Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hợp chất dị vòng là nhóm đối tượng đóng vai trò then chốt trong nhiều lĩnh vực khoa học, kỹ thuật, hóa dược và đời sống sản xuất. Trong số các dị vòng năm cạnh chứa lưu huỳnh và nitơ, thiazolidine-2,4-dione cùng các dẫn xuất thế của nó nhận được sự quan tâm đặc biệt từ giới nghiên cứu nhờ phổ hoạt tính sinh học đa dạng: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa, chống ung thư, kiểm soát đường huyết và hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Về mặt dược học, thiazolidine-2,4-dione có khả năng làm tăng độ nhạy cảm của insulin; nhiều hoạt chất thuộc nhóm này như pioglitazone hay rosiglitazone đã được cấp phép lưu hành từ năm 1997. Tuy nhiên, một số dẫn xuất thiazolidine-2,4-dione biểu hiện độc tính nhất định đối với gan. Các nghiên cứu cấu trúc - hoạt tính chỉ ra rằng khi gắn các nhóm thế ester của acid carboxylic vào nguyên tử nitơ ở vị trí số 3 kết hợp với các nhóm thế benzyl hoặc dị vòng tại vị trí carbon số 5 trên nhân thiazolidine-2,4-dione, độc tính đối với gan có thể được kiểm soát hiệu quả (tương tự dẫn xuất epalrestat được thương mại hóa). Xuất phát từ cơ sở thực tiễn và dược lý đó, tác giả Nguyễn Thị Thanh đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: "Tổng hợp một số ester chứa dị vòng thiazolidine-2,4-dione".

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được phân định rõ ràng:

  • Mục tiêu tổng quát: Tổng hợp một số hợp chất ester chứa dị vòng thiazolidine-2,4-dione.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Từ thiourea và chloroacetic acid tổng hợp thiazolidine-2,4-dione; tiếp tục chuyển hóa thành các dẫn xuất 5-benzylidenethiazolidine-2,4-dione; cuối cùng tổng hợp các diester tương ứng chứa dị vòng thiazolidine-2,4-dione.
    2. Khảo sát các hằng số vật lý và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được bằng các phương pháp phân tích phổ hiện đại bao gồm phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và phổ khối lượng (MS).
    3. Thăm dò hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các diester tổng hợp được bằng phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 9 hợp chất hữu cơ bao gồm thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_1}$); 4 dẫn xuất thế 5-benzylidene: 5-(4-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_{2a}}$), 5-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_{2b}}$), 5-(3-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_{2c}}$), 5-(5-bromo-2-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_{2d}}$); cùng 4 diester tương ứng ($\mathbf{T_{3a}}$, $\mathbf{T_{3b}}$, $\mathbf{T_{3c}}$, $\mathbf{T_{3d}}$).
  • Phạm vi nghiên cứu: Quy trình tổng hợp hữu cơ thực nghiệm, tính chất lý hóa (trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, hệ số lưu $R_f$), phân tích cấu trúc phổ và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7. Đề tài được hoàn thành vào tháng 5 năm 2017 tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, phối hợp phân tích đo phổ và thử nghiệm tế bào tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài gồm 4 nội dung chính:

  1. Thực hiện quy trình phản ứng nhiều giai đoạn: tổng hợp hợp chất trung gian $\mathbf{T_1}$, ngưng tụ Knoevenagel tạo chuỗi dẫn xuất $\mathbf{T_{2a-d}}$, và tiến hành ester hóa tạo các diester $\mathbf{T_{3a-d}}$.
  2. Khảo sát các đặc trưng vật lý thực nghiệm (trạng thái tồn tại, hệ dung môi kết tinh lại, nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết qua sắc ký bản mỏng TLC).
  3. Đo đạc và quy kết chi tiết các tín hiệu phổ nghiệm IR, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$ và LC-MS để khẳng định cấu trúc các hợp chất tạo thành.
  4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 100 $\mu\text{g/ml}$ bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học Sulforhodamine B (SRB).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Cơ sở lý thuyết

Dị vòng thiazolidine-2,4-dione ($\text{C}_3\text{H}_3\text{NO}_2\text{S}$) là hệ vòng 5 cạnh chứa dị tố lưu huỳnh tại vị trí 1, nitơ tại vị trí 3 và hai nhóm carbonyl ($>\text{C=O}$) tại vị trí 2 và 4. Hợp chất này có hiện tượng tautomer hóa đa dạng giữa các dạng ketone, enol và amide-imidol. Theo các tính toán nhiệt động lực học và dữ liệu nhiễu xạ tia X, dạng diketone có độ bền vượt trội so với các dạng oxo-enol hoặc thiazol (dienol). Về mặt phản ứng hóa học:

  • Vị trí carbon số 5 chứa nhóm methylene ($>\text{CH}_2$) nằm xen giữa nhóm carbonyl và dị tố lưu huỳnh, làm cho nguyên tử hydro ở vị trí $\alpha$ này có tính acid và độ linh động cao, dễ dàng tham gia phản ứng ngưng tụ Knoevenagel với các aldehyde thơm khi có mặt xúc tác base (piperidine) để tạo liên kết đôi exocyclic $-\text{C=C}-$.
  • Vị trí nitơ số 3 chứa nhóm $>\text{NH}$ có khả năng bị khử proton trong môi trường kiềm yếu hoặc vừa ($\text{K}_2\text{CO}3$) để trở thành tác nhân ái nhân (nucleophile), dễ dàng tham gia phản ứng thế ái nhân lưỡng phân ($\text{S}\text{N}2$) với các dẫn xuất halogen hữu cơ như ethyl chloroacetate.
  • Các nhóm thế hydroxy ($-\text{OH}$) gắn trên nhân thơm của benzaldehyde cũng đồng thời đóng vai trò là tâm ái nhân thứ hai sau khi bị kiềm hóa, cho phép phản ứng alkyl hóa gắn nhánh ester xảy ra đồng thời tại cả hai vị trí ($>\text{N}-\text{H}$ dị vòng và $-\text{OH}$ phenol), tạo cấu trúc diester.

Phương pháp nghiên cứu và quy trình thực nghiệm

Quy trình điều chế hóa học được xây dựng qua 3 giai đoạn phản ứng liên hoàn:

  1. Giai đoạn 1 - Tổng hợp $\mathbf{T_1}$: Phản ứng giữa chloroacetic acid (0,5 mol) và thiourea (0,5 mol) trong môi trường nước ở 20–25 °C tạo chất trung gian 2-iminothiazolidin-4-one, sau đó hồi lưu với acid hydrochloric đậm đặc ở 100–110 °C trong 10 giờ để đóng vòng và thủy phân tạo thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_1}$).
  2. Giai đoạn 2 - Tổng hợp các dẫn xuất 5-benzylidene ($\mathbf{T_{2a-d}}$): Phản ứng ngưng tụ Knoevenagel giữa $\mathbf{T_1}$ (0,02 mol) với các dẫn xuất hydroxybenzaldehyde tương ứng (0,02 mol: 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, 3-hydroxybenzaldehyde, 5-bromo-2-hydroxybenzaldehyde) trong dung môi toluene (50 ml), sử dụng 1 ml piperidine làm xúc tác bazơ. Hỗn hợp được hồi lưu ở nhiệt độ sôi kết hợp trang bị bộ bẫy tách nước Dean-Stark trong 10 giờ để loại bỏ nước sinh ra, thúc đẩy cân bằng chuyển dịch hoàn toàn về phía tạo sản phẩm.
  3. Giai đoạn 3 - Tổng hợp các diester ($\mathbf{T_{3a-d}}$): Thực hiện phản ứng thế $\text{S}\text{N}2$ giữa $\mathbf{T{2a-d}}$ ($5 \times 10^{-3}\text{ mol}$) và ethyl chloroacetate ($0,01\text{ mol}$, tỷ lệ mol 1:2) trong dung môi acetone khan (50 ml) với chất xúc tác bazơ $\text{K}_2\text{CO}_3$ khan nghiền nhỏ (1,38 g, 0,01 mol). Khảo sát phản ứng ở điều kiện hồi lưu 100 °C trong 10 giờ, lọc bỏ muối vô cơ $\text{KHCO}_3$, tủa trong nước lạnh và kết tinh phân đoạn lại trong ethanol.

Phương pháp phân tích và đánh giá sinh học

  • Đo nhiệt độ nóng chảy: Thực hiện trên máy Gallenkamp tại Phòng Thí nghiệm Hóa Đại cương, Đại học Sư phạm TP.HCM.
  • Sắc ký bản mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel với hệ pha động gồm hexan : ethyl acetate : methanol : nước ($4 : 2 : 0,4 : 0,05$, v/v/v/v) nhằm kiểm soát tiến trình phản ứng và độ tinh khiết của sản phẩm.
  • Phổ hồng ngoại (FTIR): Ghi trên máy Shimadzu FTIR 8400S dưới dạng viên nén KBr tại Khoa Hóa học, Đại học Sư phạm TP.HCM.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$): Đo trên thiết bị Bruker Avance ở tần số 500 MHz đối với proton và 125 MHz đối với carbon-13, sử dụng dung môi DMSO-$d_6$ tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
  • Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS): Đo trên máy Bruker micrOTOF-Q 10187 tại Phòng Phân tích Trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM.
  • Thử nghiệm độc tính tế bào: Thử nghiệm in vitro bằng kỹ thuật nhuộm Sulforhodamine B (SRB) trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (Hoa Kỳ, ATCC), nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh bò thai FBS 10%, kháng sinh penicillin/streptomycin ở 37 °C, 5% $\text{CO}_2$. Protein tế bào được cố định bằng dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 50% lạnh, nhuộm thuốc nhuộm acid SRB 0,2%, đo mật độ quang học (OD) trên máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu lý thuyết và thực nghiệm về thiazolidine-2,4-dione. Tác giả trình bày cấu tạo hóa học, độ dài liên kết và các góc liên kết ở pha khí và tinh thể rắn (theo tính toán lý thuyết ab initio và thực nghiệm tia X). Dị vòng này thể hiện tính chất phân cực mạnh với moment lưỡng cực lý thuyết đạt 0,774 dB (mức HF) và 0,567 dB (mức MP2). Hiện tượng tautomer hóa keto-enol và amide-imidol được phân tích sâu: khi có mặt các nhóm thế hút electron hay đẩy electron tại C-5, độ dài liên kết $\text{C=O}$ tại vị trí số 2 và 4 có thể kéo dài ra $0,006 \text{ Å}$, đồng thời các góc liên kết $\text{S}(1)-\text{C}(2)-\text{N}(3)$ và $\text{N}(3)-\text{C}(4)-\text{C}(5)$ tăng từ 0,4° đến 0,9°.

Bên cạnh đó, chương tổng quan tóm lược 5 con đường hóa học kinh điển điều chế thiazolidine-2,4-dione:

  • Đi từ alkyl thiocarbamates (hoặc carbon oxysulfide, xanthogenamide) phản ứng với $\alpha$-haloalkanoic acid.
  • Đi từ thiourea phản ứng với chloroacetic acid hoặc ester của nó (con đường phổ biến nhất).
  • Đi từ thiosemicarbazone trong môi trường sodium ethoxide.
  • Đi từ potassium thiocyanate và ethyl chloroacetate.
  • Đi từ ammonia và carbon disulfide tạo ammonium dithiocarbamate rồi ngưng tụ với sodium chloroacetate.

Chương này cũng tổng hợp sâu các hướng nghiên cứu biến tính hóa học cấu trúc thiazolidine-2,4-dione trên thế giới, bao gồm phản ứng ngưng tụ Knoevenagel tại vị trí C-5 với các aldehyde thơm đa dạng, phản ứng alkyl hóa/acyl hóa tại N-3, và tổng hợp các dẫn xuất lai hóa chứa vòng pyridine, oxadiazole, pyrazole hoặc pyrazolidine nhằm mở rộng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư và hạ đường huyết.

Chương II: Thực nghiệm

Chương thực nghiệm cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết của tất cả các quá trình tổng hợp và phân tích lý hóa. Tác giả mô tả chi tiết lượng mol, thể tích dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng và phương pháp cô lập, tinh chế sản phẩm cho từng chất:

  • Hợp chất $\mathbf{T_1}$ đạt hiệu suất cao (86%) khi kiểm soát tốt nhiệt độ giai đoạn đầu ở 0–5 °C và duy trì thời gian hồi lưu acid trong 10 giờ.
  • Chuỗi dẫn xuất $\mathbf{T_{2a-d}}$ thực hiện ngưng tụ với tỷ lệ mol tác chất 1:1, thời gian hồi lưu trong toluene là 10 giờ có tách nước liên tục.
  • Chuỗi diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ thực hiện với tỷ lệ mol chất nền : ethyl chloroacetate : $\text{K}_2\text{CO}_3$ là 1:2:2 trong acetone khan nhằm đảm bảo phản ứng thế hoàn toàn ở cả 2 vị trí nucleophile.

Chương này đồng thời trình bày các điều kiện vận hành máy móc thiết bị phân tích (nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp, hệ TLC, thông số máy đo FTIR Shimadzu, hệ phổ Bruker 500 MHz DMSO-$d_6$, LC-MS) và quy trình chuẩn của thử nghiệm sinh học tế bào SRB 96 giếng.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III tập trung phân tích kết quả tổng hợp, các đặc trưng vật lý và bằng chứng cấu trúc phổ nghiệm của 9 hợp chất:

Hợp chất Danh pháp hóa học Trạng thái, màu sắc Dung môi kết tinh $R_f$ Nhiệt độ nóng chảy (°C) Hiệu suất (%)
$\mathbf{T_1}$ Thiazolidine-2,4-dione Rắn, tinh thể kim trắng Nước 0,42 119–122 86
$\mathbf{T_{2a}}$ 5-(4-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione Rắn, bột vàng đậm Ethanol 0,38 294–296 81
$\mathbf{T_{2b}}$ 5-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione Rắn, bột vàng nâu ánh kim Ethanol 0,33 242–245 54
$\mathbf{T_{2c}}$ 5-(3-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione Rắn, bột vàng cam ánh kim Ethanol 0,36 258–260 72
$\mathbf{T_{2d}}$ 5-(5-bromo-2-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione Rắn, bột màu cam ánh kim Ethanol 0,40 256–258 75
$\mathbf{T_{3a}}$ Ethyl 2-(5-(4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)benzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate Rắn, tinh thể kim trắng ánh kim Ethanol 0,58 125–127 71
$\mathbf{T_{3b}}$ Ethyl 2-(5-(4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)-3-methoxybenzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate Rắn, tinh thể vảy vàng Ethanol 0,57 94–96 54
$\mathbf{T_{3c}}$ Ethyl 2-(5-(3-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)benzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate Rắn, tinh thể kim cam nhạt Ethanol : $\text{H}_2\text{O}$ (2:1) 0,56 96–97 52
$\mathbf{T_{3d}}$ Ethyl 2-(4-bromo-2-((3-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenoxy)acetate Rắn, tinh thể kim vàng nhạt Ethanol 0,60 118–119 72

Phân tích cấu trúc phổ chi tiết:

  • Phổ IR:
    • Hợp chất $\mathbf{T_1}$ xuất hiện dao động hóa trị $\text{N-H}$ ở $3472\text{ cm}^{-1}$, $\text{C}_{sp^3}\text{-H}$ ở $2947$ và $2816\text{ cm}^{-1}$, hai đỉnh carbonyl $\text{C=O}$ ở $1744$ và $1690\text{ cm}^{-1}$, liên kết $\text{C-N}$ ở $1227\text{ cm}^{-1}$.
    • Chuỗi $\mathbf{T_{2a-d}}$ xuất hiện vân hấp thụ phối hợp của liên kết $\text{O-H}$ và $\text{N-H}$ ở vùng $3155–3400\text{ cm}^{-1}$, vân carbonyl liên hợp ở $1674–1744\text{ cm}^{-1}$, liên kết đôi $\text{C=C}$ thơm ở $1450–1589\text{ cm}^{-1}$, riêng $\mathbf{T_{2d}}$ có thêm vân $\text{C-Br}$ đặc trưng ở $602\text{ cm}^{-1}$.
    • Chuỗi diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ hoàn toàn biến mất vân hấp thụ của nhóm $\text{N-H}$ và $\text{O-H}$. Thay vào đó, xuất hiện các vân dao động hóa trị nhóm alkyl $\text{C}_{sp^3}\text{-H}$ ($2854–2986\text{ cm}^{-1}$), vân $\text{C=O}$ ester và dione ($1674–1744\text{ cm}^{-1}$), dao động hóa trị $\text{C-O}$ ester ($1180–1219\text{ cm}^{-1}$).
  • Phổ $^1\text{H-NMR}$:
    • Hợp chất $\mathbf{T_1}$ chỉ có 2 mũi singlet ở $\delta = 4,15\text{ ppm}$ ($2\text{H}, -\text{CH}_2-$) và $\delta = 12,03\text{ ppm}$ ($1\text{H}, >\text{NH}$).
    • Chuỗi $\mathbf{T_{2a-d}}$ cho tín hiệu mũi đơn của proton $-\text{OH}$ phenol tại vùng trường rất yếu $\delta = 9,85–10,31\text{ ppm}$, proton $>\text{NH}$ ở $\delta = 12,50–12,63\text{ ppm}$, proton liên kết đôi benzylidene $(=\text{CH}-\text{Ar})$ ở $\delta = 7,65–7,89\text{ ppm}$, cùng hệ thống tách spin đặc trưng của proton nhân thơm benzene.
    • Chuỗi diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ không còn bất kỳ tín hiệu nào ở vùng $\delta > 9\text{ ppm}$ (khẳng định $\text{N-H}$ và $\text{O-H}$ đã phản ứng hết). Vùng trường mạnh xuất hiện đầy đủ các tín hiệu của 2 gốc ethyl ester: 2 nhóm methyl ($-\text{CH}_3$) ở $\delta = 1,20–1,29\text{ ppm}$ (tách mũi triplet, $J = 7,0\text{ Hz}$), 2 nhóm methylene liên kết oxy ($-\text{OCH}_2\text{CH}_3$) ở $\delta = 4,10–4,24\text{ ppm}$ (tách mũi quartet, $J = 7,0\text{ Hz}$). Hai nhóm methylene đính dị tố ($>\text{N}-\text{CH}_2-\text{CO}-$ và $-\text{O}-\text{CH}_2-\text{CO}-$) cho 2 mũi singlet sắc nhọn trong khoảng $\delta = 4,46–5,02\text{ ppm}$.
  • Phổ $^{13}\text{C-NMR}$: Hợp chất đại diện $\mathbf{T_{2d}}$ cho đủ 10 tín hiệu carbon; các diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ cho từ 16 đến 19 tín hiệu carbon tương ứng. Điển hình ở vùng trường yếu $\delta = 164–169\text{ ppm}$ có 4 tín hiệu carbon carbonyl phân biệt ($C_2, C_4, C_{3b}, C_{10b}$). Hai carbon của nối đôi exocyclic ($C_5, C_6$) nằm trong vùng thơm $\delta = 113–160\text{ ppm}$. Vùng trường mạnh thể hiện các tín hiệu carbon no $\text{C}_{sp^3}$ tương ứng của khung ethyl và methylene axetat.
  • Phổ khối lượng LC-MS: Sắc ký lỏng LC cho thấy 1 pic rửa giải duy nhất, chứng minh mẫu đã tinh sạch. Khối phổ phân giải cao HR-MS cho các pic ion phân tử đúng như tính toán lý thuyết:
    • $\mathbf{T_{3a}}$ ($\text{C}{18}\text{H}{19}\text{NO}_7\text{S}, M = 393,0882$): $[M + \text{Na}]^+ = 416,0762$.
    • $\mathbf{T_{3b}}$ ($\text{C}{19}\text{H}{21}\text{NO}_8\text{S}, M = 423,0988$): $[M + \text{Na}]^+ = 446,0867$.
    • $\mathbf{T_{3c}}$ ($\text{C}{18}\text{H}{19}\text{NO}_7\text{S}, M = 393,0882$): $[M + \text{Na}]^+ = 416,0745$.
    • $\mathbf{T_{3d}}$ ($\text{C}{18}\text{H}{18}\text{BrNO}_7\text{S}, M = 470,9987$): $[M + \text{H}]^+ = 472,0065$ và $[M + 2 + \text{H}]^+ = 474,0043$ với tỷ lệ cường độ tương đương $1:1$, đặc trưng cho sự hiện diện của một nguyên tử bromine ($^{79}\text{Br}$ và $^{81}\text{Br}$).
  • Thử nghiệm độc tính tế bào: Đánh giá trên dòng MCF-7 ở nồng độ 100 $\mu\text{g/ml}$ cho thấy khả năng ức chế thấp:
Mẫu thử nghiệm Tỷ lệ gây độc tế bào lần 1 (%) Tỷ lệ gây độc tế bào lần 2 (%) Tỷ lệ gây độc tế bào lần 3 (%) Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn (%)
$\mathbf{T_{3a}}$ 7,65 3,82 2,29 $4,59 \pm 2,73$
$\mathbf{T_{3b}}$ 10,24 4,27 2,13 $5,54 \pm 4,21$
$\mathbf{T_{3c}}$ 4,00 2,74 7,69 $4,81 \pm 2,52$
$\mathbf{T_{3d}}$ 5,54 5,23 -2,08 $2,90 \pm 4,70$

Chương IV: Kết luận

Khóa luận khẳng định đã hoàn thành đầy đủ các nội dung đề ra: tổng hợp thành công 9 hợp chất với hiệu suất tốt, xác định chuẩn xác thông số vật lý và cấu trúc phân tử qua tập hợp phổ nghiệm hiện đại. Tác giả kết luận các diester không thể hiện độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 đáng kể ở nồng độ khảo sát, đồng thời đặt ra triển vọng tiếp tục thăm dò các hoạt tính sinh học khác.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Thiết lập quy trình tổng hợp 3 giai đoạn ổn định, dễ thực hiện từ các hóa chất ban đầu cơ bản (chloroacetic acid, thiourea, hydroxybenzaldehyde, ethyl chloroacetate) với hiệu suất phân lập ở mức khá đến cao:
    • Hợp chất nền $\mathbf{T_1}$: hiệu suất đạt 86% ($50,25\text{ g}$).
    • Bốn dẫn xuất benzylidene $\mathbf{T_{2a-d}}$: hiệu suất đạt lần lượt 81% ($\mathbf{T_{2a}}$), 54% ($\mathbf{T_{2b}}$), 72% ($\mathbf{T_{2c}}$), 75% ($\mathbf{T_{2d}}$).
    • Bốn diester $\mathbf{T_{3a-d}}$: hiệu suất đạt lần lượt 71% ($\mathbf{T_{3a}}$), 54% ($\mathbf{T_{3b}}$), 52% ($\mathbf{T_{3c}}$), 72% ($\mathbf{T_{3d}}$).
  • Làm sáng tỏ các thông số phân tích vật lý và phổ nghiệm hoàn chỉnh: xác định hệ dung môi kết tinh phù hợp, đo điểm nóng chảy sắc nét cho từng chất, lập bảng quy kết chi tiết cho toàn bộ tín hiệu phổ hồng ngoại FTIR, phổ cộng hưởng từ proton $^1\text{H-NMR}$, phổ cộng hưởng từ carbon $^{13}\text{C-NMR}$ và khối phổ phân giải cao LC-MS.
  • Thu thập dữ liệu thử nghiệm sàng lọc sinh học in vitro định lượng: tỷ lệ gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 100 $\mu\text{g/ml}$ của cả 4 diester đều ở mức thấp ($\mathbf{T_{3a}}: 4,59%$; $\mathbf{T_{3b}}: 5,54%$; $\mathbf{T_{3c}}: 4,81%$; $\mathbf{T_{3d}}: 2,90%$).

Đóng góp mới của tác giả

Khóa luận đã tổng hợp thành công 5 hợp chất hữu cơ mới chưa từng được công bố trong các tài liệu tham khảo trước thời điểm nghiên cứu:

  1. 5-(5-bromo-2-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_{2d}}$).
  2. Ethyl 2-(5-(4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)benzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate ($\mathbf{T_{3a}}$).
  3. Ethyl 2-(5-(4-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)-3-methoxybenzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate ($\mathbf{T_{3b}}$).
  4. Ethyl 2-(5-(3-(2-ethoxy-2-oxoethoxy)benzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-yl)acetate ($\mathbf{T_{3c}}$).
  5. Ethyl 2-(4-bromo-2-((3-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenoxy)acetate ($\mathbf{T_{3d}}$).

Tất cả các chất mới này đều được cung cấp đầy đủ dữ liệu cấu trúc thực nghiệm, góp phần làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu hóa học hữu cơ về nhóm dị vòng thiazolidine-2,4-dione.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Hoạt tính sinh học của các hợp chất diester mới tổng hợp chỉ mới được khảo sát hạn chế trên một dòng tế bào ung thư duy nhất là ung thư vú MCF-7 và dừng lại ở một mốc nồng độ sàng lọc cố định (100 $\mu\text{g/ml}$), chưa mở rộng trên các dòng tế bào ung thư khác cũng như chưa khảo sát thang nồng độ rộng để thiết lập giá trị $\text{IC}_{50}$.
  • Nghiên cứu chưa tiến hành khảo sát các hoạt tính dược lý thế mạnh truyền thống của dị vòng thiazolidine-2,4-dione như ức chế aldose reductase, hoạt hóa PPAR$\gamma$, kiểm soát đường huyết hay kháng khuẩn, kháng nấm.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng thử nghiệm thăm dò các hoạt tính sinh học đa dạng khác của chuỗi diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ như hoạt tính hạ đường huyết in vitro/in vivo, chống oxy hóa (bắt gốc tự do DPPH), kháng viêm, ức chế enzyme đường khử, kháng khuẩn trên các chủng Gram-dương và Gram-âm, cũng như kháng nấm.
  • Khảo sát phản ứng thủy phân chọn lọc nhóm ester để chuyển hóa thành các dẫn xuất diacid tương ứng nhằm so sánh mối tương quan cấu trúc và hoạt tính sinh học giữa dạng ester và dạng acid tự do.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược, Hóa tổng hợp và Công nghệ sinh học dược phẩm.
  • Giá trị học thuật và thực tiễn:
    • Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về phản ứng ngưng tụ Knoevenagel sử dụng dung môi toluene có lắp đặt bộ bẫy tách nước Dean-Stark nhằm nâng cao hiệu suất phản ứng.
    • Cung cấp phương pháp tối ưu hóa phản ứng thế ái nhân $\text{S}_\text{N}2$ đa tâm (đồng thời trên nitơ dị vòng và oxy phenol) sử dụng hệ tác nhân base $\text{K}_2\text{CO}_3$ khan nghiền mịn trong dung môi acetone thuận lợi, dễ tinh chế.
    • Là tài liệu mẫu mực về phân tích và quy kết tín hiệu phổ nghiệm đa phương pháp ($^1\text{H-NMR}$ với việc biện luận tương tác spin-spin $^3J$ và $^4J$, $^{13}\text{C-NMR}$ phân định các đỉnh carbonyl tương tự nhau, FTIR và phân tích vạch đồng vị bromine trên phổ khối lượng MS).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao trong phản ứng tổng hợp diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ lại sử dụng $\text{K}_2\text{CO}_3$ khan nghiền nhỏ trong dung môi acetone?

$\text{K}_2\text{CO}_3$ được lựa chọn thay thế $\text{Na}_2\text{CO}_3$ vì ion $\text{K}^+$ có bán kính lớn hơn $\text{Na}^+$, làm mật độ điện tích nhỏ hơn, khiến liên kết giữa $\text{K}^+$ và anion nucleophile 5-(oxidobenzylidene)-2,4-dioxothiazolidin-3-ide kém bền hơn, dễ phân ly làm tăng nồng độ tác nhân ái nhân trong dung dịch. Cần dùng $\text{K}_2\text{CO}_3$ dạng khan và lượng vừa đủ vì nếu có nước, môi trường kiềm sẽ gây thủy phân các nhóm ester tham gia phản ứng và ester vừa tạo thành. Việc nghiền nhỏ $\text{K}_2\text{CO}3$ giúp tăng diện tích tiếp xúc do muối này ít tan trong dung môi aprotic như acetone. Acetone là dung môi thuận lợi cho cơ chế thế $\text{S}\text{N}2$ và có nhiệt độ sôi thấp, rất dễ bay hơi để loại bỏ khỏi sản phẩm sau phản ứng.

2. Vai trò của việc lắp đặt bộ dụng cụ tách nước trong phản ứng tổng hợp các dẫn xuất $\mathbf{T_{2a-d}}$ là gì?

Phản ứng giữa thiazolidine-2,4-dione ($\mathbf{T_1}$) và các dẫn xuất hydroxybenzaldehyde là phản ứng ngưng tụ Knoevenagel thuận nghịch, giải phóng một phân tử nước. Việc hồi lưu trong dung môi toluene (tạo hỗn hợp đẳng phí với nước) kết hợp sử dụng bộ bẫy tách nước Dean-Stark giúp liên tục loại bỏ nước ra khỏi hệ phản ứng, làm cho cân bằng hóa học chuyển dịch hoàn toàn sang chiều thuận theo nguyên lý Le Chatelier, giúp phản ứng đạt hiệu suất cao (54–81%) sau 10 giờ.

3. Dựa vào những dữ liệu phổ nghiệm nào để khẳng định phản ứng tạo thành diester $\mathbf{T_{3a-d}}$ đã xảy ra thành công?

  • Trên phổ IR: Hoàn toàn biến mất các vân hấp thụ đặc trưng của nhóm $>\text{NH}$ và nhóm $-\text{OH}$ ở vùng $3155–3400\text{ cm}^{-1}$; đồng thời xuất hiện vân hấp thụ mới của nhóm $\text{C}_{sp^3}\text{-H}$ ($2854–2986\text{ cm}^{-1}$) và $\text{C-O}$ ester ($1180–1219\text{ cm}^{-1}$).
  • Trên phổ $^1\text{H-NMR}$: Không còn các tín hiệu proton trường yếu của $-\text{OH}$ ($\delta \approx 9,8–10,3\text{ ppm}$) và $>\text{NH}$ ($\delta \approx 12,5–12,6\text{ ppm}$). Xuất hiện các mũi tín hiệu mới đặc trưng cho 2 nhóm ethyl ester gồm 2 nhóm methyl ($-\text{CH}_3$) ở $\delta \approx 1,2–1,3\text{ ppm}$ (triplet, $J = 7,0\text{ Hz}$), 2 nhóm methylene ($-\text{OCH}_2\text{CH}_3$) ở $\delta \approx 4,1–4,2\text{ ppm}$ (quartet, $J = 7,0\text{ Hz}$), và 2 nhóm methylene đính dị tố ($>\text{N}-\text{CH}_2-$ và $-\text{O}-\text{CH}_2-$) ở $\delta \approx 4,5–5,0\text{ ppm}$.
  • Trên phổ khối lượng MS: Xuất hiện đúng các pic ion phân tử tương ứng dạng $[M + \text{Na}]^+$ đối với $\mathbf{T_{3a-c}}$ và $[M + \text{H}]^+ / [M + 2 + \text{H}]^+$ đối với dẫn xuất chứa bromine $\mathbf{T_{3d}}$.

4. Khóa luận đã phát hiện và tổng hợp bao nhiêu hợp chất mới chưa từng có trong các tài liệu tham khảo trước đó?

Tác giả đã tổng hợp thành công 5 hợp chất mới chưa từng được ghi nhận trong các công trình nghiên cứu trước thời điểm công bố đề tài, bao gồm: hợp chất mono-hydroxy bromo hóa $\mathbf{T_{2d}}$ (5-(5-bromo-2-hydroxybenzylidene)thiazolidine-2,4-dione) và cả 4 hợp chất diester $\mathbf{T_{3a}}$, $\mathbf{T_{3b}}$, $\mathbf{T_{3c}}$, $\mathbf{T_{3d}}$. Cấu trúc của cả 5 hợp chất mới này đều được làm sáng tỏ và chứng minh chặt chẽ bằng các phương pháp phân tích phổ lý hóa hiện đại.

5. Kết quả thử nghiệm độc tính sinh học của các hợp chất $\mathbf{T_{3a-d}}$ trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 cho thấy điều gì?

Thử nghiệm bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) ở nồng độ 100 $\mu\text{g/ml}$ cho thấy tỷ lệ ức chế và gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của cả 4 mẫu đều rất thấp: $\mathbf{T_{3a}}$ đạt $4,59%$, $\mathbf{T_{3b}}$ đạt $5,54%$, $\mathbf{T_{3c}}$ đạt $4,81%$ và $\mathbf{T_{3d}}$ đạt $2,90%$. Kết quả này khẳng định các dẫn xuất diester tổng hợp được trong điều kiện khảo sát không thể hiện độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 cao đáng kể, gợi mở việc chuyển hướng khảo sát sang các hoạt tính sinh học khác như kiểm soát đường huyết hay kháng khuẩn, kháng nấm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thanh đã xây dựng thành công quy trình thực nghiệm điều chế chuỗi 9 hợp chất dị vòng chứa nhân thiazolidine-2,4-dione với hiệu suất ổn định, trong đó có 5 hợp chất mới hoàn toàn chưa từng được công bố trước đó. Toàn bộ cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp đều được xác định sáng tỏ thông qua hệ thống phổ nghiệm hiện đại gồm IR, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$ và LC-MS. Kết quả sàng lọc sinh học in vitro bằng phương pháp SRB đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm ban đầu cho thấy các diester này không thể hiện độc tính tế bào đáng kể trên dòng ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 100 $\mu\text{g/ml}$. Công trình đóng góp quy trình thực nghiệm tin cậy cùng tập dữ liệu phổ nghiệm giá trị cho việc tiếp tục mở rộng hướng nghiên cứu biến tính hóa học và dược lý trên khung dị vòng thiazolidine-2,4-dione.