chịu hạn kém Hashem và chịu hạn tốt ILC482 trong điều kiện xử lý mất nước và ABA; đồng thời dựa vào kết quả so sánh về mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống đậu gà này và tiêu chí lựa chọn gen ứng viên, xác định được một số gen CaNAC có tiềm năng đáp ứng với hạn tốt cho nghiên cứu chức năng cụ thể ở trên đối tượng cây mô hình/cây trồng quan trọng. Ngoài ra, luận án được xem như tài liệu tham khảo có ý nghĩa cho công tác giảng dạy cũng như các hoạt động nghiên cứu khoa học liên quan tới lĩnh vực cải tạo cây trồng nông nghiệp có khả năng đáp ứng tốt với hạn hán.
Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án cung cấp cái nhìn chi tiết về vai trò tích cực của gen GmNAC085 trong việc điều khiển sự thích nghi của cây trồng với hạn hán, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của gen GmNAC085 đối với việc phát triển cây trồng chuyển gen chịu hạn. Mặt khác, luận án cũng cung cấp 5 gen CaNAC ứng cử viên đầy triển 3 vọng đáp ứng với mất nước cho nghiên cứu chức năng cụ thể trước khi sử dụng chúng trong kỹ thuật di truyền để phát triển cây đậu gà chuyển gen, cũng như các cây trồng khác có năng suất vượt trội ở điều kiện thiếu nước. Những đóng góp mới của luận án Kết quả của luận án cho thấy GmNAC085 đóng vai trò như là một chất hoạt hóa phiên mã trong nấm men, với vùng hoạt hóa nằm ở đầu C- của GmNAC085. Khi so sánh với cây đối chứng không chuyển gen (WT), các cây Arabidopsis chuyển gen (35S:GmNAC085) đã cho thấy là giảm sự tăng trưởng, nhưng cải thiện khả năng chịu hạn thông qua việc tăng cường tính toàn vẹn của màng tế bào và giảm tốc độ thoát hơi nước ở điều kiện thiếu nước.
Hơn nữa, sự giảm hàm lượng MDA đi kèm với việc tăng khả năng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa SOD, CAT và APX trong các cây 35S:GmNAC085. Cùng với đó, sự biểu hiện mạnh hơn của các gen mã hóa các enzyme chống oxy hóa và các gen đáp ứng với hạn trong cây 35S:GmNAC085 so với cây WT ở điều kiện hạn. Các kết quả này cung cấp cái nhìn rõ nét về vai trò tích cực của GmNAC085 trong việc điều hòa sự đáp ứng của cây trồng với hạn hán, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của GmNAC085 trong công tác phát triển giống cây trồng kháng hạn. Cùng với đó, luận án đã đánh giá sự biểu hiện của 19 gen CaNAC đáp ứng với mất nước trong lá và rễ của hai giống đậu gà đối lập nhau về tính chịu hạn ở trong các điều kiện ngâm nước (đối chứng), xử lý mất nước và ABA, để kiểm tra sự tương quan giữa mức độ biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC và khả năng chịu hạn khác nhau của hai giống này.
Kết quả phân tích qRT-PCR cho thấy mối quan hệ tích cực giữa số lượng gen tăng và giảm bởi xử lý mất nước và khả năng chịu hạn. Khả năng chịu hạn cao hơn của giống ILC482 có thể, hoặc ít nhất một phần là do nhiều gen CaNAC tăng mức độ biểu hiện hơn và ít gen giảm mức độ biểu hiện hơn trong cả mô lá và rễ của giống ILC482 so với Hashem. Ngoài ra, khi so sánh đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC trong lá và rễ của giống đậu gà ILC482 và Hashem cho thấy các đặc trưng biểu hiện đáp ứng với xử lý mất nước là khác nhau, điều này chỉ ra rằng sự biểu hiện 4 của các gen CaNAC là liên quan tới đặc trưng của mô và kiểu gen. Hơn nữa, kết quả phân tích cho thấy khả năng chịu hạn tốt hơn của giống ILC482 so với Hashem có thể liên quan tới 5 gen CaNAC02, 04, 05, 16 và 24.
Do vậy, các kết quả trong luận án này cũng đã cung cấp các gen CaNAC tiềm năng hứa hẹn cho việc nghiên cứu chức năng cụ thể của chúng, làm tiền đề cho việc phát triển các giống đậu gà/các cây họ đậu quan trọng khác có khả năng cải thiện năng suất trong điều kiện hạn hán. Tóm lại, luận án đã cung cấp cơ sở khoa học về sự tham gia của TF NAC vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu. Qua đó, cho thấy tiềm năng ứng dụng của TF NAC trong cải tạo giống cây trồng có khả năng chống chịu hạn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Hạn hán và những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng 1. Những thiệt hại của ngành trồng trọt do hạn hán gây ra Nền nông nghiệp toàn cầu trong thế kỷ 21 đang phải đối mặt với một thách thức khó khăn là cần phải tăng năng suất cây trồng lên gần 70% để có thể đáp ứng nhu cầu lương thực cho khoảng 9,7 tỷ người vào năm 2050 [24], [59]. Tuy nhiên, mục tiêu tăng năng suất cây trồng gặp phải nhiều thách thức docác khu vực canh tác đang ngày càng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi. Trong số các yếu tố bất lợi phi sinh học khác nhau thách thức tới sản xuất cây trồng trên toàn cầu, thì hạn hán là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực nhất đang diễn ra ở hầu khắp các lục địa [59], [102], [106], [110].
