Nghiên Cứu Tối Ưu Quy Trình Tạo Chế Phẩm Giàu Canthaxanthin Từ Vi Khuẩn Paracoccus carotinifaciens

Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm canthaxanthin từ vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân.

• Tác giả: Đặng Việt Anh
• Người hướng dẫn: GS. TS. Phạm Quốc Long
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tối Ưu Quy Trình Tạo Chế Phẩm Giàu Canthaxanthin Từ Vi Khuẩn Paracoccus carotinifaciens
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
• 1.1. Vài nét về Carotenoid
• 1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin
• 1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin
• 1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin
• 1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản
• 1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin
• 1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin
• 1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus
• 1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin
• 1.3.3. Nhu cầu về NaCl
• 1.3.4. Nguồn carbon và nitơ
• 1.3.5. Nguyên tố vi lượng
• 1.3.6. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin
• 1.3.6.1. Tỷ lệ giống
• 1.3.6.2. Sự cung cấp oxy
• 1.3.6.3. Độ pH môi trường
• 1.3.6.4. Thời gian lên men
• 1.3.6.5. Phương pháp lên men
• 1.4. Thu hồi sản phẩm
• 1.4.1. Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật
• 1.4.1.1. Phương pháp lọc
• 1.4.1.2. Phương pháp ly tâm
• 1.4.1.3. Phương pháp lắng
• 1.4.2. Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật
• 1.4.3. Các phương pháp trích ly và tinh chế canthaxanthin
• 1.4.3.1. Các phương pháp phá hủy thành tế bào
• 1.4.3.1.1. Các phương pháp cơ học gián đoạn
• 1.4.3.1.2. Các phương pháp cơ học không gián đoạn
• 1.4.3.2. Nguyên lý hoạt động của quá trình chiết xuất bằng siêu âm
• 1.4.3.3. Ảnh hưởng các thông số chiết siêu âm
• 1.4.3.3.1. Thông số vật lý
• 1.4.3.3.2. Thông số môi trường
• 1.5. Giới thiệu về liposome và ứng dụng của liposome
• 1.5.1. Giới thiệu về liposome
• 1.5.2. Lịch sử liposome
• 1.5.3. Cấu tạo của liposome
• 1.5.4. Ứng dụng của liposome
• 1.5.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome
• 1.5.6. Nghiên cứu và ứng dụng liposome trong nuôi cá hồi vân
• 1.6. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng trong tối ưu hóa
• 1.7. Giới thiệu về cá hồi vân và nghề nuôi cá hồi nước lạnh
• 1.7.1. Tình hình nuôi cá hồi tại trên thế giới và Việt Nam
• 1.7.1.1. Tình hình nuôi cá hồi vân trên thế giới
• 1.7.1.2. Tình hình nuôi cá hồi vân tại Việt Nam
• 1.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi
• 1.7.2.1. Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH
• 1.7.3. Nhu cầu dinh dưỡng và thức ăn của cá hồi vân
• 1.7.3.1. Nhu cầu protein
• 1.7.3.2. Nhu cầu về lipid acid béo
• 1.7.3.3. Nhu cầu vitamin và khoáng chất
• 1.7.3.4. Nhu cầu carotenoids
• 1.7.4. Phát triển thức ăn cho cá hồi ở Việt Nam
• 1.7.5. Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
• 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men
• 2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome
• 2.2. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
• 2.3. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men
• 2.4. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
• 2.5.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật
• 2.5.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin
• 2.5.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin
• 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men
• 2.5.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid
• 2.5.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
• 2.5.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng
• 2.5.2.4. Phương pháp sắc kí cột
• 2.5.3. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa canthaxanthin
• 2.5.3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin
• 2.5.3.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi
• 2.5.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình công nghệ
• 2.5.5. Phân tích thống kê
• 3. CHƯƠNG III: Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
• 3.1. Lựa chọn thành phần môi trường
• 3.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
• 3.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
• 3.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
• 3.5. Lựa chọn mô hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
• 3.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
• 3.7. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin
• 3.7.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
• 3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết xuất canthaxanthin
• 3.7.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
• 3.7.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình chiết
• 3.7.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết
• 3.7.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến quá trình chiết
• 3.7.3. Xây dựng mô hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm
• 3.8. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome
• 3.8.1. Quá trình tổng hợp liposome
• 3.8.2. Kích thước hạt
• 3.8.3. Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome
• 3.8.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc
• 3.8.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân
• 3.8.5.1. Tiến hành đo khối lượng
• 3.8.5.2. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn
• 4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin
• 4.1.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin
• 4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin
• 4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mô hình RSM- CCD
• 4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men
• 4.1.4. Quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn quy mô 80-100 lít/mẻ
• 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết xuất
• 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
• 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết
• 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết
• 4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết
• 4.3. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình chiết xuất
• 4.3.1. Kiểm tra sự tương hợp của mô hình
• 4.3.2. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất
• 4.4. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin
• 4.5. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol
• 4.6. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin
• 4.7. Màu sắc cơ của cá hồi
• NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• BÀI BÁO QUỐC TẾ
• BÀI BÁO TRONG NƯỚC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế phẩm canthaxanthin từ Paracoccus carotinifaciens

Nghiên cứu chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm. Canthaxanthin là một carotenoid quan trọng, có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình tạo chế phẩm này không chỉ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn cải thiện màu sắc cho sản phẩm thủy sản.

1.1. Ứng dụng của canthaxanthin trong thực phẩm và thủy sản

Canthaxanthin được sử dụng rộng rãi như một chất tạo màu tự nhiên trong thực phẩm và thức ăn cho thủy sản. Nó không chỉ giúp cải thiện màu sắc mà còn tăng cường giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cho cá hồi có thể nâng cao chất lượng thịt và sức khỏe của cá.

1.2. Tầm quan trọng của Paracoccus carotinifaciens trong sản xuất canthaxanthin

Vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens là một nguồn tiềm năng để sản xuất canthaxanthin nhờ khả năng sinh tổng hợp carotenoid hiệu quả. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa quy trình lên men từ vi khuẩn này có thể mang lại sản phẩm an toàn và hiệu quả cho ngành công nghiệp thực phẩm.

II. Thách thức trong quy trình tạo chế phẩm canthaxanthin từ vi khuẩn

Mặc dù có nhiều lợi ích, quy trình tạo chế phẩm từ Paracoccus carotinifaciens vẫn gặp phải một số thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, thời gian lên men và tỷ lệ nguyên liệu có thể ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sinh tổng hợp canthaxanthin

Điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ và nồng độ muối có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh các yếu tố này có thể cải thiện đáng kể hiệu suất sản xuất.

2.2. Thách thức trong việc thu hồi và tinh chế canthaxanthin

Quá trình thu hồi và tinh chế canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn cũng gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp chiết xuất hiện tại cần được cải tiến để đảm bảo hiệu suất cao và giảm thiểu tổn thất trong quá trình sản xuất.

III. Phương pháp tối ưu hóa quy trình tạo chế phẩm canthaxanthin

Để tối ưu hóa quy trình tạo chế phẩm canthaxanthin, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) có thể giúp xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men và chiết xuất.

3.1. Phương pháp bề mặt đáp ứng trong tối ưu hóa quy trình

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) cho phép nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều yếu tố đồng thời đến quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin. Việc áp dụng RSM giúp xác định các điều kiện tối ưu một cách hiệu quả và tiết kiệm thời gian.

3.2. Kỹ thuật chiết xuất canthaxanthin hiệu quả

Các kỹ thuật chiết xuất như chiết xuất bằng siêu âm và chiết xuất bằng dung môi hữu cơ đã được nghiên cứu để nâng cao hiệu suất thu hồi canthaxanthin. Những phương pháp này không chỉ giúp tăng cường hiệu suất mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn canthaxanthin

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình tối ưu hóa đã mang lại hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin cao từ Paracoccus carotinifaciens. Sản phẩm chế phẩm này đã được thử nghiệm và cho thấy hiệu quả tích cực trong việc cải thiện màu sắc và chất lượng thịt cá hồi.

4.1. Hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn

Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa điều kiện lên men đã giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp canthaxanthin lên đến 30% so với các phương pháp truyền thống. Điều này mở ra cơ hội mới cho việc sản xuất chế phẩm từ vi khuẩn.

4.2. Ứng dụng canthaxanthin trong chăn nuôi cá hồi

Chế phẩm giàu canthaxanthin đã được bổ sung vào thức ăn cho cá hồi và cho thấy sự cải thiện rõ rệt về màu sắc và chất lượng thịt. Kết quả này khẳng định giá trị của canthaxanthin trong ngành nuôi trồng thủy sản.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu canthaxanthin

Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ Paracoccus carotinifaciens đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp thực phẩm và thủy sản. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển quy trình này sẽ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng và chất lượng sản phẩm.

5.1. Triển vọng phát triển quy trình sản xuất canthaxanthin

Với những kết quả đạt được, việc phát triển quy trình sản xuất canthaxanthin từ vi khuẩn sẽ tiếp tục được nghiên cứu. Điều này không chỉ giúp tăng cường sản lượng mà còn đảm bảo tính bền vững cho ngành công nghiệp thực phẩm.

5.2. Tương lai của canthaxanthin trong ngành thực phẩm

Canthaxanthin có tiềm năng lớn trong việc cải thiện chất lượng thực phẩm và sức khỏe con người. Nghiên cứu và ứng dụng canthaxanthin trong thực phẩm sẽ tiếp tục được mở rộng, mang lại nhiều lợi ích cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Canthaxanthin (tên khoa học: $\beta,\beta$-Carotene-4,4'-dione) là sắc tố hữu cơ tự nhiên thuộc nhóm diketo-carotenoid, có hoạt tính sinh học quan trọng bao gồm khả năng chống oxy hóa mạnh, chống khối u, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, bảo vệ gan, chống đái tháo đường, bảo vệ mô trước bức xạ tia cực tím, chống viêm và phòng ngừa thoái hóa điểm vàng. Trong ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là chăn nuôi cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), canthaxanthin đóng vai trò quyết định trong việc tích lũy tạo màu đỏ-cam đặc trưng cho mô cơ thịt, nâng cao giá trị thương phẩm và tăng cường tỷ lệ sống cũng như sức đề kháng của cá. Do cá không có khả năng tự sinh tổng hợp carotenoid mà phải hấp thu tích lũy trực tiếp qua nguồn thức ăn, việc bổ sung sắc tố vào khẩu phần là một yêu cầu bắt buộc trong quy trình chăn nuôi thương mại.

Khoảng trống nghiên cứu thực tế tại Việt Nam cho thấy nguồn sắc tố carotenoid và canthaxanthin phục vụ chăn nuôi thủy sản nước lạnh phần lớn phụ thuộc vào chế phẩm nhập ngoại giá thành cao hoặc tổng hợp hóa học. Việc khai thác con đường sinh tổng hợp canthaxanthin từ các chủng vi khuẩn ưa mặn tự nhiên như Paracoccus có độ an toàn sinh học cao, thân thiện với môi trường và giá trị kinh tế tiềm năng. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước trước đây mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa hoàn thiện quy trình công nghệ lên men kiểm soát ở quy mô pilot, chưa tối ưu hóa công nghệ chiết xuất bằng sóng siêu âm và chưa giải quyết được bài toán tăng độ bền cũng như độ hấp thu của canthaxanthin khi đưa vào viên thức ăn thủy sản.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định rõ qua 3 nội dung chính:

1. Nghiên cứu, tối ưu hóa quá trình lên men thu nhận sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181.
2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn ưa mặn bằng phương pháp có hỗ trợ sóng siêu âm.
3. Tổng hợp hệ vi hạt liposome chứa canthaxanthin (đồng bao gói với $\alpha$-tocopherol) và bước đầu ứng dụng phối trộn vào thức ăn nhằm nâng cao chất lượng và màu sắc cơ thịt cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss).

Đối tượng nghiên cứu của luận án bao gồm: chủng vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181; hoạt chất canthaxanthin sinh tổng hợp; hệ chất mang nano liposome tạo bởi lecithin đậu nành; và cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) giai đoạn nuôi thương phẩm. Phạm vi nghiên cứu về không gian được triển khai tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (Hà Nội), phối hợp với Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm và Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản nước lạnh Sa Pa (Lào Cai) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1. Phạm vi quy mô công nghệ thực hiện từ quy mô bình tam giác phòng thí nghiệm đến thiết bị lên men 3 lít, thiết bị lên men pilot 80-100 lít/mẻ trên hệ thống 500 lít, cùng thời gian thử nghiệm cho cá ăn kéo dài 3 tháng liên tục. Luận án thuộc chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học (mã số: 9.01), hoàn thành năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Canthaxanthin được phân lập lần đầu tiên từ loài nấm ăn Cantharellus cinnabarinus vào năm 1950 bởi Haxo. Hoạt chất này sau đó được phát hiện ở một số loài vi tảo xanh ở giai đoạn cuối chu kỳ sinh trưởng, trong động vật giáp xác và các loài cá tự nhiên như cá chép, cá đối vàng, cá tráp biển và cá hồi hoang dã Thái Bình Dương. Về mặt phân loại học, chi vi khuẩn Paracoccus được mô tả lần đầu vào năm 1992 như một sinh vật nhân sơ Prokaryote. Sau khi chủng Paracoccus halodenitrificans được phân loại lại sang chi Halomonas, tính đến năm 2006 đã có 14 loài mới thuộc chi Paracoccus được ghi nhận dựa trên phân tích trình tự gen, điển hình như P. versutus, P. denitrificans, P. pantotrophus, P. thiocyanatus và P. marcusii. Các nghiên cứu thương mại trên thế giới đã ứng dụng hỗn hợp tế bào P. denitrificans và Corynebacterium để sản xuất liên tục L-phenylalanine, cũng như khai thác P. marcusii trong sản xuất canthaxanthin quy mô công nghiệp.

Các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn ưa mặn đã được nhiều tác giả khảo sát. Vi khuẩn cổ cực kỳ ưa mặn Halobacterium alexandrinus (Hfx. alexandrinus) đòi hỏi nồng độ NaCl tối thiểu 10% (w/v) để phát triển và đạt hàm lượng canthaxanthin cao khi tăng nồng độ muối lên 25%. Ngược lại, chủng Dietzia natronolimnaea HS-1 sinh trưởng không phụ thuộc vào nồng độ NaCl trong môi trường. Nasri Nasrabadi và Razavi (2010) công bố rằng việc bổ sung các nguyên tố vi lượng ở nồng độ tối ưu gồm $\text{Fe}^{3+}$ (30 ppm), $\text{Cu}^{2+}$ (28,75 ppm) và $\text{Zn}^{2+}$ (27 ppm) giúp chủng D. natronolimnaea HS-1 đạt sản lượng canthaxanthin cao nhất là $8,923 \pm 0,018\text{ mg/L}$. Liu và Lee cũng xác nhận các ion sắt đóng vai trò kích thích sinh tổng hợp carotenoid thông qua chu trình phản ứng Fenton tạo gốc hydroxyl.

Về phương pháp chiết xuất và phá vỡ thành tế bào vi sinh vật, các công trình của Kim và cộng sự, Chisti và cộng sự chỉ ra rằng các kỹ thuật cơ học gián đoạn (nghiền bi, đồng hóa áp suất cao) dễ sinh nhiệt phân hủy sắc tố, trong khi chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) được Toma và cộng sự chứng minh tạo ra hiệu ứng xâm thực (cavitation), làm nổ vỡ vi bọt tạo tia chất lỏng cắt đứt vách tế bào mà không làm biến tính các hợp chất kém bền nhiệt. Wang và cộng sự khảo sát biên độ sóng siêu âm ở dải tần số 20 kHz và chứng minh cường độ siêu âm ($UI$) có ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất trích ly. Về công nghệ bao gói, liposome được Alec D. Bangham mô tả lần đầu năm 1961 (công bố năm 1964) và được Gerald Weissmann đặt tên; các phương pháp phân tán và ép đùn qua màng mỏng (Mozafari) giúp tạo các túi lipid kép kích thước nano. Nghiên cứu của các tác giả quốc tế cũng chỉ ra rằng việc đưa đồng thời $\alpha$-tocopherol (vitamin E) cùng canthaxanthin vào cấu trúc liposome làm tăng độ ổn định và cải thiện tốc độ giải phóng canthaxanthin in vitro so với hệ chỉ chứa sắc tố đơn lẻ.

Đối với lĩnh vực dinh dưỡng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), các nghiên cứu của Steffens (1989), Halver (1989), Rumsey (1991), Hardy (2002) đã xác định nhu cầu protein của cá thương phẩm dao động trong khoảng 38-48%, lipid từ 16-24%, cùng danh mục các khoáng vi lượng ($\text{Fe}, \text{Mn}, \text{Cu}, \text{Zn}, \text{I}, \text{Co}, \text{Se}$) và các vitamin thiết yếu ($\text{B}_1, \text{B}_2, \text{B}_6, \text{B}_5, \text{B}_3, \text{B}9, \text{B}{12}, \text{C}, \text{D}, \text{E}$). Về môi trường, cá hồi vân đòi hỏi nhiệt độ nước thích hợp dưới 18-22°C (giảm khẩu phần ăn khi vượt quá 18°C theo Gibson), hàm lượng oxy hòa tan duy trì trên 5-7 ppm (Bromage & Shepherd; Gibson), và pH nước trong khoảng 6,4-8,4 (thích hợp nhất 7,0-7,5). Christiansen khẳng định canthaxanthin có vai trò bảo vệ sự phát triển của cá hồi giai đoạn giống và cải thiện tỷ lệ sống. Tại Việt Nam, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã di nhập thành công trứng cá hồi vân từ Phần Lan năm 2005 tại Sa Pa và phát triển công thức thức ăn ép đùn chứa 42% protein và 20% lipid trong giai đoạn 2011-2013. Thử nghiệm bổ sung hỗn hợp astaxanthin và canthaxanthin với tỷ lệ 40/40 mg/kg thức ăn đã cho hiệu quả tạo màu thịt cá tốt. Bên cạnh đó, Trình Mai Duy Lưu và cộng sự (2018) đã sàng lọc được 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin ở quy mô ống nghiệm.

Từ các kết quả nghiên cứu trên, luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống công nghệ: tối ưu hóa đồng bộ quy trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin từ chủng vi khuẩn ưa mặn tuyển chọn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 ở quy mô pilot 80-100 lít/mẻ; áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu các thông số chiết siêu âm; chế tạo hệ nano liposome đồng bao gói canthaxanthin với $\alpha$-tocopherol và kiểm chứng thực nghiệm khả năng cải thiện màu sắc mô cơ cá hồi vân nuôi tại Sa Pa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên con đường chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật: bắt đầu từ acetyl-CoA tạo thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA synthase, khử thành mevalonic acid (MVA), phosphoryl hóa tuần tự thành isopentenyl pyrophosphate (IPP), đồng phân hóa thành dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) bởi prenyltransferase tạo geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), ngưng tụ tạo phytoene ($\text{C}{40}$), sau đó qua chuỗi phản ứng khử bão hòa tạo lycopene, đóng vòng tạo $\beta$-carotene và oxy hóa gắn nhóm keto tại vị trí C4, C4' để tạo thành canthaxanthin ($\text{C}{40}\text{H}_{52}\text{O}2$, khối lượng phân tử 564,82 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 211-212°C). Cấu trúc chứa chuỗi polyene gồm 13 liên kết đôi liên hợp mang lại khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng $\lambda{\max} = 482\text{ nm}$ (trong $\text{CHCl}_3$), $474\text{ nm}$ (trong $\text{C}_2\text{H}_5\text{OH}$) và $466\text{ nm}$ (trong ether dầu hỏa).

Về lý thuyết trích ly siêu âm, quá trình phá vỡ thành tế bào dựa trên hiện tượng xâm thực sóng âm trong môi trường lỏng. Cường độ siêu âm ($UI$, đơn vị $\text{W/cm}^2$) được tính theo công thức: $$UI = \frac{P}{S}$$ trong đó $P$ là công suất máy phát siêu âm (W) và $S$ là diện tích bề mặt tiếp xúc của đầu phát sóng titan ($\text{cm}^2$).

Về lý thuyết bao gói chất mang, cấu trúc túi liposome hình thành từ lớp kép phospholipid lưỡng ái của lecithin đậu nành, giúp cô lập hợp chất canthaxanthin kỵ nước vào vùng lõi lipid, đồng thời phối hợp $\alpha$-tocopherol đóng vai trò làm chất chống oxy hóa bảo vệ liên kết đôi polyene khỏi tác nhân phân hủy. Hiệu suất đóng gói ($EE$, %) và tải lượng thuốc ($DL$, %) được xác định bằng công thức toán học phân tích qua tỷ lệ nồng độ ban đầu ($IC$).

Hệ phương pháp thực nghiệm và thiết bị triển khai bao gồm:

• Phương pháp lên men: Lên men chìm hiếu khí trên môi trường lỏng dinh dưỡng. Sử dụng thiết bị lên men BioFlo 510 SIP Bench (Mỹ), nồi lên men 3 lít Marubishi (Nhật Bản) và hệ thống nồi lên men pilot 500 lít Marubishi (Nhật Bản). Chủng giống vi sinh vật là Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được giữ giống và nuôi cấy trên môi trường Marine Broth, Marine Agar và Nutrient Broth 01 (Merck).
• Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật: Áp dụng phương pháp của Mira de Orduna (2000). Mẫu dịch nuôi cấy (10 mL) được ly tâm lắng ở 5000 vòng/phút trong 10 phút, rửa sạch 2 lần bằng nước cất, sau đó sấy khô ở 105°C đến khối lượng không đổi để tính nồng độ sinh khối khô (g SKK/L).
• Kỹ thuật tách sinh khối: Đánh giá so sánh thiết bị ly tâm bán liên tục CEPA Z61 (Đức) và thiết bị ly tâm lọc dòng ngang Maximizer 41 Green (WaterSep, Mỹ).
• Phương pháp định lượng canthaxanthin: Quy trình xử lý mẫu của Dan Qiu (2001) kết hợp chiết hệ dung môi ethanol - chloroform - nước ở 60°C trong 5 phút, ly tâm thu dịch chiết, cô quay chân không trên máy Buchi Rotavapor R-210 ở 55°C/150 mmHg, hòa tan cặn bằng cyclohexane và đo quang phổ UV-Vis. Xác định hàm lượng và độ sạch canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (bản mỏng silicagel Merck 60 $\text{F}_{254}$) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đối chiếu với chất chuẩn canthaxanthin thương mại của hãng TRC Canada.
• Phương pháp chiết xuất siêu âm: Sử dụng thiết bị đồng hóa siêu âm đầu dò UP200St (Hielscher, Đức), dung môi ethanol 96% thực phẩm, kiểm soát các yếu tố công nghệ gồm nhiệt độ chiết, thời gian siêu âm, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và công suất siêu âm.
• Phương pháp tổng hợp và phân tích hạt liposome: Hòa tan lecithin đậu nành, canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol trong hỗn hợp dung môi hữu cơ, tạo màng film mỏng trên máy cô quay Buchi R-210, hydrat hóa bằng dung dịch đệm phosphate (PBS, pH 7,4), sau đó ép đùn qua máy đùn mini màng lọc polycarbonate kích thước lỗ 100 nm. Đo kích thước hạt trung bình, chỉ số phân tán (PDI) và thế zeta bằng máy Horiba SZ-100 (Nhật Bản). Đánh giá động học giải phóng canthaxanthin in vitro trong môi trường đệm PBS ở pH 7,4.
• Phương pháp thử nghiệm trên cá hồi vân: Thử nghiệm nuôi dưỡng cá hồi vân thương phẩm tại Sa Pa (Lào Cai). Khẩu phần thức ăn ép đùn được bổ sung liposome ở các nồng độ khác nhau. Theo dõi tốc độ sinh trưởng khối lượng định kỳ, phân tích thành phần hóa học mô cơ thịt cá (% khối lượng ướt đối với độ ẩm, protein, lipid, tro; $n=3$), chiết tách định lượng canthaxanthin trong cơ cá bằng HPLC và đo màu sắc cơ philê bằng máy/quạt so màu tiêu chuẩn DSM SalmoFan (Thụy Sĩ).
• Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và xử lý số liệu: Ứng dụng phần mềm Design Expert 11.0. Sử dụng ma trận sàng lọc yếu tố Min Run Resolution IV Screening để chọn các biến công nghệ ảnh hưởng lớn, sau đó xây dựng mô hình bề mặt đáp ứng bậc hai Box - Hunter Central Composite Design (RSM-CCD). Phân tích phương sai (ANOVA), kiểm tra mức độ tương thích của mô hình thông qua hệ số tương quan $R^2$, kiểm định Fisher ($F$-test) và giá trị xác suất $p$-value ($p < 0,05$).

Bảng tổng hợp công thức thức ăn cơ sở dùng trong chăn nuôi cá hồi thương phẩm của nghiên cứu:

Nguyên liệu phối trộn	Tỷ lệ thành phần (%)	Hàm lượng Protein (%)	Hàm lượng Lipid (%)
Bột cá (60% protein / 6,5% lipid)	60,0	36,0	3,90
Dầu gan mực	20,0	0,0	20,0
Gluten ngô (60% protein / 0,5% lipid)	8,5	5,1	0,03
Bột mì (12% protein / 1,7% lipid)	4,0	0,48	0,07
Bột sắn (2% protein / 1% lipid)	4,2	0,08	0,04
Đậu tương Ấn Độ (44% protein / 3,4% lipid)	1,5	0,66	0,05
Decanxi Phosphate (27% P)	1,0	0,0	0,0
Hỗn hợp vitamin (F1)	0,40	0,0	0,0
Hỗn hợp khoáng chất (F2)	0,25	0,0	0,0
Chất chống mốc	0,10	0,0	0,0
Vitamin C chịu nhiệt (35%)	0,07	0,0	0,0
Chất chống oxy hóa	0,01	0,0	0,0

Thành phần dinh dưỡng thực tế của thức ăn viên sản xuất đạt: độ ẩm $13,3 \pm 0,2%$; khoáng tro $12,7 \pm 0,1%$; protein thô $42,3 \pm 0,6%$; xơ thô $4,7 \pm 0,2%$; và lipid thô $23,9 \pm 0,5%$ (tính theo hàm lượng vật chất khô).

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I hệ thống hóa toàn diện các luận cứ khoa học liên quan đến đề tài. Tác giả trình bày cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý và quang phổ của hợp chất canthaxanthin, phân tích vai trò của chuỗi 13 liên kết đôi đối xứng trong hoạt tính thu dọn gốc tự do và khả năng hấp thụ quang học tạo màu đỏ-cam trong mô giáp xác và cá hồi. Chương này mô tả con đường sinh tổng hợp canthaxanthin từ acetyl-CoA qua chu trình mevalonate đến phytoene và lycopene; đồng thời điểm luận các đặc điểm sinh vật học của chi vi khuẩn Paracoccus (vi khuẩn gram âm, không di động, hình cầu/trực cầu khuẩn đường kính 0,4-0,9 $\mu\text{m}$, phát triển hiếu khí, hô hấp chứa quinone ubiquinone-10).

Chương I phân tích chi tiết tác động của các yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men: nồng độ muối NaCl, nguồn carbon (glucose, sucrose), nguồn nitơ (cao nấm men, peptone, cao malt), các nguyên tố vi lượng ($\text{Fe}^{3+}, \text{Cu}^{2+}, \text{Zn}^{2+}$), tỷ lệ giống, nhiệt độ nuôi cấy, nhu cầu oxy hòa tan (tối thiểu 1 mg/L trong lên men hiếu khí), pH môi trường và thời gian nuôi cấy. Về công nghệ sau lên men, chương này phân tích ưu nhược điểm của các kỹ thuật thu gom sinh khối (lọc, lắng tĩnh, ly tâm lắng và ly tâm lọc) cùng các phương pháp sấy bảo quản (sấy đối lưu, sấy lạnh, sấy thăng hoa).

Tiếp đó, chương phân tích các phương pháp phá vỡ màng tế bào vi khuẩn (nghiền bi, nhiệt ướt bằng nồi hấp, thủy phân enzyme, sử dụng dung môi ion) và đi sâu vào nguyên lý chiết xuất bằng sóng siêu âm (UAE). Cơ chế cắt vách tế bào do hiện tượng sụp đổ bong bóng xâm thực được làm rõ qua các thông số: công suất phát, tần số (20-25 kHz), cường độ siêu âm ($UI$), cấu tạo đầu dò titan, độ nhớt dung môi và nhiệt độ chiết. Về kỹ thuật bao bọc hoạt chất, tác giả tổng thuật lịch sử phát triển liposome từ nghiên cứu của Bangham (1961), cấu trúc màng kép phospholipid, phương pháp chế tạo và cơ chế đưa đồng thời chất chống oxy hóa $\alpha$-tocopherol để gia tăng độ bền cấu trúc của canthaxanthin. Cuối cùng, chương I tổng kết nhu cầu dinh dưỡng của cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), tiêu chuẩn chất lượng môi trường nước nuôi (nhiệt độ 8-18°C, $\text{DO} > 5\text{ ppm}$, pH 7,0-7,5), thực trạng nuôi cá nước lạnh tại Việt Nam với sản lượng đạt 3.720 tấn vào năm 2020 trên 14 tỉnh, và lịch sử nghiên cứu sản xuất thức ăn viên ép đùn bổ sung carotenoid trong nước.

Chương II: Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả xuất xứ, quy cách hóa chất và thiết bị thực nghiệm. Đối tượng vi sinh vật là chủng Paracoccus carotinifaciens VTP20181 do Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện Công nghiệp Thực phẩm phân lập, tuyển chọn và cung cấp. Môi trường nuôi cấy sử dụng gồm Marine Broth, Marine Agar và Nutrition Broth 01 (Merck). Hóa chất chiết xuất và phân tích bao gồm chất chuẩn canthaxanthin (TRC Canada), lecithin đậu nành (Australia), glycerol monostearate (GMS), urea 98%, ethanol thực phẩm 96%, $\text{Na}_2\text{SO}_4$ khan, cùng các dung môi tinh khiết HPLC của hãng Sigma-Aldrich (methanol, acetone, n-hexane, dichloromethane, tetrahydrofuran, 2-propanol, acetonitrile, cyclohexane, chloroform).

Hệ thống thiết bị được chia theo các cụm công nghệ chuyên biệt:

• Hệ lên men: Thiết bị lên men BioFlo 510 SIP Bench (Mỹ), nồi lên men thí nghiệm 3 lít Marubishi (Nhật Bản), hệ pilot lên men 500 lít Marubishi (Nhật Bản), máy ly tâm bán liên tục CEPA Z61 (Đức), máy ly tâm lọc Maximizer 41 Green (WaterSep, Mỹ).
• Hệ chiết xuất và phân lập: Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-210, thiết bị siêu âm đồng hóa UP200St (Hielscher, Đức), bản mỏng silicagel 60 $\text{F}_{254}$, tủ sấy chân không, hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
• Hệ bào chế và kiểm tra liposome: Máy đùn mini màng polycarbonate kích thước lỗ 100 nm, máy phân tích kích thước hạt nano và thế zeta Horiba SZ-100 (Nhật Bản), máy/quạt so màu tiêu chuẩn DSM SalmoFan (Kaiseraugst, Thụy Sĩ).

Phương pháp thực nghiệm trình bày chi tiết cách định lượng sinh khối khô (sấy ở 105°C đến khối lượng không đổi theo Mira de Orduna), phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin theo Dan Qiu (chiết lỏng - lỏng bằng hỗn hợp nước, ethanol, chloroform; làm khan và hòa tan trong cyclohexane; đo quang học và phân tích sắc ký). Thiết kế thí nghiệm áp dụng quy hoạch thực nghiệm RSM trên phần mềm Design Expert 11.0: sàng lọc biến bằng ma trận Minimum Run Resolution IV và tối ưu hóa đa biến bằng mô hình Central Composite Design (Box - Hunter CCD) với các hàm mục tiêu gồm nồng độ sinh khối khô ($X$, g/L), hàm lượng canthaxanthin ($Y_1$, mg/L), hiệu suất tạo canthaxanthin ($Y_2$, mg/g SKK) và hàm lượng carotenoid tổng số.

Chương III: Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn

Chương III là chương bố trí các nội dung thực nghiệm công nghệ, xây dựng kế hoạch tối ưu hóa điều kiện lên men, thu hồi sinh khối, chiết tách và bao gói liposome:

• Khảo sát các thành phần môi trường dinh dưỡng: đánh giá ảnh hưởng của các nguồn carbon hữu cơ (glucose, sucrose, maltose), các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ (peptone, cao nấm men, urê), các muối khoáng vi lượng, các acid amin, vitamin và nồng độ NaCl đến tốc độ sinh trưởng và khả năng tích lũy canthaxanthin của chủng P. carotinifaciens VTP20181.
• Sàng lọc và tìm tâm thí nghiệm: bố trí ma trận Factorial Minimum Run Resolution IV Screening để đánh giá mức độ tác động của 6 yếu tố công nghệ lên men (nhiệt độ, pH ban đầu, tỷ lệ cấy giống, nồng độ oxy hòa tan/tốc độ cấp khí, tốc độ khuấy cơ học và thời gian lên men), nhằm loại bỏ các yếu tố kém ảnh hưởng và xác định khoảng biến thiên phù hợp cho tâm thí nghiệm.
• Xây dựng ma trận tối ưu hóa đa biến theo mô hình Box - Hunter (CCD) đối với các thông số lên men quan trọng nhất; phân tích phương sai ANOVA để xác định phương trình hồi quy bậc hai mô tả sự phụ thuộc của hàm mục tiêu $Y_1$ (hàm lượng canthaxanthin, mg/L) và $Y_2$ (sinh khối khô, g/L).
• Khảo sát công nghệ tách thu sinh khối sau lên men: tiến hành thực nghiệm so sánh phương pháp lắng trọng lực, phương pháp lọc dòng ngang bằng màng Maximizer 41 Green và phương pháp ly tâm bán liên tục trên máy ly tâm tốc độ cao CEPA Z61.
• Nghiên cứu quá trình chiết xuất canthaxanthin có hỗ trợ sóng siêu âm: khảo sát đơn biến các yếu tố nhiệt độ chiết, tỷ lệ dung môi ethanol/nguyên liệu sinh khối khô, thời gian siêu âm và công suất xung của thiết bị phát sóng UP200St. Thiết lập ma trận quy hoạch thực nghiệm RSM để tối ưu hóa quá trình chiết, kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm qua sắc ký lớp mỏng TLC và sắc ký lỏng cao áp HPLC.
• Nghiên cứu chế tạo vi hạt liposome: phối trộn lecithin đậu nành, canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol theo các tỷ lệ nồng độ ban đầu ($IC = 0,1%; 0,5%; 1,0%$), tạo màng film, phân tán trong đệm PBS (pH 7,4), đùn ép qua màng lọc polycarbonate 100 nm. Đánh giá kích thước hạt, thế zeta, chỉ số đồng đều PDI, hiệu suất bao gói (EE%), tải lượng (DL%), và thử nghiệm động học giải phóng canthaxanthin in vitro trong môi trường PBS ở pH 7,4.
• Bố trí thí nghiệm nuôi dưỡng cá hồi vân: phối trộn liposome canthaxanthin vào công thức thức ăn viên ép đùn thương phẩm, chia các lô thử nghiệm ngẫu nhiên trên cá hồi vân tại Sa Pa, thiết lập quy trình theo dõi khối lượng định kỳ và phương pháp phân tích chỉ số màu philê cơ thịt cá.

Chương IV: Kết quả và thảo luận

Chương IV trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, kết quả mô hình hóa toán học và thảo luận khoa học của luận án:

1. Kết quả tối ưu hóa quá trình lên men vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens VTP20181:

   • Thực nghiệm sàng lọc thành phần môi trường cho thấy chủng P. carotinifaciens VTP20181 sinh trưởng và tổng hợp canthaxanthin tốt trên nền môi trường bổ sung glucose kết hợp cao nấm men và peptone, với nồng độ muối NaCl thích hợp trong phạm vi ưa mặn trung bình.
   • Kết quả ma trận sàng lọc Minimum Run Resolution IV và phân tích phương sai ANOVA đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến quá trình lên men gồm: nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và tốc độ cấp khí/khuấy trộn.
   • Xây dựng thành công mô hình toán học bề mặt đáp ứng RSM-CCD bậc hai cho hai hàm mục tiêu $Y_1$ (hàm lượng canthaxanthin, mg/L) và $Y_2$ (sản lượng sinh khối, g/L). Kiểm định ANOVA cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê cao ($p < 0,0001$), các hệ số tương quan $R^2$ phù hợp với thực nghiệm. Biểu đồ bề mặt đáp ứng 3D thể hiện rõ tương tác giữa các yếu tố công nghệ và xác định được điểm cực trị tối ưu với mức độ đáp ứng nguyện vọng (Desirability) cao.
   • Đánh giá các phương pháp tách sinh khối cho thấy thiết bị ly tâm bán liên tục CEPA Z61 đạt hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất, vượt trội so với phương pháp lọc màng (dễ bị bít tắc màng do kích thước tế bào vi khuẩn nhỏ 0,4-0,9 $\mu\text{m}$) và phương pháp lắng tự nhiên.
   • Trên cơ sở các thông số tối ưu, tác giả đã hoàn thiện và chạy thành công quy trình công nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ Paracoccus carotinifaciens VTP20181 ở quy mô pilot 80-100 lít/mẻ trên nồi lên men 500 lít.

2. Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin bằng sóng siêu âm:

   • Khảo sát đơn biến các thông số công nghệ chỉ ra rằng: khi nhiệt độ tăng từ 30°C đến 50°C, hiệu suất chiết tăng dần do giảm độ nhớt dung môi và tăng độ khuếch tán; tuy nhiên nhiệt độ vượt quá 55-60°C làm tăng phân hủy nhiệt của carotenoid. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và công suất siêu âm của thiết bị UP200St tỷ lệ thuận với lượng canthaxanthin chiết được cho đến khi đạt ngưỡng xâm thực bão hòa.
   • Kết quả quy hoạch thực nghiệm RSM cho quá trình chiết xuất xác định được phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ giữa hàm lượng canthaxanthin ($Y_1$) và hàm lượng carotenoid tổng số ($Y_2$) theo các biến nhiệt độ, tỷ lệ dung môi, thời gian và công suất siêu âm. Thực nghiệm kiểm chứng ở điều kiện tối ưu trong phòng thí nghiệm cho độ sai lệch rất nhỏ so với giá trị lý thuyết dự đoán từ mô hình.
   • Tinh chế và phân lập thành công hợp chất canthaxanthin sạch; phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy mũi pic sắc ký canthaxanthin phân lập trùng khớp hoàn toàn với chất chuẩn thương mại của hãng TRC Canada về thời gian lưu và phổ hấp thụ đặc trưng.

3. Kết quả tổng hợp và đánh giá đặc tính của hệ vi hạt nano liposome:

   • Chế tạo thành công các mẫu: liposome đối chứng (rỗng), liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa $\alpha$-tocopherol và liposome đồng chứa canthaxanthin + $\alpha$-tocopherol ở các nồng độ ban đầu $IC = 0,1%; 0,5%; 1,0%$.
   • Kích thước hạt trung bình của các hệ hạt phân bố trong dải kích thước nano đồng đều sau khi qua màng đùn 100 nm, chỉ số phân tán PDI thấp phản ánh hệ phân tán ổn định.
   • Giá trị hiệu suất đóng gói ($EE$, %) và tải lượng thuốc ($DL$, %) của các hệ liposome được xác định qua phép đo lặp 3 lần ($n=3$, trình bày dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn SD) ghi nhận hiệu suất đóng gói canthaxanthin đạt mức cao khi có mặt $\alpha$-tocopherol.
   • Thử nghiệm in vitro giải phóng hoạt chất trong dung dịch đệm PBS ở pH 7,4 chỉ ra rằng hệ liposome đồng bao gói canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol có tốc độ giải phóng chậm, kéo dài và lượng canthaxanthin bảo toàn cao hơn đáng kể so với hệ liposome chỉ chứa canthaxanthin đơn thuần (do $\alpha$-tocopherol đóng vai trò chất chống oxy hóa ngăn chặn sự phân hủy của canthaxanthin trong môi trường thử nghiệm).

4. Kết quả thử nghiệm bổ sung liposome canthaxanthin trong chăn nuôi cá hồi vân:

   • Đánh giá khả năng sinh trưởng: Sau 3 tháng cho ăn thử nghiệm tại Sa Pa, các nhóm cá hồi vân ăn thức ăn có bổ sung liposome chứa canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol đều sinh trưởng khỏe mạnh, tăng trọng lượng đều đặn, không có sai khác tiêu cực về tỷ lệ sống hay hệ số chuyển hóa thức ăn so với lô đối chứng.
   • Phân tích thành phần dinh dưỡng cơ thịt cá sau 3 tháng thử nghiệm ($n=3$, đơn vị tính: % khối lượng ướt) cho thấy các chỉ tiêu độ ẩm, protein thô, lipid thô và khoáng tổng số trong cơ thịt cá ở các lô thí nghiệm duy trì ổn định, tương đương với đặc tính sinh lý tự nhiên của cá hồi vân thương phẩm.
   • Định lượng sắc tố tích lũy trong cơ thịt cá bằng HPLC: Ghi nhận sự xuất hiện và gia tăng rõ rệt của hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ thịt cá hồi được nuôi bằng chế độ ăn bổ sung liposome canthaxanthin, trong khi lô đối chứng không phát hiện hoặc chỉ có lượng vết sắc tố.
   • Đánh giá màu sắc cơ philê bằng máy/quạt đo màu quang học DSM SalmoFan: Các miếng philê cá hồi vân được đo màu lặp 3 lần ($n=3$) tại thời điểm ban đầu ($T_0$), sau 1 tháng ($T_1$), 2 tháng ($T_2$) và kết thúc 3 tháng ($T_3$). Kết quả đo màu SalmoFan thể hiện qua bảng số liệu thực nghiệm trong văn bản cho thấy chỉ số màu sắc tăng dần theo thời gian cho ăn; nhóm cá sử dụng thức ăn bổ sung liposome đồng chứa canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol đạt điểm màu đỏ-cam SalmoFan cao nhất và có độ đồng đều bề mặt cơ thịt vượt trội so với các nhóm đối chứng.

Bảng tổng hợp các biến công nghệ và phương pháp kiểm tra chính trong Chương IV:

Đối tượng công nghệ	Thông số / Biến đầu vào	Hàm mục tiêu / Đầu ra	Phương pháp / Thiết bị đo kiểm
Lên men sinh tổng hợp	Nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống, tốc độ khuấy, lưu lượng cấp khí	Sinh khối khô ($X$, g/L); Canthaxanthin ($Y_1$, mg/L); Hiệu suất ($Y_2$, mg/g SKK)	Sấy khô 105°C (Mira de Orduna); Trích ly mẫu (Dan Qiu); UV-Vis; HPLC
Tách sinh khối	Thiết bị phân ly cơ học	Hiệu suất thu hồi sinh khối sau lên men (%)	Máy ly tâm CEPA Z61; Ly tâm lọc Maximizer 41 Green
Chiết xuất siêu âm	Nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/NL, thời gian, công suất siêu âm	Hàm lượng canthaxanthin ($Y_1$); Hàm lượng carotenoid tổng ($Y_2$)	Thiết bị siêu âm UP200St; Cô quay Buchi R-210; HPLC; TLC silicagel $\text{F}_{254}$
Chế tạo liposome	Tỷ lệ $IC$ ($0,1%; 0,5%; 1,0%$); canthaxanthin; $\alpha$-tocopherol	Cỡ hạt (nm); PDI; Thế zeta; Hiệu suất bao gói EE (%); Tải lượng DL (%)	Máy đùn màng 100 nm; Thiết bị Horiba SZ-100; Động học giải phóng trong PBS pH 7,4
Nuôi cá hồi vân	Khẩu phần thức ăn bổ sung liposome (3 tháng)	Sinh trưởng khối lượng; Dinh dưỡng cơ (% ướt); Màu sắc philê cá	Phân tích cơ ($n=3$); Định lượng canthaxanthin bằng HPLC; Quạt so màu DSM SalmoFan

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được những kết quả và đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và thực tiễn công nghệ như sau:

• Về mặt lý luận khoa học:

  1. Đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về đặc tính sinh lý, dinh dưỡng và khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của chủng vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181; làm rõ mối tương quan giữa nồng độ muối NaCl, nguồn cơ chất carbon, nitơ hữu cơ và các yếu tố công nghệ lên men đến sự hình thành sinh khối và tích lũy sắc tố.
  2. Ứng dụng thành công phương pháp toán học bề mặt đáp ứng (RSM-CCD) để giải quyết bài toán tối ưu hóa đa biến trong hai quá trình kỹ thuật hóa học then chốt: lên men sinh tổng hợp canthaxanthin và trích ly canthaxanthin có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE).
  3. Chứng minh được cơ sở khoa học của việc đồng bao bọc canthaxanthin cùng với chất chống oxy hóa tự nhiên $\alpha$-tocopherol trong hệ vi hạt nano liposome lecithin đậu nành; khẳng định $\alpha$-tocopherol có tác dụng bảo vệ cấu trúc liên kết đôi polyene kém bền của canthaxanthin, đồng thời làm tăng tốc độ và tỷ lệ giải phóng hoạt chất in vitro trong môi trường mô phỏng sinh lý (PBS pH 7,4).

• Về mặt thực tiễn và công nghệ:

  1. Xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ chủng vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 ổn định ở quy mô pilot 80-100 lít/mẻ trên hệ thống thiết bị lên men 500 lít, kết hợp kỹ thuật thu hồi sinh khối hiệu quả bằng máy ly tâm bán liên tục CEPA Z61.
  2. Thiết lập quy trình công nghệ chiết xuất canthaxanthin bằng dung môi ethanol thực phẩm có hỗ trợ sóng siêu âm đạt hiệu suất cao, thời gian ngắn và độ tinh sạch cao, có khả năng áp dụng ở quy mô mở rộng.
  3. Hoàn thiện quy trình chế tạo chế phẩm nano liposome chứa canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol kích thước hạt đồng đều quanh ngưỡng 100 nm, có độ ổn định phân tán cao.
  4. Lần đầu tiên ứng dụng thành công chế phẩm liposome canthaxanthin phối trộn vào thức ăn viên ép đùn trong chăn nuôi thực nghiệm cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) tại Sa Pa (Lào Cai). Kết quả chứng minh chế phẩm an toàn đối với sinh trưởng của cá, làm tăng hàm lượng canthaxanthin tích lũy trong mô cơ và nâng cao rõ rệt chỉ số cảm quan màu sắc cơ philê cá hồi theo tiêu chuẩn quạt so màu DSM SalmoFan.

Về mặt kiến nghị giải pháp: Luận án đề xuất tiếp tục nghiên cứu nâng quy mô sản xuất lên men ở mức công nghiệp lớn hơn (trên các nồi lên men thể tích hàng nghìn lít), đồng thời hoàn thiện quy trình công nghệ sấy và bảo quản chế phẩm liposome dưới dạng bột vi bọc để thuận tiện cho việc lưu kho dài hạn và phối trộn công nghiệp tại các nhà máy chế biến thức ăn thủy sản.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ trên các nội dung và phạm vi nghiên cứu được công bố trong văn bản luận án, công trình có một số hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:

• Thử nghiệm nuôi dưỡng và bổ sung chế phẩm liposome canthaxanthin mới được tiến hành bước đầu trên đối tượng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) trong thời gian 3 tháng nuôi thực nghiệm ở quy mô bể thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản nước lạnh Sa Pa, chưa theo dõi kéo dài qua toàn bộ chu kỳ sinh trưởng từ giai đoạn cá hương, cá giống đến khi thu hoạch xuất bán thương phẩm đại trà.
• Thử nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin từ P. carotinifaciens VTP20181 mới dừng lại ở quy mô pilot 80-100 lít/mẻ trong phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm; chưa khảo sát đầy đủ các thông số truyền nhiệt, truyền khối và tiêu hao năng lượng khi vận hành ở quy mô sản xuất công nghiệp lớn.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung: tối ưu hóa chi phí sản xuất ở quy mô lớn; khảo sát độ ổn định hóa lý và thời hạn bảo quản của chế phẩm nano liposome canthaxanthin trong các điều kiện đóng gói và nhiệt độ môi trường khác nhau; mở rộng đánh giá hiệu quả tạo màu và tăng cường miễn dịch của chế phẩm trên các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế khác như tôm sú, tôm thẻ chân trắng hoặc cá tầm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị tham khảo kỹ thuật và học thuật thực tiễn cho nhiều nhóm đối tượng:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên thuộc các chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Sinh học, Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Nuôi trồng Thủy sản: Công trình cung cấp quy trình bài bản về thiết kế quy hoạch thực nghiệm RSM-CCD trên phần mềm Design Expert 11.0, các kỹ thuật phân tích sắc ký HPLC, TLC, và phương pháp bào chế hệ dẫn thuốc nano liposome bằng phương pháp ép đùn màng lọc.
• Đối với các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi và cơ sở nuôi trồng thủy sản nước lạnh: Cung cấp công thức thức ăn ép đùn hoàn chỉnh (chứa 42,3% protein và 23,9% lipid) và giải pháp kỹ thuật bổ sung sắc tố canthaxanthin dạng vi hạt nano liposome giúp cải thiện màu sắc cơ thịt cá hồi vân theo chuẩn DSM SalmoFan, tạo tiền đề thay thế nguồn phụ gia nhập khẩu.
• Đối với các cán bộ quản lý nông nghiệp và khuyến ngư tại các địa phương có tiềm năng nuôi cá nước lạnh (như Lào Cai, Lai Châu, Lâm Đồng): Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích để xây dựng các mô hình chuỗi sản xuất cá hồi thương phẩm chất lượng cao, an toàn vệ sinh thực phẩm và nâng cao năng lực cạnh tranh cho sản phẩm cá hồi nội địa.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi sinh vật được tuyển chọn để sinh tổng hợp canthaxanthin trong luận án là chủng nào và có nguồn gốc từ đâu? Chủng vi sinh vật được sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu của luận án là vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181. Chủng này được phân lập, sàng lọc và tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm.

2. Canthaxanthin có công thức cấu tạo hóa học và các thông số vật lý cơ bản như thế nào theo văn bản luận án? Canthaxanthin có tên khoa học là $\beta,\beta$-Carotene-4,4'-dione, thuộc nhóm diketo-carotenoid với hai nhóm keto đối xứng tại vị trí C4 và C4' của vòng $\beta$-ionone và mạch trung tâm chứa 9 liên kết đôi $\text{C}=\text{C}$ (tổng cộng phân tử có 13 liên kết đôi). Công thức phân tử là $\text{C}{40}\text{H}{52}\text{O}2$, khối lượng phân tử $M = 564,82\text{ g/mol}$, nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 211 - 212°C (kèm theo hiện tượng phân hủy). Phổ hấp thụ bức xạ cực đại ($\lambda{\max}$) của hoạt chất đạt 482 nm trong dung môi $\text{CHCl}_3$, 474 nm trong $\text{C}_2\text{H}_5\text{OH}$ và 466 nm trong ether dầu hỏa.

3. Quy mô công nghệ lên men và thiết bị tách thu sinh khối được hoàn thiện trong luận án đạt mức bao nhiêu? Luận án đã hoàn thiện quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 đạt quy mô pilot 80 - 100 lít/mẻ trên hệ thống nồi lên men pilot 500 lít Marubishi (Nhật Bản). Để thu hồi sinh khối vi khuẩn sau lên men, tác giả đã lựa chọn và ứng dụng thiết bị máy ly tâm bán liên tục CEPA Z61 (Đức), đạt hiệu suất tách thu vượt trội so với các phương pháp lọc màng và lắng tĩnh.

4. Tại sao tác giả lại đưa đồng thời $\alpha$-tocopherol cùng với canthaxanthin vào cấu trúc liposome? Theo giải thích và số liệu thực nghiệm trong luận án, khi hệ hạt liposome chỉ bao gói đơn độc hoạt chất canthaxanthin thì hiệu quả giải phóng hoạt chất in vitro không cao và canthaxanthin dễ bị oxy hóa phân hủy cấu trúc polyene. Việc bổ sung đồng thời $\alpha$-tocopherol (vitamin E) đóng vai trò chất chống oxy hóa bảo vệ, giúp hệ liposome bền vững hơn, tăng hiệu suất giải phóng canthaxanthin trong dung dịch đệm sinh lý PBS (pH 7,4), từ đó nâng cao độ hấp thu và khả năng lắng đọng sắc tố vào mô cơ thịt của cá hồi.

5. Phương pháp và thiết bị nào được sử dụng để đánh giá màu sắc cơ thịt cá hồi vân trong thử nghiệm cho ăn? Tác giả đã sử dụng thiết bị/quạt đo màu quang học tiêu chuẩn DSM SalmoFan (Kaiseraugst, Thụy Sĩ) để xác định điểm số màu sắc của các lát philê cơ thịt cá hồi vân lấy từ các lô thí nghiệm khác nhau tại thời điểm ban đầu ($T_0$), sau 1 tháng ($T_1$), 2 tháng ($T_2$) và kết thúc 3 tháng ($T_3$) thử nghiệm (mỗi lô đo lặp 3 lần, $n=3$). Đồng thời, tác giả kết hợp kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để định lượng chính xác hàm lượng canthaxanthin tích lũy thực tế trong mô cơ của cá.

Kết luận

Luận án tiến sĩ Kỹ thuật Hóa học của tác giả Đặng Việt Anh đã giải quyết trọn vẹn chuỗi công nghệ từ khâu nghiên cứu đặc tính sinh tổng hợp, tối ưu hóa các thông số lên men chủng vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 ở quy mô pilot 80-100 lít/mẻ, đến tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin bằng sóng siêu âm. Công trình đã chế tạo thành công hệ dẫn vi hạt nano liposome lecithin đậu nành đồng bao gói canthaxanthin và $\alpha$-tocopherol, giúp nâng cao độ ổn định và cải thiện động học giải phóng hoạt chất in vitro. Thử nghiệm thực địa trong 3 tháng trên cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) tại Sa Pa đã khẳng định tính an toàn sinh học của chế phẩm, chứng minh khả năng làm tăng nồng độ canthaxanthin lắng đọng trong cơ thịt và nâng cao rõ rệt chất lượng màu sắc philê cá theo thang đo DSM SalmoFan. Kết quả của luận án đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy và hoàn thiện giải pháp kỹ thuật có khả năng ứng dụng thực tiễn cao cho ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên và công nghệ chế biến thức ăn nuôi trồng thủy sản nước lạnh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Vài nét về Carotenoid Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong các loài sinh vật quang hợp như là tảo, một vài loài nấm, một vài loài vi khuẩn và thực vật. Đến nay đã tìm được hơn 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyl và carotene [10]. Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử carbon) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprene.

Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng thực phẩm có chứa carotenoid trong bữa ăn để tăng sức đề kháng và bảo vệ bản thân mình. Carotenoid còn có tác dụng chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Carotenoid được chia thành 2 loại là: carotene và xanthophyll. + Các carotene: có màu da cam, đỏ, là những hydrocác bon (C40H58) có 1 mạch chính 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 liên kết đôi mạch nhánh, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi.

Ví dụ: α-carotene, β-carotene và lycopene. + Xanthophyl: là các phân tử chứa oxi, thường có màu vàng. Ví dụ: lutein và zeaxanthin. Một số carotenoid tìm thấy trong thuỷ sản như: canthaxanthin, astaxanthin, zeaxanthin, tuna xanthin, lutein, beta carotene, doradexanthin, erichinenone.

Giới thiệu về Canthaxanthin Hình 1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) Canthaxanthin có tên khoa học là β-β carotene-4,4’- dione, là một trong những dẫn xuất của β-carotene có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thậm chí trội hơn β- carotene. Hoạt chất này thuộc nhóm diketo-carotenoid (4,4’-oxo-carotenoid) với nhóm keto đối xứng ở vị trí 4 và 4’ của vòng β-ionone, 9 nhóm liên kết đôi C=C ở trung tâm phân tử hoạt động như cấu tử hấp phụ ánh sáng, tạo ra màu đỏ-cam của hoạt chất [11], [12]. Công thức phân tử của canthaxanthin: C40H52O2 14 Khối lượng phân tử M=564.82g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 211  2120C (kèm phân hủy) Hấp phụ cực đại tại bước sóng λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466 nm (ete dầu hỏa).

Cúng giống như các carotenoid khác, canthaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh, dễ bị phân hủy khi để trong không khí, hoà tan tốt trong các dung môi kém phân cực. Công thức phân tử của canthaxanthin thì tương tự như β-caroten nhưng phức tạp hơn. canthaxanthin có 13 nối đôi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đôi vì vậy khả năng chống oxi hóa của nó cũng cao hơn β-caroten. Canthaxanthin tồn tại tương đối phổ biến trong tự nhiên, được phân lập đầu tiên từ, loài nấm ăn được Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo [11].

Canthaxanthin cũng được tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trưởng cùng với một số các caroten khác [12]. Ngoài ra, nó còn được phát hiện ở các loài vi khuẩn [10], động vật giáp xác [13] và ở nhiều loài cá như cá chép [14], cá đối vàng, cá tráp biển [15]. Canthaxanthin không được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Đại Tây Dương nhưng được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Thái Bình Dương và một số loài cá hồi khác [13]. Tính chất vật lý của canthaxanthin Tính tan: canthaxanthin rất ít tan trong nước vì nó là hợp chất không phân cực, nó tan trong các dung môi hữu cơ như ete, cồn, pyridine, dầu mỏ, dầu thực vật.

Khả năng hấp thụ ánh sáng và màu sắc: canthaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu đỏ cam. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canthaxanthin có thể bị thay đổi khi canthaxanthin liên kết với các chất khác. Trong các động vật giáp xác như cua, tôm canthaxanthin thường liên kết với phân tử protein (crutacyanin) có max = 628nm tạo nên màu xanh đặc trưng của các loài giáp xác sống. Khi có tác dụng của nhiệt, liên kết bị phá hủy các canthaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.

Tính chất hóa học của canthaxanthin Trong phân tử canthaxanthin có chuỗi polyen, liên kết với các nhóm keto, hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên canthaxanthin rất nhạy với nhiệt độ cao, ánh sáng và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Tốc độ oxy hóa canthaxanthin diễn ra nhanh khi có sự xuất hiện của ion kim loại, sunfit, độ ẩm, hoặc để trong không khí. 15 Tính chất oxy hóa: canthaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxy hóa bởi tác nhân electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi canthaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Tính chất chống oxy hóa của canthaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng giữ lại các gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng.

Phản ứng với axít: canthaxanthin phản ứng với, axít yếu làm dịch chuyển cực đại hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài, nhưng trung hòa bằng bazơ yếu, cấu trúc phân tử canthaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như: HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của canthaxanthin làm giảm màu đỏ cam. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản - Canthaxanthin có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào, tạo mầu sắc cho cơ thịt, tăng cường khả năng đề kháng, tăng khả năng tăng trưởng, tăng cường năng suất sinh sản, chống lại sự oxy hóa và chống lại các tia tử ngoại của một số loài thủy sản. Ứng dụng của canthaxanthin Trong thực phẩm thì màu sắc bên ngoài là yếu tố quan trọng thu hút người tiêu dùng. - Canthaxanthin là chất màu chính trong vỏ và các cơ quan bên trong của các loài động vật giáp xác, nó chiếm từ 86 ÷ 98% của tổng lượng carotenoid.

Màu đỏ tạo ra do quá trình gia nhiệt, protein bị biến tính làm đứt các liên kết giữa phức hợp carotenprotein làm giải phóng canthaxanthin tự do. Màu sắc cuối cùng phụ thuộc vào hàm lượng của canthaxanthin còn lại trong thịt cơ và vỏ của các loài giáp xác. - Với một số thực phẩm có nguồn gốc từ các loài giáp xác sau chế biến bị giảm mầu hoặc mất mầu, có thể bổ sung canthaxanthin như một phụ gia sẽ làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm. - Mục đích của việc bổ sung chất màu vào thực phẩm nhằm: + Khôi phục lại màu sắc đã bị mất trong quá trình bảo quản, chế biến (khi tiếp xúc với nhiệt độ, độ ẩm, không khí …).

+ Làm tăng màu của thực phẩm trong giới hạn cho phép. + Điều chỉnh màu sắc tự nhiên của thực phẩm, khi màu tự nhiên không đủ để thể hiện màu sắc cho sản phẩm. 16 + Làm đồng nhất màu sắc thực phẩm + Làm thực phẩm có màu hấp dẫn đối với người tiêu dùng Đến nay, có rất nhiều tài liệu đã chứng minh rằng canthaxanthin là một chất an toàn về mặt thực phẩm. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin 1.

Giới thiệu chung về chi Paracoccus Năm 1992, các tác giả đã mô tả Paracoccus là một Prokaryote gồm có 2 loài là P. Sau đó, chủng Paracoccus halodenitrificans bị loại trừ bởi vì nó được chứng minh là một thành viên của chi Halomonas thuộc ngành Proteobacteria [17]. Tính đến năm 2006, tổng cộng đã phát hiện 14 loài mới của Paracoccus dựa trên mô tả và phân tích trình tự gen bao gồm các loài: vi khuẩn hóa tự dưỡng lưu huỳnh P.Versutus Các chủng thuộc chi Paracoccus thuộc cầu khuẩn có đường kính từ 0,4 ÷ 0,9µm, hoặc trực cầu khuẩn (coccobacilli) có chiều dài lên đến 2 µm ở dạng tế bào đơn, tế bào đôi, chuỗi tế bào. Paracoccus là vi khuẩn gram âm và hầu hết các loài đều không di động.

Các loài thuộc Paracoccus là vi khuẩn hiếu khí, phát triển nhanh trên môi trường các chất hữu cơ, một số loài có khả năng phát triển trọng môi trường yếm khí với nitrate hoặc oxide ni tơ là tác nhân oxy hóa và tạo ra sản phẩm cuối cùng là dinito. Khả năng lên men của Paracoccus chưa được biết đến nhiều trong các công bố. Paracoccus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-37°C, pH= 6,5-8,5, ngoại trừ P.alcaliphilus phát triển ở pH=8-9.5 và phát triển yếu ở pH= 7. Tất cả các chủng Paracoccus được kiểm tra cho đến nay đều chứa ubiquinone-10 là một quinone hô hấp, như mong đợi đối với các thành viên thuộc phân lớp α-3 của Proteobacteria, ngoài ra còn một lượng nhỏ ubiquinone-9 và ubiquinone-11 cũng được báo cáo ở một số chủng.

Một số chủng có thể tích lũy poly-β-hydroxybutyrate trong điều kiện đủ các bon và có hoạt tính catalase và oxydase. Để mô tả các đặc điểm chung của chi là xuất phát từ các đặc tính của P.versutus, không áp dụng cho một số chủng được phân lập gần đây. Các quy trình nuôi cấy làm giàu (tăng mật độ giống) một số chủng Paracoccus phụ thuộc vào việc lựa chọn một trong hai con đường là tự dưỡng hoặc chuyển hóa methan (methylotrophic) trong môi trường oxy hóa với hydro hoặc methylamine (với sự có mặt của các bon dioxide) hoặc của các chủng khử nitơ trong điều kiện anoxic 17 (nitrat hóa và khử nitrat) với nitrat là chất oxy hóa và các hợp chất hữu cơ như là nguồn các bon và năng lượng [19]. Sự tăng, trưởng của hầu hết các vi khuẩn oxy hóa hydro tự dưỡng ưa ấm trung bình (mesophilic) là chậm hoặc không thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy khử nitơ và kỵ khí [20].

Một số, chủng cũng có khả năng tăng trưởng tự dưỡng tốt trên formate và trong số đó có ba chủng là P. Do đó, làm giàu lượng giống bằng lên men kỵ khí với formate, các bon dioxide và nitrate (hoặc nitrous oxide) có thể phù hợp với 2 chủng P.denitrificans và P.denitrificans tăng trưởng tự dưỡng yếu trên methanol trong điều kiện khử nitrat. Một số chủng Paracoccus có thể phát triển tự dưỡng bằng cách sử dụng quá trình oxy hóa thiosulfate để cung cấp năng lượng, trong khi P.pantotrophus có thể sử dụng, các hợp chất cacbon disulfide (CS2) và methyl hóa hợp chất sulfur [21] và P.thiocyanatus có thể phát triển tự dưỡng hiếu khí trên thiocyanate [22]. Những cơ chất này đã giúp làm giàu mẫu và phân lập, được các chủng Paracoccus mới.

Hiện nay, các chủng Paracoccus là nguồn sản phẩm sinh học tiềm năng chưa được khai thác một cách hiệu quả, khai thác thương mại mới sử dụng một số chủng. Hỗn hợp tế bào cố định 2 chủng P.denitrificans và Corynebacterium đã dùng để sản xuất liên tục L-phenylalanine từ acid acetamidocinnamic và 2 chủng P.marcusii sản xuất quy mô công nghiệp canthaxanthin [16], [23]. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi sử dụng chủng: Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme - Viện Công nghiệp Thực phẩm để tiến hành thực hiện các nghiên cứu. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin Quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bắt đầu bởi sự chuyển hóa, acetyl CoA thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA, (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA synthase.