Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao

Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao, góp phần nâng cao năng suất cây trồng.

• Tác giả: Trần Thị Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Ngọc Dung
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Khoa học Môi trường
• Đề tài: Nghiên Cứu Tuyển Chọn Và Sản Xuất Chế Phẩm Đơn Dòng Nấm Đối Kháng Trichoderma Phòng Trừ Tác Nhân Gây Bệnh Thối Đen Quả Ca Cao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: Nấm đối kháng Trichoderma spp.
• 1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp.
• 1.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp. lên các tác nhân gây bệnh cây trồng
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Phạm vi nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.4.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm
• 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao
• 3.2. Phân lập nấm Trichoderma sp. ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông
• 3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao
• 3.4. Khả năng ký sinh của nấm Trichoderma sp.
• 3.5. Khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm Trichoderma sp.
• 3.6. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp.
• 3.7. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao
• 3.7.1. Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp.
• 3.7.2. Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp.
• 3.7.3. Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối của nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí)
• 3.8. Đánh giá sức sống của nấm Trichoderma sp. sau bảo quản sản phẩm nhân sinh khối
• 3.9. Sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao

Cây ca cao (Theobroma cacao) là một trong những cây trồng quan trọng, nhưng thường xuyên bị ảnh hưởng bởi bệnh thối đen quả do nấm Phytophthora palmivora gây ra. Bệnh này không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hạt ca cao. Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma đã trở thành một giải pháp tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh này. Nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm gây bệnh, nhờ vào các cơ chế như ký sinh, sản sinh kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma và vai trò trong nông nghiệp

Nấm Trichoderma thuộc họ Moniliaceae, có khả năng phát triển mạnh mẽ trong môi trường đất. Chúng có thể sinh trưởng trên nhiều loại chất hữu cơ và có khả năng tiết ra các enzyme như chitinase và glucanase, giúp phân hủy vách tế bào của nấm bệnh. Điều này làm cho Trichoderma trở thành một lựa chọn lý tưởng trong việc phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng.

1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm nấm Trichoderma tại Việt Nam

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm nấm Trichoderma trong phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao vẫn còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Trichoderma có thể giảm thiểu thiệt hại do bệnh thối đen gây ra, đồng thời nâng cao năng suất cây trồng. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sẽ góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

II. Vấn đề và thách thức trong phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao

Bệnh thối đen quả ca cao là một trong những vấn đề nghiêm trọng nhất đối với ngành trồng ca cao. Nấm Phytophthora palmivora không chỉ gây hại cho quả mà còn ảnh hưởng đến toàn bộ cây trồng. Thiệt hại do bệnh này gây ra có thể lên đến 90%, tùy thuộc vào điều kiện môi trường và giống cây trồng. Việc tìm kiếm các biện pháp phòng trừ hiệu quả là rất cần thiết để bảo vệ năng suất và chất lượng ca cao.

2.1. Tác động của bệnh thối đen đến năng suất ca cao

Bệnh thối đen quả ca cao gây ra thiệt hại lớn cho nông dân, ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập và sinh kế của họ. Nấm Phytophthora palmivora có khả năng tấn công từ giai đoạn quả non đến khi quả chín, làm giảm năng suất và chất lượng hạt ca cao. Việc phát hiện sớm và áp dụng biện pháp phòng trừ kịp thời là rất quan trọng.

2.2. Các phương pháp phòng trừ bệnh thối đen hiện tại

Hiện nay, các phương pháp phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao chủ yếu dựa vào hóa chất, tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất có thể gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma là một giải pháp bền vững hơn, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

III. Phương pháp nghiên cứu chế phẩm nấm Trichoderma hiệu quả

Nghiên cứu chế phẩm nấm Trichoderma bao gồm nhiều bước từ phân lập, tuyển chọn đến sản xuất chế phẩm. Việc xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm Trichoderma là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả phòng trừ bệnh. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và thành phần dinh dưỡng cần được nghiên cứu kỹ lưỡng.

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma

Quá trình phân lập nấm Trichoderma từ đất và các mẫu bệnh là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các chủng nấm được phân lập sẽ được đánh giá khả năng đối kháng với nấm Phytophthora palmivora thông qua các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.

3.2. Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho sản xuất chế phẩm

Các điều kiện như nhiệt độ, độ ẩm, và pH sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo nấm Trichoderma phát triển tốt nhất. Việc nghiên cứu này sẽ giúp tạo ra chế phẩm có hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của chế phẩm nấm Trichoderma trong nông nghiệp

Chế phẩm nấm Trichoderma đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm này không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao mà còn nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy, việc áp dụng chế phẩm nấm Trichoderma có thể giảm thiểu thiệt hại do nấm bệnh gây ra một cách hiệu quả.

4.1. Kết quả nghiên cứu về hiệu quả của chế phẩm nấm Trichoderma

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma có thể giảm thiểu đáng kể thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao. Các thử nghiệm thực địa cho thấy, năng suất ca cao tăng lên rõ rệt khi áp dụng chế phẩm này, đồng thời chất lượng hạt cũng được cải thiện.

4.2. Lợi ích kinh tế từ việc sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma

Việc áp dụng chế phẩm nấm Trichoderma không chỉ giúp nông dân giảm thiểu thiệt hại do bệnh mà còn tiết kiệm chi phí cho việc sử dụng hóa chất. Điều này góp phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân và thúc đẩy phát triển bền vững trong ngành trồng ca cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu chế phẩm nấm Trichoderma

Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma là một hướng đi tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao. Với những lợi ích rõ rệt về hiệu quả phòng trừ và bảo vệ môi trường, chế phẩm này có thể trở thành một giải pháp bền vững cho ngành nông nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho nông dân và ngành trồng ca cao.

5.1. Triển vọng phát triển chế phẩm nấm Trichoderma trong tương lai

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma sẽ ngày càng được mở rộng. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện hiệu quả của chế phẩm và mở rộng ứng dụng trong nhiều loại cây trồng khác nhau.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu chế phẩm sinh học trong nông nghiệp bền vững

Nghiên cứu chế phẩm sinh học như nấm Trichoderma không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Việc phát triển các giải pháp sinh học sẽ là chìa khóa cho sự phát triển bền vững trong nông nghiệp, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về thực phẩm an toàn và chất lượng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây ca cao (Theobroma cacao L.) là cây công nghiệp lâu năm có giá trị kinh tế cao với tổng mức tiêu thụ hạt ca cao trên toàn cầu đạt trên 4 tỷ USD mỗi năm. Đáng chú ý, hơn 80% sản lượng ca cao thế giới được cung ứng từ các nông hộ quy mô nhỏ có diện tích canh tác dưới 1 ha. Tuy nhiên, sự bùng phát của dịch bệnh thối đen quả do nấm Phytophthora palmivora gây ra đang là mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với ngành sản xuất ca cao. Bệnh gây thiệt hại phổ biến từ 10% đến 30% sản lượng và có thể bùng phát phá hủy từ 90% đến 100% năng suất trong điều kiện mưa nhiều, gây tổn thất kinh tế ước tính hơn 1 tỷ USD hàng năm trên phạm vi toàn cầu.

Tại Việt Nam, cây ca cao phát triển mạnh tại Tây Nguyên và Đông Nam Bộ nhưng đang đối mặt với áp lực dịch hại nghiêm trọng. Khảo sát thực tế cho thấy tỷ lệ bệnh thối đen quả tại Đắk Lắk trung bình từ 25% đến 30%, cá biệt nhiều vườn bị nhiễm tới 65% - 70% dẫn đến mất trắng mùa vụ; tại Bình Phước tỷ lệ bệnh cũng dao động từ 20% đến 25%. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học như Boóc-đô hay Phosphonates vừa làm gia tăng chi phí sản xuất, vừa gây rửa trôi độc chất vào nguồn nước mùa mưa và làm suy thoái hệ vi sinh vật đất.

Xuất phát từ thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ khoa học môi trường của học viên Trần Thị Thúy đã thực hiện nghiên cứu tuyển chọn và xác lập quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma bản địa nhằm kiểm soát hiệu quả tác nhân Phytophthora palmivora. Đề tài được triển khai thu thập mẫu tại 3 tỉnh trọng điểm gồm Đắk Lắk, Đắk Nông và Bình Phước trong giai đoạn 2011 - 2013 thuộc khuôn khổ đề tài nghiên cứu cấp nhà nước mã số ĐTĐL.2011-G/63. Công trình có ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc tạo ra chế phẩm vi sinh an toàn sinh thái, nâng cao tỷ lệ phòng ngừa bệnh đạt trên 90% và thúc đẩy canh tác ca cao bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết kiểm soát sinh học (Biological Control) và sinh thái học vi sinh vật đất. Cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma spp. đối với các loài nấm bệnh truyền qua đất như Phytophthora palmivora được vận hành thông qua 4 cơ chế tương tác sinh học chính:

1. Hiện tượng ký sinh sợi nấm (Mycoparasitism): Sợi nấm Trichoderma nhận diện, tiếp xúc, cuốn chặt xung quanh sợi nấm bệnh, tạo thể giác bám đâm xuyên màng tế bào và phân giải toàn bộ chất nguyên sinh bên trong.
2. Hoạt tính kháng sinh sinh học (Antibiosis): Khả năng tiết ra các chất kháng sinh hòa tan và chất kháng sinh bay hơi như Gliotoxin, Viridin, Trichodermin nhằm kìm hãm trực tiếp sự phân chia tế bào và sinh trưởng của sợi nấm gây hại.
3. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian định cư (Competition): Khả năng chiếm lĩnh nhanh chóng bề mặt rễ cây và cơ chất hữu cơ trước khi mầm bệnh kịp xâm nhiễm.
4. Cơ chế ly giải enzyme (Lytic Enzymes): Hệ enzyme ngoại bào gồm ba thành phần chủ lực là Chitinase, β-1,3-Glucanase và Cellulase có khả năng thủy phân trực tiếp cấu trúc vách tế bào nấm bệnh.

Các khái niệm then chốt xuyên suốt đề tài bao gồm: nấm đối kháng đơn dòng, hiệu lực ức chế tản nấm, cơ chất lên men xốp bán rắn và hoạt độ enzyme phân giải sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu: Đề tài tiến hành thu thập tổng cộng 100 mẫu đất quanh vùng rễ của những cây ca cao khỏe mạnh tại 3 tỉnh gồm Bình Phước (40 mẫu), Đắk Lắk (40 mẫu) và Đắk Nông (20 mẫu), đồng thời thu nhận các mẫu quả và mô thân mang triệu chứng bệnh thối đen.
• Phương pháp chọn mẫu: Mẫu đất được lấy ở 4 hướng xung quanh tán cây, gạt bỏ lớp mùn bề mặt từ 10 cm đến 15 cm và thu thập đất ở độ sâu từ 20 cm đến 25 cm. Mỗi điểm điều tra lấy đại diện 3 cây khỏe, mỗi cây lấy 4 mẫu đơn (khoảng 1 kg/mẫu) rồi trộn đều tạo mẫu hỗn hợp đại diện 1 kg chuyển về phòng thí nghiệm.
• Phương pháp phân lập và đánh giá in vitro: Phân lập Phytophthora palmivora bằng kỹ thuật mồi bẫy sinh học sử dụng quả ca cao xanh (đạt hiệu quả bẫy 78,0%) kết hợp môi trường chọn lọc. Phân lập Trichoderma theo phương pháp pha loãng mẫu đất trên môi trường PDA, CMA và PRBA. Đánh giá tính đối kháng ký sinh và kháng sinh bay hơi bằng phương pháp nuôi cấy đối xứng kép trên đĩa Petri 9 cm. Đo hoạt độ enzyme Chitinase, β-Glucanase và Cellulase thông qua đường kính vòng phân giải với thuốc thử Lugol.
• Lý do lựa chọn và xử lý số liệu: Các phương pháp thực nghiệm in vitro cho phép kiểm soát chính xác các yếu tố môi trường như nhiệt độ từ 15°C đến 35°C, độ pH từ 4 đến 7 và chu kỳ chiếu sáng 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối. Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT, so sánh phân hạng khác biệt Duncan ở mức ý nghĩa thống kê P ≤ 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có giá trị khoa học và ứng dụng cao:

1. Phân lập và tuyển chọn chủng ưu tú: Từ 100 mẫu đất vùng rễ ca cao, nghiên cứu phân lập được 12 nguồn nấm Trichoderma sp. (đạt tỷ lệ 12,0%), trong đó tuyển chọn được 5 nguồn triển vọng mang ký hiệu Tr-H (Krông Ana, Đắk Lắk), Tr-tv (Đắk Mil, Đắk Nông), Tr-1, Tr-2 và Tr-3.
2. Khả năng đối kháng và ức chế vượt trội: Trong thử nghiệm đối kháng trực tiếp, chủng Tr-H thể hiện hiệu lực ký sinh mạnh nhất khi ức chế tới 92,9% sự phát triển của Phytophthora palmivora sau 6 ngày nuôi cấy (đường kính tản nấm bệnh chỉ còn 0,4 cm so với 8,6 cm của đối chứng). Chủng Tr-tv đạt hiệu quả ức chế 85,8% (đường kính 0,9 cm), vượt trội so với các chủng Tr-1 (69,7%) và Tr-2 (73,8%). Thử nghiệm kháng sinh bay hơi cũng ghi nhận chủng Tr-H đạt hiệu quả ức chế kỷ lục 92,9% (đường kính nấm bệnh chỉ đạt 0,6 cm so với đối chứng 8,5 cm).
3. Hoạt tính phân giải enzyme ngoại bào mạnh mẽ: Cả hai chủng Tr-H và Tr-tv đều sở hữu hoạt lực enzyme rất cao với đường kính vòng phân giải Cellulase đạt 4,8 cm, Chitinase đạt từ 4,6 cm đến 4,7 cm và β-Glucanase đạt từ 4,7 cm đến 4,8 cm.
4. Xác lập ngưỡng sinh thái và thông số lên men tối ưu: Môi trường PDA cho mật độ bào tử cao nhất đạt 592 x 10^7 bào tử/ml sau 3 ngày; dải nhiệt độ tối ưu từ 25°C đến 30°C cho mật độ bào tử đạt 48 x 10^8 bào tử/ml ở 25°C; pH tối ưu từ 5 đến 6 cho mật độ 36 x 10^8 bào tử/ml. Chế độ ánh sáng xen kẽ 12 giờ sáng và 12 giờ tối cho lượng bào tử đạt 36 x 10^8 bào tử/ml, cao hơn 28,6% so với chiếu sáng liên tục (28 x 10^8 bào tử/ml).

Thảo luận kết quả

Khả năng ức chế vượt trội của chủng Tr-H và Tr-tv bắt nguồn từ sự phối hợp đồng thời giữa hệ enzyme tiêu hủy vách tế bào và các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi. Khi sợi nấm Trichoderma tiếp cận Phytophthora palmivora, enzyme Chitinase và β-1,3-Glucanase lập tức phá vỡ màng bảo vệ, kết hợp với độc tố sinh học làm tế bào nấm bệnh bị teo tóp, phân rã hoàn toàn chỉ sau 6 đến 8 ngày cấy chung.

Kết quả này hoàn toàn tương đồng và mở rộng các nghiên cứu quốc tế cũng như các thử nghiệm trên nấm Phytophthora botryosa gây hại cao su (đạt hiệu lực 84,8% - 93,4%) và Phytophthora capsici gây chết nhanh hồ tiêu (đạt hiệu lực 63% - 70%). Để minh họa trực quan, các dữ liệu đối kháng có thể được thể hiện qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ ức chế phần trăm giữa 5 chủng nấm, và bảng ma trận tương quan giữa độ pH đất (từ 4 đến 7) với mật độ sinh khối bào tử nhằm định hướng ứng dụng thực địa chính xác.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình nhân sinh khối bán rắn quy mô nông hộ và công nghiệp: Ứng dụng cơ chất hạt gạo hoặc hỗn hợp gạo và bột ngô với độ ẩm dao động từ 54% đến 56%, duy trì nhiệt độ nuôi cấy từ 25°C đến 28°C và chế độ cấp khí đảo trộn định kỳ để đạt mật độ bào tử tiêu chuẩn trên 10^9 bào tử/g sau 10 đến 15 ngày lên men. Đơn vị thực hiện: Các trung tâm khuyến nông và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học, triển khai trong thời gian 6 đến 12 tháng.
2. Ứng dụng công nghệ đóng gói hút chân không trong bảo quản: Tiến hành đóng gói chế phẩm nấm Trichoderma đơn dòng trong bao bì màng phức hợp hút chân không ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C nhằm duy trì tỷ lệ sống của bào tử đạt trên 85% sau 6 tháng lưu kho. Đơn vị thực hiện: Cơ sở sản xuất vi sinh, hoàn thiện quy chuẩn trong 3 đến 6 tháng.
3. Phối trộn chế phẩm vi sinh với phân hữu cơ bón gốc định kỳ: Bón định kỳ vào đầu và giữa mùa mưa với liều lượng từ 2 kg đến 3 kg phân chuồng hoai mục chứa 10^7 CFU/g nấm đối kháng cho mỗi gốc ca cao, kết hợp thiết kế mương thoát nước sâu 1,5 m nhằm triệt tiêu nguồn bệnh Phytophthora tồn đọng trong đất. Đơn vị thực hiện: Nông dân và hợp tác xã trồng ca cao tại Đắk Lắk, Bình Phước, áp dụng thường xuyên hàng vụ.
4. Triển khai mô hình phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM trên diện rộng: Thay thế dần thuốc hóa học độc hại bằng việc phun phòng định kỳ dung dịch chế phẩm Trichoderma nồng độ 0,3% - 0,5% lên thân và quả non 1 lần/tháng trong mùa mưa, đặt mục tiêu giảm tỷ lệ thối đen quả xuống dưới 5% trên diện tích 10.000 ha ca cao trong 2 đến 3 năm tới. Đơn vị thực hiện: Cục Bảo vệ Thực vật phối hợp Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ Thực vật các tỉnh Tây Nguyên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Khoa học Môi trường, Bảo vệ Thực vật, Vi sinh vật học: Tiếp cận phương pháp luận khoa học về tuyển chọn vi sinh vật đối kháng bản địa, kỹ thuật bẫy sinh học chuyên biệt đạt hiệu quả 78,0% và các phương pháp định tính enzyme in vitro phục vụ đề tài nghiên cứu chuyên sâu.
2. Kỹ sư nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các doanh nghiệp chế phẩm sinh học: Khai thác các thông số kỹ thuật tối ưu về nhiệt độ từ 25°C đến 30°C, độ pH 5 - 6 và độ ẩm môi trường lên men nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm đạt mật độ trên 10^9 bào tử/g.
3. Cán bộ khuyến nông và kỹ thuật viên nông nghiệp tại các địa phương: Sử dụng số liệu và quy trình thực nghiệm để biên soạn tài liệu hướng dẫn kỹ thuật phòng trừ bệnh thối đen quả ca cao, giảm thiểu thiệt hại từ mức 25% - 30% xuống dưới ngưỡng gây hại kinh tế cho bà con nông dân.
4. Chủ trang trại và hợp tác xã sản xuất ca cao bền vững: Nắm bắt phương pháp tự ủ phân hữu cơ vi sinh kết hợp nấm đối kháng Trichoderma, giúp cắt giảm từ 30% đến 40% chi phí phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật, hướng đến tiêu chuẩn chứng nhận hữu cơ quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao nấm Phytophthora palmivora lại gây thiệt hại nặng nề lên tới 90% - 100% trên vườn ca cao? Loài nấm này có khả năng hình thành du động bào tử bơi lội nhanh trong nước và bào tử hậu tồn tại lâu trong đất. Trong mùa mưa ẩm ướt nhiệt độ từ 16°C đến 32°C, nấm chỉ mất từ 3 đến 5 ngày để xâm nhiễm và làm thối đen toàn bộ quả non lẫn quả chín.

Nấm Trichoderma tiêu diệt tác nhân gây thối đen quả ca cao thông qua những cơ chế nào? Trichoderma hoạt động qua 4 cơ chế: ký sinh quấn quanh và đâm thủng sợi nấm bệnh, tiết kháng sinh bay hơi ức chế tản nấm đạt hiệu quả 92,9%, cạnh tranh dưỡng chất vùng rễ và tiết enzyme Chitinase, β-Glucanase phân hủy trực tiếp vỏ tế bào nấm hại.

Tại sao đất chua có độ pH bằng 4 lại làm giảm hiệu quả của chế phẩm Trichoderma? Thực nghiệm chứng minh ở pH 4, tốc độ sinh trưởng của sợi nấm Trichoderma bị ức chế nặng nề chỉ đạt 0,4 cm/ngày và hoàn toàn không thể hình thành bào tử. Do đó, cần bón vôi khử chua nâng pH lên mức 5 - 6 để nấm phát huy mật độ tối đa đạt 36 x 10^8 bào tử/ml.

Điều kiện môi trường nào giúp nhân nuôi nấm Trichoderma đạt mật độ sinh khối cao nhất? Nấm đạt mật độ bào tử tối ưu khi được nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng ở nhiệt độ từ 25°C đến 30°C (cho mật độ 48 x 10^8 bào tử/ml), độ pH từ 5 đến 6 và chu kỳ quang 12 giờ sáng kết hợp 12 giờ tối (đạt 36 x 10^8 bào tử/ml).

Chủng nấm Trichoderma Tr-H có thể ứng dụng phòng trừ bệnh cho các cây trồng khác không? Chủng Tr-H sở hữu hoạt tính enzyme ngoại bào cực mạnh (đường kính vòng phân giải 4,6 - 4,8 cm), có khả năng ức chế diện rộng đối với các loài nấm đất nguy hiểm như Phytophthora capsici trên hồ tiêu, Phytophthora botryosa trên cao su và Rhizoctonia solani trên cây họ đậu.

Kết luận

• Phân lập thành công 12 nguồn nấm Trichoderma từ 100 mẫu đất tại Đắk Lắk, Đắk Nông và Bình Phước, tuyển chọn được 2 chủng ưu tú nhất là Tr-H và Tr-tv.
• Chủng Tr-H thể hiện hiệu lực ức chế nấm Phytophthora palmivora đạt 92,9% qua cả hai phương thức ký sinh trực tiếp và sinh kháng sinh bay hơi.
• Hoạt tính phân giải enzyme ngoại bào của hai chủng ưu tú đạt mức xuất sắc với đường kính vòng phân giải Cellulase 4,8 cm và Chitinase từ 4,6 cm đến 4,7 cm.
• Xác lập dải thông số sinh thái tối ưu cho sản xuất sinh khối gồm nhiệt độ 25°C - 30°C, pH 5 - 6 và chu kỳ 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối cho mật độ đạt tới 48 x 10^8 bào tử/ml.
• Thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm sinh học đơn dòng bán rắn ổn định, tạo nền tảng vững chắc để chuyển giao công nghệ vào thực tiễn sản xuất.

Nghiên cứu của học viên Trần Thị Thúy đã cung cấp giải pháp khoa học toàn diện, mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng chế phẩm sinh học bản địa thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Kế hoạch tiếp theo trong 12 đến 24 tháng tới là mở rộng thử nghiệm chế phẩm Tr-H trên diện tích 50 ha vườn ca cao kinh doanh tại Tây Nguyên. Hãy chủ động ứng dụng chế phẩm sinh học Trichoderma ngay hôm nay để bảo vệ mùa màng, nâng cao chất lượng hạt ca cao và kiến tạo nền nông nghiệp xanh bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Nấm đối kháng Trichoderma spp. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp. Giống nấm Trichoderma Pers.

thuộc họ Moniliaceae, bộ moniliales, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes. Nấm Trichoderma có sợi nấm dạng bò lan, không màu hay sáng màu. Sợi nấm sinh trưởng, phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng, có cành bào tử đơn bào không mầu. Cành bào tử phân nhánh và các nhánh này thường mọc đối xứng nhau hoặc theo nhiều phía.

Trên cành bào tử thường có cuống đính bào tử. Cuống đính bào tử hình chai. Bào tử hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu, có cấu tạo đơn bào. Bào tử có thành dầy.

Kích thước bào tử thay đổi tùy loài phổ biến từ 3,0 µm đến 4,0 µm. Đây là các nấm đối kháng sống trong đất. Thường quan sát thấy nấm Trichoderma tồn tại trong đất ở dạng sợi nấm hoăc bào tử. Bào tử có rất nhiều trong đất ẩm.

Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt. Khuẩn lạc Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng 5 - 7 ngày. Trên môi trường PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 250C, khuẩn lạc nấm Trichoderma ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử xuất hiện.

Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra sắc tố có màu vàng trên môi trường PGA. Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc trưng như Trichoderma viride tạo mùi dừa. Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia. Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 - 300C, một số loài phát triển tốt ở 350C thậm chí ở 400C.

Thủy phần của môi trường lên men xốp sinh khối của Trichoderma thích hợp là 54 - 56 %. pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 là 5 - 6, khi pH > 6 sinh trưởng của nấm yếu, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu. Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma cần có điều kiện thoáng khí vì vậy sau khi vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp bằng cách lắc để chúng không kết lại thành mảng. Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được.

Hình thái nấm Trichoderma sp. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp. lên các tác nhân gây bệnh cây trồng [35, 40, 48]. Nấm đối kháng Trichoderma có nhiều trong đất và được biết rõ đến hiệu quả trong việc kiểm soát các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Botrytis cinerea.

Cơ chế trực tiếp liên quan đến hiệu quả đối kháng là sự cạnh tranh, sinh kháng sinh và ký sinh. Tùy thuộc vào loài nấm Trichoderma mà tạo ra các loại kháng sinh khác nhau. Nấm Trichoderma viride sinh ra kháng sinh: viridin, trichodermin, xosukacylin, almatecin hoặc các vitamin, cacbonhydrat, nitơ nhờ vậy làm đất tốt. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Các chất kháng sinh này có thể ở dạng bay hơi hoặc không bay hơi, khi tiết ra đều ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh ở mức độ khác nhau.

Nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma có khả năng sản sinh các enzym Chitinase và -glucanase với hàm lượng cao, đây là 2 enzym thủy phân vách tế bào của các loài nấm gây bệnh rất mạnh. Theo Jollès và Muzzarelli, 1999, các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium. cho hàm lượng chitinase cao. Chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho cây trồng.

Nấm Trichoderma khi ký sinh nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase. Các chủng nấm mốc Trichoderma, Aspergillus, Candida albicans, Sclerotium glucanicum.có khả năng sản sinh -glucanase cao, đặc biệt là nấm Trichoderma. -glucanase của Trichoderma giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh để đối kháng nấm gây bệnh cây trồng. -1,3-glucanase ở Trichoderma kìm hãm quá trình sinh tổng hợp -1,3- glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh.

Tác động đối kháng của nấm Trichoderma đối với vi sinh vật gây bệnh cây được thông qua bởi một số cơ chế sau đây: - Cơ chế ký sinh: Theo R.Weindling mô tả từ năm 1932 (Adams, 1990; Snyder và cộng sự, 1976), tác giả gọi đó là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm bệnh, cuối cùng mới thấy nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh bên trong sợi nấm bệnh. Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá hủy từng phần hoặc hoàn toàn.

Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Hiện tượng tan rã Kitin có ở vùng xung quanh nơi xâm nhập của nấm Trichoderma (Dubey, 1995; Inbar và cộng sự, 1996; Mikala-Doukaga và cộng sự, 1979; Rousseau và cộng sự, 1996). Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bào tử đính của nấm Trichoderma sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành được thể giác bám. Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ.

Tỉ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma với nấm vật chủ (Inbar và cộng sự, 1996; Pereverzeva và cộng sự, 1995). - Cơ chế kháng sinh: Nấm Trichoderma có khả năng sinh ra một số kháng sinh. Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng là khác nhau giống. Một số chất kháng sinh do Trichoderma sinh ra bao gồm: + Gliotoxin: là chất kháng sinh được R.

Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum tạo thành. Trichoderma sinh kháng sinh Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao. Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều trong dịch môi trường. Sự tích luỹ tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn phát triển sớm của nấm Trichoderma.

Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, pisi; Botrytis, R. + Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động sống của chúng (Bilai, 1974; Martin và cộng sự, 1975; Seiketov, 1982). Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945 ( Seiketov, 1982). Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao.

Ngoài ra, đã xác định được một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma sinh ra như: chất kháng sinh U-21693 được Meyer phát hiện năm 1996. Năm 1975, ở Nhật Bản, các tác giả Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2 chất kháng sinh: Trichoderma và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T. Nấm Trichoderma còn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh dễ bay hơi có hoạt tính sinh lý cao. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 - Tác động của men: Nhiều loài Trichoderma có khả năng sinh ra men phân giải (như men laminarinaza, chitinaza,…) (Score và cộng sự, 1994).

Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma có thể tiết ra những loại men gây suy biến thành tế bào nấm gây bệnh cho cây như men  -(1-3)-glukanase và chitinaza (Chet và cộng sự, 1981 và Jones &Watson, 1969-dẫn theo Martin và cộng sự, 1985; Chet và cộng sự, 1981, 1983). - Cơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nấm gây bệnh cây. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm gây bệnh (Green và cộng sự, 1996; Martin và cộng sự, 1985).

Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp. đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng [35, 40, 48]. Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của nấm Trichoderma viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea. Ngày nay, người ta còn biết sử dụng nấm Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora,.) và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất (như Botrytis cinerea).

Bliss (1959); Ohr và cộng sự (1973), cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất, quần thể Trichoderma trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide. Well và các cộng sự (1962) lần đầu tiên công bố sử dụng một số lượng lớn Trichoderma được nuôi trồng trên môi trường rắn ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng để kiểm soát nấm Sclerotium rolfsii trên cà chua. Barkman và Rodriguez Kabano (1975) nuôi trồng T.harzianum bằng phương pháp thương mại, các giá thể chứa nấm được rải xuống đất dọc theo các hàng đậu với lượng 112 – 140 kg/ha sau 70 - 100 ngày sau khi gieo đậu. Với lượng 140 kg/ha, T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng năng suất lên trong khoảng 3 năm.

Nấm Trichodema hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm R.solani (Chet và Baker, 1980; 1981) và 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 phân lập từ đất tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất (Lumsden, 1977). Nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt nấm R.solani nhưng trong môi trường T.harzianum diệt được nấm này (Nelson và cộng sự, 1983), đây là vai trò chính của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học. Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trên cây trồng.