Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc và sản phẩm tế bào gốc trung mô trong chữa lành vết thương

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu study on synthesis of combination of silver nanoparticles and mesenchymal stem cell products for, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Hoài
• Người hướng dẫn: Prof. Nguyễn Hoàng Lương
• Trường học: Vietnam Japan University
• Chuyên ngành: Nanotechnology
• Đề tài: Study On Synthesis Of Combination Of Silver Nanoparticles And Mesenchymal Stem Cell Products For Wound Healing
• Loại tài liệu: Master's Thesis
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• INTRODUCTION
• 1. CHAPTER 1: OVERVIEW
• 1.1. Cutaneous wound and wound healing process
• 1.2. The normal wound healing process
• 1.3. The two therapeutic targets in wound treatment
• 1.4. AgNPs – an outstanding antimicrobial and anti-inflammatory agent in the inflammation phase
• 1.4.1. AgNPs as a topical antimicrobial agent
• 2. CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Overview of experimental design
• 2.2. Preparation of AgNPs
• 2.3. Synthesis of AgNPs
• 2.4. Characterization of AgNPs
• 2.5. Evaluation of the antimicrobial activity of AgNPs
• 2.6. Determination of the cytotoxic effect of AgNPs on NIH 3T3 cell
• 2.7. Preparation of CM and effect of CM on NIH 3T3 migration in vitro
• 2.7.1. Preparation of CM
• 2.7.2. Effect of CM on NIH 3T3 migration - Scratch assay in vitro
• 2.8. Skin wound model in vivo
• 2.8.1. Deep partial-thickness burn wound model
• 2.8.2. Excisional wound model
• 3. CHAPTER 3: RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Characterization of AgNPs
• 3.2. UV-Vis spectra
• 3.3. Evaluation of the antimicrobial activity of AgNPs
• 3.4. Sterility of AgNPs
• 3.5. Antimicrobial effect of AgNPs
• 3.6. Cytotoxic effect of AgNPs solution on NIH 3T3 cells in vitro
• 3.7. Effect of CM on NIH 3T3 migration - Scratch assay in vitro
• 3.8. Skin wound model in vivo
• 3.9. Deep second-degree burn model
• CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô

Nghiên cứu về hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong việc chữa lành vết thương. Hạt nano bạc được biết đến với khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, trong khi tế bào gốc trung mô cung cấp các yếu tố sinh học cần thiết cho quá trình hồi phục. Sự kết hợp giữa hai phương pháp này hứa hẹn sẽ mang lại những kết quả khả quan trong việc điều trị các vết thương khó lành.

1.1. Hạt nano bạc và tính chất của chúng trong y học

Hạt nano bạc (AgNPs) có kích thước nhỏ, thường từ 1 đến 100 nm, và có khả năng kháng khuẩn vượt trội. Chúng hoạt động bằng cách giải phóng ion bạc, gây tổn thương cho màng tế bào vi khuẩn và ức chế sự phát triển của chúng. Nghiên cứu cho thấy AgNPs có thể giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng trong quá trình chữa lành vết thương.

1.2. Tế bào gốc trung mô và vai trò của chúng trong chữa lành

Tế bào gốc trung mô (MSCs) có khả năng tự tái tạo và phân hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng sản xuất ra các cytokine và yếu tố tăng trưởng, giúp thúc đẩy quá trình tái tạo mô và làm giảm viêm. Việc sử dụng sản phẩm từ MSCs, như môi trường điều kiện (CM), có thể tăng cường khả năng chữa lành vết thương.

II. Vấn đề trong việc chữa lành vết thương hiện nay

Chữa lành vết thương là một thách thức lớn trong y học hiện đại. Các vết thương mãn tính, như loét chân do tiểu đường, thường khó điều trị và dễ bị nhiễm trùng. Sự gia tăng tuổi tác, bệnh lý nền và tình trạng dinh dưỡng kém là những yếu tố làm chậm quá trình hồi phục. Do đó, cần có những giải pháp mới để cải thiện hiệu quả chữa lành.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chữa lành

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến khả năng chữa lành vết thương, bao gồm tình trạng sức khỏe tổng quát của bệnh nhân, sự hiện diện của nhiễm trùng, và khả năng cung cấp máu đến khu vực bị thương. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

2.2. Thách thức trong việc điều trị vết thương mãn tính

Vết thương mãn tính thường không đáp ứng tốt với các phương pháp điều trị truyền thống. Sự kháng thuốc của vi khuẩn và sự thiếu hụt các yếu tố sinh học trong môi trường vết thương là những thách thức lớn. Cần có các liệu pháp mới, như sự kết hợp giữa AgNPs và MSCs, để cải thiện kết quả điều trị.

III. Phương pháp nghiên cứu hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp tổng hợp và phân tích để đánh giá hiệu quả của hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô trong việc chữa lành vết thương. Các thí nghiệm được thực hiện trên mô hình vết thương in vitro và in vivo để xác định khả năng chữa lành và tính an toàn của các sản phẩm này.

3.1. Quy trình tổng hợp hạt nano bạc

Hạt nano bạc được tổng hợp thông qua các phương pháp hóa học đơn giản, cho phép kiểm soát kích thước và hình dạng của hạt. Các yếu tố như nồng độ, nhiệt độ và thời gian phản ứng được tối ưu hóa để đạt được hạt nano bạc có tính chất mong muốn.

3.2. Đánh giá hiệu quả của tế bào gốc trung mô

Các sản phẩm từ tế bào gốc trung mô được thu thập và phân tích để xác định nồng độ cytokine và yếu tố tăng trưởng. Các thí nghiệm trên tế bào NIH 3T3 được thực hiện để đánh giá khả năng di chuyển và tái tạo mô của tế bào dưới tác động của môi trường điều kiện từ MSCs.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô

Sự kết hợp giữa hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô có thể mở ra những hướng đi mới trong điều trị vết thương. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng đồng thời hai phương pháp này có thể tăng cường khả năng chữa lành và giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng. Điều này đặc biệt quan trọng trong điều trị các vết thương mãn tính.

4.1. Kết quả nghiên cứu trên mô hình in vitro

Các thí nghiệm in vitro cho thấy sự kết hợp giữa AgNPs và CM từ MSCs có tác dụng tích cực trong việc thúc đẩy quá trình di chuyển và tái tạo mô của tế bào. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng của phương pháp này trong điều trị vết thương.

4.2. Kết quả nghiên cứu trên mô hình in vivo

Nghiên cứu trên mô hình động vật cho thấy sự cải thiện rõ rệt trong quá trình chữa lành vết thương khi sử dụng AgNPs kết hợp với CM. Tốc độ hồi phục nhanh hơn và giảm thiểu tình trạng viêm nhiễm là những kết quả đáng khích lệ từ nghiên cứu này.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về hạt nano bạc và tế bào gốc trung mô cho thấy tiềm năng lớn trong việc cải thiện quá trình chữa lành vết thương. Sự kết hợp giữa hai phương pháp này không chỉ giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn mà còn thúc đẩy quá trình tái tạo mô. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra những giải pháp mới cho việc điều trị các vết thương khó lành.

5.1. Triển vọng ứng dụng trong lâm sàng

Việc áp dụng các sản phẩm từ AgNPs và MSCs trong lâm sàng có thể mang lại những lợi ích lớn cho bệnh nhân. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để xác định tính an toàn và hiệu quả của các phương pháp này trong điều trị thực tế.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng để khám phá thêm các cơ chế hoạt động của AgNPs và MSCs, cũng như phát triển các sản phẩm kết hợp mới. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình chữa lành vết thương và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI VIETNAM JAPAN UNIVERSITY NGUYEN THI THANH HOAI STUDY ON SYNTHESIS OF COMBINATION OF SILVER NANOPARTICLES AND MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCTS FOR WOUND HEALING MASTER'S THESIS LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI VIETNAM JAPAN UNIVERSITY NGUYEN THI THANH HOAI STUDY ON SYNTHESIS OF COMBINATION OF SILVER NANOPARTICLES AND MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCTS FOR WOUND HEALING MAJOR: NANOTECHNOLOGY CODE: 8440140.11QTD RESEARCH SUPERVISORS: Prof. NGUYEN HOANG LUONG Associate Prof. HOANG THI MY NHUNG Hanoi, 2020 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ACKNOWLEDGMENTS First of all, I would like to express my deepest gratitude to my supervisors Prof. Nguyen Hoang Luong and Assoc.

Hoang Thi My Nhung for their enthusiastic guidance and inspiration throughout the implementation of the thesis. I also wish to thank Assoc. Nguyen Hoang Nam, Dr. Luu Manh Quynh (Center for Materials Science, VNU University of Science), Dr.

Le Tra My, MSc. Bui Thi Van Khanh (Department of Cell Biology, VNU University of Science) for the wholehearted instruction and useful suggestion. Besides, I am extremely grateful to Dr. Than Thi Trang Uyen (Vinmec Research Institute of Stem Cell and Gene Technology, Vinmec Health Care System) for all her support.

My sincere thanks to lecturers in the Nanotechnology program for their helpful instruction when I have learned at Vietnam Japan University. I am truly thankful for all the encouragement from my family and my friends. My thesis would not be done without their support. Finally, I would like to thank my classmates and my friends from Vietnam Japan University, VNU University of Science, Vinmec Research Institute of Stem Cell and Gene Technology who help me accomplish this thesis.

Hanoi, July 2020 Student Nguyen Thi Thanh Hoai i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGMENTS. i TABLE OF CONTENTS .ii LIST OF FIGURES. iv LIST OF TABLES. v LIST OF ABBREVIATIONS.

Cutaneous wound and wound healing process. The normal wound healing process. The two therapeutic targets in wound treatment. AgNPs – an outstanding antimicrobial and anti-inflammatory agent in the inflammation phase.

AgNPs as a topical antimicrobial agent. AgNPs as an anti-inflammatory agent. Concerned factors for using AgNPs in wound treatment. Effect of particle size.

Effect of capping agents. Products derived from MSC - cytokines and growth factors-modulated agent in wound healing. Stem cells and mesenchymal stem cells. What are stem cells (SCs)?.

Mesenchymal stem cells (MSCs). Products derived from MSCs. MSC-derived conditioned medium (CM) in wound healing. Combined using of silver nanoparticles and bio-factors for wound healing.

17 CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS. Overview of experimental design. Preparation of AgNPs. Synthesis of AgNPs.

Characterization of AgNPs. Evaluation of the antimicrobial activity of AgNPs. Determination of the cytotoxic effect of AgNPs on NIH 3T3 cell. Preparation of CM and effect of CM on NIH 3T3 migration in vitro.

Preparation of CM. Effect of CM on NIH 3T3 migration - Scratch assay in vitro. Skin wound model in vivo. 29 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Deep partial-thickness burn wound model. Excisional wound model. 33 CHAPTER 3: RESULTS AND DISCUSSION. Characterization of AgNPs.

UV-Vis spectra. Evaluation of the antimicrobial activity of AgNPs. Sterility of AgNPs. Antimicrobial effect of AgNPs.

Cytotoxic effect of AgNPs solution on NIH 3T3 cells in vitro. Effect of CM on NIH 3T3 migration - Scratch assay in vitro. Skin wound model in vivo. Deep second-degree burn model.

51 CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES. 60 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF FIGURES Page Figure 1. Phases in wound healing. The types of wound treatment applied for different wound categories.

Mechanism of antimicrobial action of AgNPs. Factors impacted their cytotoxicity. MSC capacity of differentiation. Overall experimental design of the study.

Schematic procedure of AgNPs synthesis. Examination of 4 media on NIH 3T3 cells migration. Analysis of wound images by Image-J. Analysis of wound area by Image-J.

Determination of wound area based on the stage of healing process. XRD pattern of synthesized AgNPs. TEM image shows the morphology of AgNPs and sizes of particles ranged from 10 to 45 nm. UV-Vis spectra of synthesized AgNPs.

Agar plate without detection of microbial colony. AgNPs plates with less of microorganisms than the Control (-) plates. Morphology of NIH 3T3 cells. Image of 96-well plate after SRB staining.

Cell viability measured by SRB assay on NIH 3T3 cells. Effect of 4 media on the migration of fibroblast cells. The migration rate of fibroblast treated with 4 media. The healing process of burn wounds in mice.

Statistical analysis of healing rate of burn wounds at day 23 and day 30 after creating burns. Values are represented as mean ± SD.13 Uneven healing rate in the MSC group. Statistical analysis of healing rate of excisional wounds with different treatments. The healing rate of excisional wounds.53 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF TABLES Page Table 1.1: Topical antimicrobial agents for wound healing .2: Effect of AgNPs size on cytotoxicity.

Number and size of microbial colonies in each group. Descriptive qualitative assessment for the healing process in the burn model. 50 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF ABBREVIATIONS AgNPs Silver nanoparticles CM Conditioned medium DFUs Diabetic foot ulcers DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium EGF Epidermal growth factor ECM Extracellular matrix EVs Extracellular vesicles FBS Fetal bovine serum fcc Face centered cubic FDA Food and Drug Administration hUCB CM Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell conditioned medium hUCB MSCs Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells IL-1, IL-6, IL-8 Interleukin-1, Interleukin-6, Interleukin-8 IGF Insulin-like growth factor KGF Keratinocyte growth factor MSCs Mesenchymal stem cells OD Optical density PDGF Platelet-derived growth factor ROS Reactive oxygen species SDF Stromal cell-derived factor SRB Sulforhodamine B TEM Transmission electron microscopy TGF-α, TGF-β Transforming growth factor α, transforming growth factor β TSC Trisodium citrate UV-Vis Ultraviolet visible spectroscopy XRD X-ray diffraction vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] INTRODUCTION Wounds are a silent burden on the healthcare system. In 2018, Medicare beneficiaries analyzed that around 8.2 million people who have at least one type of wounds.

Wounds often classified into acute (traumatic, abrasions, surgical) and chronic wounds (diabetic foot ulcers (DFUs), leg ulcers, and pressure ulcers) based on healing time. The challenges of healing wounds are the increase of infection, age and pathological background of the patient. Hence, we need to come up with novel strategies to solve these problems. Over the past few decades, silver nanoparticles (AgNPs) attract rapt attention in wound treatment due to various featured natures such as the history of using silver, simple and effective synthesized methods, and above all the outstanding antimicrobial activity.

These make AgNPs become one of the most widely used agents for preventing infection. On the other hand, mesenchymal stem cells (MSCs) and products derived from MSCs, which appear as advanced therapies, have recently been studied and applied in the field of medicine. In terms of wound healing, many studies suggest that paracrine signaling of MSCs rather than tissue differentiation and engraftment is a pivotal element for promoting wound healing. That indicates the capacity to use conditioned medium (CM), which is one of the products derived from MSCs for wound treatment.

CM contains a variety of cytokines, growth factors, chemokines that modulate the healing process through induction of re-epithelialization, angiogenesis, and remodeling. Therefore, we assume the synergistic effect of the combined use of AgNPs and CM, in which AgNPs with antibacterial, anti-inflammatory activities support CM to promote wound healing. Our target is chronic wounds that require advanced therapies for treatment. At the beginning of the research process, we aim to examine the healing effect of the combined use of AgNPs and CM on an acute wound, then perform it on a chronic wound model at a later stage.

This thesis is the first step of research, so in this study, three objectives need to be fulfilled. (1) Synthesize and characterize properties of silver nanoparticles (AgNPs) including physicochemical properties, sterility, antimicrobial activity and cytotoxicity; 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] (2) Evaluate the healing potential of conditioned medium (CM) by scratch assay in vitro; (3) Initially evaluate the therapeutic effect of each treatment: AgNPs and CM and the combined use of AgNPs and CM on the wound models in vivo. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHAPTER 1: OVERVIEW 1. Cutaneous wound and wound healing process 1.

Cutaneous wound Wounds are considered a growing challenge for the healthcare system. There are variety of reasons that can lead to injury, from extrinsic factors, such as shear, thermal, pressure to underlying causes such as diabetes, stress [61]. The injuries not only cause burden to patients, family, and healthcare system but also resulted in significant economic costs. A retrospective analysis of Medicare beneficiaries (2018) reported that approximately 8.2 million people who suffered from at least one type of wounds with or without infection.

The cost of wound care ranged from $28.8 billion involving costs for chronic and acute wounds [52]. Wound injuries are often classified into acute wounds including surgical wounds, traumatic, abrasions, or superficial burn, and chronic wounds, such as ulcers, diabetic foot ulcers (DFUs). Risk of chronic wounds is developed from an increase of age, the complication of diabetes, vascular diseases, obesity, etc. The market for advanced wound care for chronic and surgical wounds is expected to $22 billion by 2024 [61].

On the other hand, acute wounds are at risk of wound infection, particularly in post- surgery [61]. Another challenge for acute wounds is that prolonged healing can lead the wounds to enter a chronic state (non-healing) [16]. Therefore, novel concepts to prevent infection and promote the healing process are vital to managing wounds. The normal wound healing process Wound healing is a dynamic process involving 4 phases – hemostasis, inflammation, proliferation, and remodeling, that overlap in time This process is regulated by a complex system of mediators, which are responsible for cell-cell communication, involving various cytokine, growth factors, and chemokines [9], [13], [53] (Figure 1.

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phases in wound healing [43]. Hemostasis begins immediately after an injury created, platelets form a plug and release several mediators, for example, platelet-derived growth factor (PDGF), which subsequently recruit leukocytes to the wound site. In the inflammatory phase, neutrophils start to cleanse the injury area from microorganisms and foreign contaminants, and then phagocytosed by macrophages or formed the eschars.

Chemokines, transforming growth factor β (TGF-β), and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) are released that lead to the infiltration of monocytes to the injury site that later transformed to macrophages. The monocyte and macrophages play a crucial role in inflammatory phase by releasing various cytokine such as vascular endothelial growth factor (VEGF), colony-stimulating factor 1 (CSF-1), PDGF, transforming growth factor α (TGF-α), TGF-β, interleukin-1 (IL-1), etc. that initiate the formation of granulation tissue. The proliferation phase started with re-epithelialization, in which several growth factors including TGF-α, epidermal growth factor (EGF) and keratinocyte growth factor (KGF) were released to stimulate the proliferation of epidermal cells at the margin.

Granulation tissue, which is the new stroma, forms in the wound site. The 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] concert of extracellular matrix (ECM) molecules and growth factors, PDGF, TGF-β induce fibroblasts around the wound to proliferate and migrate into the wound area. The structural molecules of new ECM involving fibrin, fibronectin, hyaluronic, providing a scaffold for cell migration and the formation of granulation tissue. The fibroblasts play an important role in synthesis, deposition, and remodeling of the ECM.