Khóa luận Dược sĩ: Nghiên cứu tổng hợp Rilpivirin Hydroclorid - ĐH Dược Hà Nội

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu quy trình tổng hợp Rilpivirin Hydroclorid. Tài liệu trình bày đầy đủ phương pháp, kết quả và phân tích phổ liên quan.

• Tác giả: Đinh Thị Thu Hương
• Người hướng dẫn: Bùi Thị Phương Mai
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu tổng hợp Rilpivirin Hydroclorid
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Rilpivirin Hydroclorid

Rilpivirin hydroclorid là một thuốc ức chế men sao chép ngược không nucleosid (NNRTI) được sử dụng trong điều trị HIV/AIDS. Đây là một hợp chất dẫn xuất benzonitril có cấu trúc phân tử phức tạp, được phát triển thông qua các nghiên cứu tổng hợp hóa dược hiện đại. Rilpivirin hydroclorid có khả năng ức chế hiệu quả hoạt động của men sao chép ngược, giúp kiểm soát sự nhân lên của virus HIV trong cơ thể. Thuốc này đã được FDA chấp phê và được sử dụng rộng rãi trong các phác đồ điều trị HIV kết hợp. Các đặc tính dược động học của rilpivirin hydroclorid bao gồm sinh khả dụng cao, thời gian bán thải dài, cho phép dùng hàng ngày với liều duy nhất. Kiểm nghiệm chất lượng theo tiêu chuẩn dược điển Việt Nam đảm bảo độ tinh khiết và hiệu lực của sản phẩm cuối cùng.

1.1. Đặc điểm chung của Rilpivirin Hydroclorid

Rilpivirin hydroclorid có công thức phân tử C22H18N6O với khối lượng phân tử 366.41 g/mol. Đây là một hợp chất có cấu trúc không đối xứng, chứa nhóm amino, cyano và các vòng benzen thay thế. Tính chất vật lý bao gồm dạng hình thể tinh thể trắng, độ tan trong nước tốt nhờ dạng muối hydroclorid. Tính chất hóa học cho thấy sự ổn định trong điều kiện bình thường, nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ cao. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nghiêm ngặt đảm bảo độ sạch và chất lượng phù hợp với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam.

1.2. Cơ chế hoạt động chống HIV

Rilpivirin hoạt động bằng cách ức chế hoạt động của men sao chép ngược HIV type 1 (RT). Thuốc này liên kết với vị trí não trong enzyme RT, ngăn chặn quá trình sao chép RNA-dependent RNA polymerase. Cơ chế này khác biệt với NRTI vì nó không cần được phosphoryl hóa. Rilpivirin có độ chọn lọc cao đối với RT của HIV-1 và có hoạt động giảm hoặc không có đối với RT của HIV-2. Sự kết hợp với các thuốc khác trong phác đồ kết hợp tạo ra hiệu quả điều trị tối ưu, giúp giảm khả năng phát triển kháng thuốc.

II. Các phương pháp Tổng hợp Rilpivirin Hydroclorid

Quá trình tổng hợp rilpivirin hydroclorid bao gồm nhiều bước phản ứng phức tạp, bắt đầu từ nguyên liệu đầu vào mesitylen. Đầu tiên, nguyên liệu trải qua các phản ứng nitro hóa để tạo chất trung gian 3,5-dimethyl-4-nitrobenzaldehyd (4e). Tiếp theo, chất này được khử để tạo ra 4-amino-3,5-dimethylbenzaldehyd (2f) thông qua các điều kiện khử phù hợp. Bước quan trọng tiếp theo là phản ứng Wittig-Horner để tạo thành (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril. Cuối cùng, sản phẩm trải qua các bước xử lý để tạo thành rilpivirin hydroclorid hoàn chính. Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc và độ tinh khiết.

2.1. Tổng hợp chất trung gian Benzonitril

Chất trung gian 3,5-dimethyl-4-nitrobenzaldehyd được tổng hợp từ mesitylen thông qua phản ứng nitro hóa. Quá trình này sử dụng các điều kiện phản ứng kiểm soát chặt chẽ để đạt hiệu suất cao. Chất trung gian này là bước khởi đầu quan trọng cho các phản ứng tiếp theo. Độ tinh khiết xác định bằng sắc ký lớp mỏng là yếu tố thiết yếu. Các điều kiện như nhiệt độ, thời gian phản ứng, tỷ lệ chất khử ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm cuối.

2.2. Các bước chuyển đổi quan trọng

Phản ứng khử nhóm nitro thành nhóm amino sử dụng các chất khử như hydrogen và xúc tác, hoặc các phương pháp khác như sử dụng SnCl2/HCl. Phản ứng Wittig-Horner là bước then chốt tạo liên kết C=C trong cấu trúc acrylonitril. Điều này yêu cầu cơ sở mạnh như K2CO3 hoặc Cs2CO3 và dung môi thích hợp như THF hoặc DMF. Hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào lựa chọn hóa chất, điều kiện phản ứng và quy mô thực nghiệm. Việc tối ưu hóa các bước này là mục tiêu chính của nghiên cứu tổng hợp.

III. Kiểm nghiệm và Xác định Cấu trúc

Kiểm nghiệm chất lượng rilpivirin hydroclorid thực hiện theo các tiêu chuẩn khắt khe của Dược điển Việt Nam. Các phương pháp phân tích bao gồm kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xác định độ ẩm theo phương pháp Karl Fischer, và xác định điểm nóng chảy. Phổ hồng ngoại (IR) cung cấp thông tin về các nhóm chức năng quan trọng như C≡N, C=O, N-H, C-H. Phổ khối lượng (MS) xác định khối lượng phân tử chính xác và cấu trúc mảnh. Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cả ¹H-NMR và ¹³C-NMR cho thông tin chi tiết về cấu trúc carbon-hydro trong phân tử. Các dữ liệu này được so sánh với các tài liệu tham khảo để khẳng định cấu trúc.

3.1. Phân tích Phổ hồng ngoại IR

Phổ hồng ngoại của rilpivirin hydroclorid cho thấy các dải hấp thụ đặc trưng: nhóm cyano (C≡N) xuất hiện ở vùng 2200-2260 cm⁻¹, nhóm amino (N-H) ở 3300-3500 cm⁻¹, các dải dao động đối xứng và không đối xứng của C-H trong benzene ở vùng 1500-1600 cm⁻¹. Hệ số lưu giữ (Rf) trong sắc ký lớp mỏng được sử dụng để xác định độ tinh khiết và so sánh với mẫu chuẩn. Các dải hấp thụ đặc trưng này xác nhận sự hiện diện của các nhóm chức năng mong đợi.

3.2. Phân tích Phổ khối lượng MS và NMR

Phổ khối lượng cho thấy ion phân tử (M+) tương ứng với khối lượng phân tử 366 (hoặc 402 cho dạng hydroclorid), cùng các ion mảnh đặc trưng. ¹H-NMR hiển thị các tín hiệu proton từ nhóm amino, các proton trên benzene, và các nhóm methyl thay thế. ¹³C-NMR xác định số lượng và vị trí các carbon khác nhau, bao gồm carbon trong nhóm cyano (vùng 100-120 ppm). Độ dịch chuyển hóa học (δ) so sánh với tài liệu tham khảo để khẳng định cấu trúc phân tử chính xác.

IV. Ứng dụng và Hướng Phát triển Nghiên cứu

Rilpivirin hydroclorid đã chứng minh hiệu quả cao trong điều trị HIV/AIDS, đặc biệt khi kết hợp với các thuốc ức chế protease (PI) và thuốc ức chế sao chép ngược nucleosid (NRTI). Ứng dụng lâm sàng của rilpivirin bao gồm điều trị bệnh nhân HIV mới được chẩn đoán và bệnh nhân có khả năng dung nạp tốt với các phác đồ kết hợp. Các hướng nghiên cứu tương lai tập trung vào phát triển các dạng bào chế mới như viên nén dài hạn, các dẫn xuất cải tiến với hoạt động tốt hơn, và khảo sát các cơ chế kháng thuốc mới. Tối ưu hóa quá trình tổng hợp nhằm giảm chi phí sản xuất, cải thiện hiệu suất phản ứng và giảm tác động môi trường. Nghiên cứu về các hợp chất tương tự cấu trúc có tiềm năng hoạt động chống retrovirut hoặc chống các bệnh khác.

4.1. Ứng dụng lâm sàng trong điều trị HIV

Rilpivirin hydroclorid được sử dụng trong các phác đồ điều trị HIV kết hợp với nồng độ đạt cực đại (Cmax) và thời gian đạt nồng độ tối đa (Tmax) được xác định bằng các nghiên cứu sinh khả dụng. Diện tích dưới đường cong (AUC) phản ánh tích lũy toàn bộ thuốc trong cơ thể. Hiệu quả lâm sàng phụ thuộc vào tuân thủ điều trị và liều lượng phù hợp. Rilpivirin thích hợp cho bệnh nhân không có kháng thuốc hoặc có số lần đột biến giới hạn.

4.2. Tiểu kỳ vọng về phát triển công nghệ tổng hợp

Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nhằm giảm chi phí sản xuất và cải thiện khả năng mở rộng quy mô cho sản xuất hàng loạt. Phát triển các phương pháp xanh sử dụng các dung môi và chất tác xúc thân thiện với môi trường. Nghiên cứu các dẫn xuất mới có hoạt động chống các chủng HIV kháng thuốc. Cải thiện quy trình tinh chế để đạt độ tinh khiết cao hơn với chi phí thấp hơn, góp phần sản xuất thuốc giá rẻ cho các quốc gia đang phát triển.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về rilpivirin hydroclorid 1. Đặc điểm chung của rilpivirin hydroclorid Rilpivirin (TMC278) là một chất ức chế men sao chép ngược không nucleosid thế hệ thứ hai (NNRTI), là thành phần trong thuốc điều trị kết hợp cho bệnh nhân nhiễm HIV-1 kháng retrovirus, với hiệu lực cao hơn, thời gian bán hủy dài hơn và giảm tác dụng phụ so với các NNRTI cũ như efavirenz [13], [19]. ✓ Tên khoa học: + Dạng base: 4-((4-(4-((E)-2-cyanoethenyl)-2,6-dimethylanilino) pyrimidin-2-yl) amino) benzonitril.

+ Dạng muối: 4-[(4-[(4-[(E)-2-cyanoethenyl]-2,6-dimethylphenyl) amino] pyrim-idinyl]-2-yl) amino] benzonitril monohydroclorid. ✓ Công thức cấu tạo: Hình 1.1: Công thức cấu tạo của rilpivirin monohydroclorid 1. Dạng base ✓ Cảm quan: Tinh thể màu trắng hơi vàng, dễ hút ẩm và nhạy cảm với ánh sáng. Dưới ánh sáng, trong dung dịch acid yếu, 8% đồng phân E chuyển đổi thành đồng phân Z [18].

✓ Nhiệt độ nóng chảy: 241-243oC [34]. ✓ Độ tan: Tan kém trong nước (20 ng/mL at pH 7.0), tan trung bình trong PEG 400 (40mg/L), tan tốt trong dimethyl sulfoxide (>50 mg/mL) [18]. ✓ Tính base: pKa = 5,6 [18]. ✓ Hệ số phân bố octanol/ nước: logP = 4,86 [18].

Dạng muối ✓ Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng. ✓ Nhiệt độ nóng chảy: 315 oC. 3 ✓ Độ tan: rất ít tan trong nước (0,01 g/L). ✓ Hệ số phân bố octanol/ nước: logP = 4,53.

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm rilpivirin Tiêu chuẩn kiểm nghiệm rilpivirin monohydroclorid: Cảm quan, cấu trúc tinh thể, định tính bằng IR, định tính clorid theo dược điển Châu Âu, định lượng dược chất, hàm lượng tạp (HPLC), lượng dung môi tồn dư (GC), độ ẩm, kích thước tiểu phân, kim loại nặng, tro sulfat [7]. Cơ chế hoạt động: Rilpivirin là một NNRTI của HIV-1. Hoạt động của rilpivirin ức chế không cạnh tranh với men sao chép ngược HIV-1 (RT). Có ái lực cao với HIV-1 chủng tự nhiên và kháng NNRTI thế hệ I.

Không ức chế các DNA polymerase α, β và γ của tế bào người [35]. Enzym RT HIV-1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo chuỗi DNA từ chuỗi đơn ARN của virus. Cấu tạo của enzym này gồm 2 tiểu đơn vị là p51 và p66, tiểu đơn vị p66 có hoạt tính ADN polymerase và RNase H. Rilpivirin liên kết với phần kị nước gần vị trí hoạt động của enzym làm xoay các chuỗi bên của acid amin Tyr181, Tyr188 (của p66) về vị trí xúc tác, dẫn đến sự dịch chuyển đồng thời của tấm β4–β7–β8 và 3 acid aspartic có hoạt tính xúc tác đi khoảng 2Å.

Những thay đổi cấu trúc này được cho là cơ sở ức chế hoạt động của enzym. Rilpivirin tạo phức với HIV-1 RT, cấu trúc phân tử và hình dạng không gian cho phép nó tiến sâu hơn vào trong túi liên kết NNRTI về phía acid amin Trp229 (ở tiểu đơn vị p66) so với etravirin [12]. Tác dụng của rilpivirin được cải thiện trên các chủng HIV-1 tự nhiên và đột biến có thể liên quan đến tương tác cụ thể của nhóm cyano ở cánh I (nhóm -vinylnitril) của phân tử với vòng indol của Trp229 trong vùng kị nước của men RT, đồng phân (E) cho khả năng tương tác tốt hơn so với đồng phân (Z) [18]. Ngoài ra, tính linh động của góc giữa vòng anilin và nhóm cyanovinyl cho phép rilpivirin liên kết với enzym phiên mã ngược có chứa đột biến kháng thuốc [18].

Các phương pháp tổng hợp rilpivirin hydroclorid Qua tham khảo các tài liệu, các phương pháp tổng hợp rilpivirin hydroclorid đều đi qua chất rilpivirin base bằng phương pháp acid hóa chất này bởi tác nhân HCl trong dung môi hữu cơ. Dưới đây, các phương pháp tổng hợp rilpivirin base đã công bố [17], [25], [14],[32] được khái quát theo sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng quát một số quy trình tổng hợp Rilpivirin Để tổng quát, chúng tôi chia các phương pháp tổng hợp Rilpivirin theo 3 hướng như hình 1.3 dưới đây: 5 Hình 1.3: 3 hướng tổng hợp Rilpivirin X - nhóm rời đi là halogen, triflat, tosylat, … trong đó thường sử dụng nhất là cloro. Trong đề tài này, chúng tôi lựa chọn hướng 1: Tổng hợp (A) và (A1), xuất phát điểm từ những nguyên liệu rẻ, dễ kiếm, các phản ứng dễ tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm. Tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril (A) Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril (A) Năm 2002, nhóm nghiên cứu của hãng dược phẩm Tibotec lần đầu tiên đưa ra quá trình tổng hợp rilpivirin thông qua sáng chế WO2003016306A1 [17] trong đó các phương pháp tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril (A) bắt đầu từ các hợp chất 1a, 1b, 1c.

Phương pháp 1 (1a → A): Từ chất 4-bromo-2,6-dimethylphenylamin (1a) ban đầu phản ứng với acrylamid với sự có mặt của palladium acetat, tris (2- methylphenyl) phosphine và N,N-diethylethanamin để tạo thành hợp chất 2a. Amid 2a được tạo thành bằng cách khử nước với tác nhân phosphoryl clorid để tạo A với hiệu suất 67% mà không đề cập đến tỷ lệ đồng phân E/Z. 7 Phương pháp 2 (1b → A): Phương pháp này liên quan đến việc bảo vệ nhóm amin của 4-bromo-2,6-dimemylphenylarnin (1b) bằng cách chuyển đổi thành Ν,Ν- dimethylmethanimidamid (1b). Tiếp theo là quá trình tạo formyl với n – butyl lithium trong DMF.

Dẫn chất formyl 2b thu được xử lý với diethyl (cyanometyl) photphonat để tạo ra hợp chất cyanoethenyl 3b. Sau đó nhóm bảo vệ được loại bỏ bằng kẽm clorua để tạo ra chất trung gian (A) có tỷ lệ E/Z không được tiết lộ. Quá trình này bao gồm các phản ứng tổng hợp phức tạp như: bảo vệ amin bằng cách chuyển nó thành imid, sử dụng butyl liti nhạy cảm cao với độ ẩm, do đó phản ứng tạo formyl hóa có năng suất thấp. Các phối tử phosphin đắt tiền, độc hại với môi trường khi sản xuất với quy mô lớn.

Phương pháp 3 (1c → A): Sử dụng 4-iodo-2,6-dimethylphenylamin (1c) làm nguyên liệu ban đầu để tổng hợp chất trung gian A, 1c được cho phản ứng với acrylonitril trong ít nhất 12 giờ ở 130oC với sự có mặt của CH3COONa, xúc tác Pd/C. Cô đặc dung môi sau phản ứng, sau đó kết tinh lại trong dung môi thích hợp thu được A. Phương pháp này cũng không cung cấp bất kỳ chi tiết nào về tỷ lệ E/Z của sản phẩm trung gian không bão hòa (A). Mặc dù phương pháp 3 đã tránh sử dụng các phối tử phosphin nhưng thời gian phản ứng kéo dài và vấn đề về sự sẵn có của các dẫn xuất halo-phenylamin tinh khiết cùng với hiệu suất vừa phải, cản trở khả năng áp dụng ở quy mô công nghiệp của phương pháp này.

Để khắc phục các vấn đề nêu trên, nhằm mục tiêu: ✓ Tổng hợp chất A có tỉ lệ đồng phân Z <0,5% bằng một quy trình công nghiệp thuận tiện, hiệu quả về chi phí. ✓ Không sử dụng đến dẫn chất phosphin độc hại với môi trường. ✓ Không sử dụng các chất nhạy cảm với độ ẩm như n-butyl lithium. Theo nghiên cứu của Mukund Keshav Gurjar và cộng sự trong sáng chế WO2012143937A2 [25] (phương pháp 4: 1d → A) (hình 1.4): Nhóm amin của hợp chất 1d được bảo vệ bằng tác nhân CbzCl trong PhMe ở 30oC tạo 2d, tiếp đó 2d được khử nhóm nitro thành amin bằng tác nhân SnCl2 với methanol làm dung môi tạo thành 3d.

3d sau đó được diazo hóa bằng NaNO2 trong HCl, sau đó hợp chất diazo hóa này được xử lý bằng NaBF4 để tạo muối tetrafluoroborat 4d. Hợp chất 4d sau khi được tạo thành tiếp tục phản ứng với acrylonitril, xúc tác Pd(OAc)2 trong dung môi methanol tạo 5d. Sau cùng 5d được khử loại bỏ nhóm bảo vệ để tạo thành A có đồng phân Z <0,5%.5: Sơ đồ tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril (A) Hình 1.5 khái quát 2 hướng tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril (A) từ nguyên liệu mesitylen. Bước đầu tiên của 2 phương pháp là phản ứng nitro hóa bằng tác nhân acylnitrat tạo sản phẩm 1,3,5-trimethyl-2-nitro benzen, sau đó sản phẩm này được phản ứng theo 2 phương pháp tạo A.

Phương pháp 1e → A (xem hình 1.5): 3,5-trimethyl-2-nitro benzen được oxy hóa bằng tác nhân CrO3 trong dung môi acid acetic băng thu được dẫn xuất acid benzoic 1e. Ester hóa 1e bằng ethanol, xúc tác acid sulforic đặc thu được hợp chất ester 2e. Dẫn xuất alcol 3e được tạo ra khi cho 2e phản ứng với tác nhân khử NaBH4, xúc tác methanol. Sau đó 3e được oxy hóa tạo dẫn chất aldehyd 4e bằng mangan dioxit.

Hợp chất 4e được tiến hành phản ứng Horner bằng tác nhân diethyl (cyanomethyl) phosphonat thu được sản phẩm 5e. Cuối cùng khử nhóm nitro của 5e bằng Fe trong dung dịch amoni clorid thu được A [5]. 9 Phương pháp từ 1f → A (xem hình 1.5): Chất 1,3,5-trimethyl 2-nitro benzen phản ứng với anhydrid cromic trong anhydrid acetic, acid acetic, xúc tác acid sulfuric đặc tạo thành chất 1f. Sau đó khử 1f bằng Fe trong dung dịch amoni clorid thu được 2f.

2f tiến hành phản ứng Horner bằng tác nhân diethyl (cyanomethyl) phosphonat thu được sản phẩm A [2]. HCl (xem hình 1.5): Chất A được hòa tan với IPA, thêm từ từ HCl khí trong IPA đến khi pH= 4, làm lạnh hỗn hợp phản ứng, khuấy liên tục trong 5 giờ. Cô loại thu hồi dung môi thu được chất rắn, đem kết tinh lại trong hệ dung môi n-hexan: EtOAc. Lọc, sấy thu được A.

Hai phương pháp trên tuy dài, hiệu suất còn chưa cao, nhưng xuất phát từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm là mesitylen. Các phản ứng diễn ra ở điều kiện khá dễ dàng ở điều kiện phòng thí nghiệm. Tổng hợp dẫn chất benzonitril (A1) Hướng 1: Hình 1.6: Sơ đồ tổng hợp A1 Nguyên liệu 2-thioxo-2,3-dihydropyrimidin-4(1H)-on (6) được hoạt hóa với NaOH trong dung môi cồn nước, sau đó thêm từ từ tác nhân iodomethan thu được sản phẩm 7. 7 được tiến hành phản ứng thế nucleophin bằng p-aminobenzonitril, phản ứng được tiến hành ở 180oC thu được sản phẩm 8.

Cloro hóa 8 bằng POCl3, đun hồi lưu, thu được hợp chất A1’. Phương pháp này khá ngắn và đơn giản, hiệu suất 47% [16], [15]. 10 Tuy nhiên việc sử dụng POCl3 là một chất độc hại cho sức khỏe và môi trường, xử lý mùi khó chịu của methanthiol do nhiễm vào sản phẩm, cùng với điều kiện phản ứng thế nucleophilic diễn ra khá khắc nghiệt (180oC) khiến cho giá thành sản xuất rilpivirin hiện nay khá cao. Theo patent CN107162987A, 8 được bromo hóa bằng dung dịch HBr 40% trong acid acetic thu được A1’’ [33], nhược điểm của quy trình này là nguyên liệu HBr/ CH3COOH đắt, nên khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.7: Sơ đồ tổng hợp A1’ trong patent WO2006125809.

Phản ứng ngưng tụ giữa 1-(4-cyanophenyl) guanidin (9) với diethyl malonate trong NMP, xúc tác natri acetat, đun hồi lưu ở 155o-160oC thu được hợp chất 11. Chất 11 được cho phản ứng với nước, xúc tác acid acetic ở nhiệt độ cao cho sản phẩm 8. Tương tự hướng 1, 8 được cloro hóa bằng tác nhân POCl3 thu được A1’ [26]. Tuy tổng hiệu suất của hướng 2 là 58.5%, nhưng với việc bắt đầu bằng một nguyên liệu đắt tiền khiến hướng 2 khó áp dụng trong sản xuất công nghiệp.