CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Vài nét về Carotenoid Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong các loài sinh vật quang hợp như là tảo, một vài loài nấm, một vài loài vi khuẩn và thực vật. Đến nay đã tìm được hơn 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyl và carotene [10]. Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử carbon) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprene.
Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng thực phẩm có chứa carotenoid trong bữa ăn để tăng sức đề kháng và bảo vệ bản thân mình. Carotenoid còn có tác dụng chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Carotenoid được chia thành 2 loại là: carotene và xanthophyll. + Các carotene: có màu da cam, đỏ, là những hydrocác bon (C40H58) có 1 mạch chính 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 liên kết đôi mạch nhánh, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi.
Ví dụ: α-carotene, β-carotene và lycopene. + Xanthophyl: là các phân tử chứa oxi, thường có màu vàng. Ví dụ: lutein và zeaxanthin. Một số carotenoid tìm thấy trong thuỷ sản như: canthaxanthin, astaxanthin, zeaxanthin, tuna xanthin, lutein, beta carotene, doradexanthin, erichinenone.
Giới thiệu về Canthaxanthin Hình 1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) Canthaxanthin có tên khoa học là β-β carotene-4,4’- dione, là một trong những dẫn xuất của β-carotene có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thậm chí trội hơn β- carotene. Hoạt chất này thuộc nhóm diketo-carotenoid (4,4’-oxo-carotenoid) với nhóm keto đối xứng ở vị trí 4 và 4’ của vòng β-ionone, 9 nhóm liên kết đôi C=C ở trung tâm phân tử hoạt động như cấu tử hấp phụ ánh sáng, tạo ra màu đỏ-cam của hoạt chất [11], [12]. Công thức phân tử của canthaxanthin: C40H52O2 14 Khối lượng phân tử M=564.82g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 211 2120C (kèm phân hủy) Hấp phụ cực đại tại bước sóng λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466 nm (ete dầu hỏa).
Cúng giống như các carotenoid khác, canthaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh, dễ bị phân hủy khi để trong không khí, hoà tan tốt trong các dung môi kém phân cực. Công thức phân tử của canthaxanthin thì tương tự như β-caroten nhưng phức tạp hơn. canthaxanthin có 13 nối đôi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đôi vì vậy khả năng chống oxi hóa của nó cũng cao hơn β-caroten. Canthaxanthin tồn tại tương đối phổ biến trong tự nhiên, được phân lập đầu tiên từ, loài nấm ăn được Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo [11].
Canthaxanthin cũng được tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trưởng cùng với một số các caroten khác [12]. Ngoài ra, nó còn được phát hiện ở các loài vi khuẩn [10], động vật giáp xác [13] và ở nhiều loài cá như cá chép [14], cá đối vàng, cá tráp biển [15]. Canthaxanthin không được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Đại Tây Dương nhưng được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Thái Bình Dương và một số loài cá hồi khác [13]. Tính chất vật lý của canthaxanthin Tính tan: canthaxanthin rất ít tan trong nước vì nó là hợp chất không phân cực, nó tan trong các dung môi hữu cơ như ete, cồn, pyridine, dầu mỏ, dầu thực vật.
Khả năng hấp thụ ánh sáng và màu sắc: canthaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu đỏ cam. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canthaxanthin có thể bị thay đổi khi canthaxanthin liên kết với các chất khác. Trong các động vật giáp xác như cua, tôm canthaxanthin thường liên kết với phân tử protein (crutacyanin) có max = 628nm tạo nên màu xanh đặc trưng của các loài giáp xác sống. Khi có tác dụng của nhiệt, liên kết bị phá hủy các canthaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.
Tính chất hóa học của canthaxanthin Trong phân tử canthaxanthin có chuỗi polyen, liên kết với các nhóm keto, hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên canthaxanthin rất nhạy với nhiệt độ cao, ánh sáng và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Tốc độ oxy hóa canthaxanthin diễn ra nhanh khi có sự xuất hiện của ion kim loại, sunfit, độ ẩm, hoặc để trong không khí. 15 Tính chất oxy hóa: canthaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxy hóa bởi tác nhân electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi canthaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Tính chất chống oxy hóa của canthaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng giữ lại các gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng.
Phản ứng với axít: canthaxanthin phản ứng với, axít yếu làm dịch chuyển cực đại hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài, nhưng trung hòa bằng bazơ yếu, cấu trúc phân tử canthaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như: HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của canthaxanthin làm giảm màu đỏ cam. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản - Canthaxanthin có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào, tạo mầu sắc cho cơ thịt, tăng cường khả năng đề kháng, tăng khả năng tăng trưởng, tăng cường năng suất sinh sản, chống lại sự oxy hóa và chống lại các tia tử ngoại của một số loài thủy sản. Ứng dụng của canthaxanthin Trong thực phẩm thì màu sắc bên ngoài là yếu tố quan trọng thu hút người tiêu dùng. - Canthaxanthin là chất màu chính trong vỏ và các cơ quan bên trong của các loài động vật giáp xác, nó chiếm từ 86 ÷ 98% của tổng lượng carotenoid.
Màu đỏ tạo ra do quá trình gia nhiệt, protein bị biến tính làm đứt các liên kết giữa phức hợp carotenprotein làm giải phóng canthaxanthin tự do. Màu sắc cuối cùng phụ thuộc vào hàm lượng của canthaxanthin còn lại trong thịt cơ và vỏ của các loài giáp xác. - Với một số thực phẩm có nguồn gốc từ các loài giáp xác sau chế biến bị giảm mầu hoặc mất mầu, có thể bổ sung canthaxanthin như một phụ gia sẽ làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm. - Mục đích của việc bổ sung chất màu vào thực phẩm nhằm: + Khôi phục lại màu sắc đã bị mất trong quá trình bảo quản, chế biến (khi tiếp xúc với nhiệt độ, độ ẩm, không khí …).
+ Làm tăng màu của thực phẩm trong giới hạn cho phép. + Điều chỉnh màu sắc tự nhiên của thực phẩm, khi màu tự nhiên không đủ để thể hiện màu sắc cho sản phẩm. 16 + Làm đồng nhất màu sắc thực phẩm + Làm thực phẩm có màu hấp dẫn đối với người tiêu dùng Đến nay, có rất nhiều tài liệu đã chứng minh rằng canthaxanthin là một chất an toàn về mặt thực phẩm. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin 1.
Giới thiệu chung về chi Paracoccus Năm 1992, các tác giả đã mô tả Paracoccus là một Prokaryote gồm có 2 loài là P. Sau đó, chủng Paracoccus halodenitrificans bị loại trừ bởi vì nó được chứng minh là một thành viên của chi Halomonas thuộc ngành Proteobacteria [17]. Tính đến năm 2006, tổng cộng đã phát hiện 14 loài mới của Paracoccus dựa trên mô tả và phân tích trình tự gen bao gồm các loài: vi khuẩn hóa tự dưỡng lưu huỳnh P.Versutus Các chủng thuộc chi Paracoccus thuộc cầu khuẩn có đường kính từ 0,4 ÷ 0,9µm, hoặc trực cầu khuẩn (coccobacilli) có chiều dài lên đến 2 µm ở dạng tế bào đơn, tế bào đôi, chuỗi tế bào. Paracoccus là vi khuẩn gram âm và hầu hết các loài đều không di động.
Các loài thuộc Paracoccus là vi khuẩn hiếu khí, phát triển nhanh trên môi trường các chất hữu cơ, một số loài có khả năng phát triển trọng môi trường yếm khí với nitrate hoặc oxide ni tơ là tác nhân oxy hóa và tạo ra sản phẩm cuối cùng là dinito. Khả năng lên men của Paracoccus chưa được biết đến nhiều trong các công bố. Paracoccus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-37°C, pH= 6,5-8,5, ngoại trừ P.alcaliphilus phát triển ở pH=8-9.5 và phát triển yếu ở pH= 7. Tất cả các chủng Paracoccus được kiểm tra cho đến nay đều chứa ubiquinone-10 là một quinone hô hấp, như mong đợi đối với các thành viên thuộc phân lớp α-3 của Proteobacteria, ngoài ra còn một lượng nhỏ ubiquinone-9 và ubiquinone-11 cũng được báo cáo ở một số chủng.
Một số chủng có thể tích lũy poly-β-hydroxybutyrate trong điều kiện đủ các bon và có hoạt tính catalase và oxydase. Để mô tả các đặc điểm chung của chi là xuất phát từ các đặc tính của P.versutus, không áp dụng cho một số chủng được phân lập gần đây. Các quy trình nuôi cấy làm giàu (tăng mật độ giống) một số chủng Paracoccus phụ thuộc vào việc lựa chọn một trong hai con đường là tự dưỡng hoặc chuyển hóa methan (methylotrophic) trong môi trường oxy hóa với hydro hoặc methylamine (với sự có mặt của các bon dioxide) hoặc của các chủng khử nitơ trong điều kiện anoxic 17 (nitrat hóa và khử nitrat) với nitrat là chất oxy hóa và các hợp chất hữu cơ như là nguồn các bon và năng lượng [19]. Sự tăng, trưởng của hầu hết các vi khuẩn oxy hóa hydro tự dưỡng ưa ấm trung bình (mesophilic) là chậm hoặc không thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy khử nitơ và kỵ khí [20].
Một số, chủng cũng có khả năng tăng trưởng tự dưỡng tốt trên formate và trong số đó có ba chủng là P. Do đó, làm giàu lượng giống bằng lên men kỵ khí với formate, các bon dioxide và nitrate (hoặc nitrous oxide) có thể phù hợp với 2 chủng P.denitrificans và P.denitrificans tăng trưởng tự dưỡng yếu trên methanol trong điều kiện khử nitrat. Một số chủng Paracoccus có thể phát triển tự dưỡng bằng cách sử dụng quá trình oxy hóa thiosulfate để cung cấp năng lượng, trong khi P.pantotrophus có thể sử dụng, các hợp chất cacbon disulfide (CS2) và methyl hóa hợp chất sulfur [21] và P.thiocyanatus có thể phát triển tự dưỡng hiếu khí trên thiocyanate [22]. Những cơ chất này đã giúp làm giàu mẫu và phân lập, được các chủng Paracoccus mới.
Hiện nay, các chủng Paracoccus là nguồn sản phẩm sinh học tiềm năng chưa được khai thác một cách hiệu quả, khai thác thương mại mới sử dụng một số chủng. Hỗn hợp tế bào cố định 2 chủng P.denitrificans và Corynebacterium đã dùng để sản xuất liên tục L-phenylalanine từ acid acetamidocinnamic và 2 chủng P.marcusii sản xuất quy mô công nghiệp canthaxanthin [16], [23]. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi sử dụng chủng: Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme - Viện Công nghiệp Thực phẩm để tiến hành thực hiện các nghiên cứu. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin Quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bắt đầu bởi sự chuyển hóa, acetyl CoA thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA, (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA synthase.