Luận văn thạc sĩ: Tinh chế Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli ở quy mô nồi lên men

Luận văn thạc sĩ phân tích hus tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Đào Trọng Khoa
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tinh chế Interleukin-2 người tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư
• 1.2. Khái niệm về bệnh ung thư
• 1.3. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Các phương pháp điều trị ung thư
• 1.5. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.6. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.7. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2. Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.8. Hệ thống lên men nuôi cấy E. coli tái tổ hợp
• 1.9. Tinh sạch protein dạng thể vùi
• 1.10. Tổng quan về tinh sạch protein
• 1.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• 1.12. Công thức pha chế bán thành phẩm
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng giống và vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi khuẩn E. coli BL21 DE3
• 2.3. Vector biểu hiện
• 2.4. Máy móc và thiết bị
• 2.5. Các môi trường và dung dịch
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E. coli ở quy mô nồi lên men 5 lít
• 2.8. Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2
• 2.9. Phương pháp tinh chế Interleukin-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 2.10. Kiểm tra sản phẩm protein bằng điện di SDS-PAGE
• 2.11. Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western Blot
• 2.12. Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm và đông khô
• 2.13. Phương pháp xử lý kết quả điện di SDS-PAGE bằng phần mềm Quantity One
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn
• 3.2. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng
• 3.4. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 IL-2
• 3.5. Lên men chủng E. coli BL21 IL-2 đợt 2
• 3.6. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp
• 3.7. Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC
• 3.8. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One
• 3.9. Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu Interleukin 2 tái tổ hợp trong E

Nghiên cứu về Interleukin-2 (IL-2) tái tổ hợp trong E. coli đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. IL-2 là một cytokine có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, đặc biệt trong điều trị ung thư. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của IL-2 mà còn mở ra hướng đi mới trong sản xuất dược phẩm sinh học.

1.1. Khái niệm về Interleukin 2 và vai trò của nó

Interleukin-2 là một cytokine được sản xuất chủ yếu bởi tế bào T. Nó có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển và hoạt động của các tế bào miễn dịch. IL-2 được sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thư, đặc biệt là ung thư thận và ung thư hắc tố. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong E. coli giúp tạo ra nguồn cung cấp dồi dào và tiết kiệm chi phí.

1.2. Tình hình nghiên cứu IL 2 trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng IL-2 có thể cải thiện khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư. Các sản phẩm IL-2 tái tổ hợp như Proleukin® đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị. Tuy nhiên, giá thành cao của sản phẩm này vẫn là một rào cản lớn, đặc biệt ở các nước đang phát triển.

II. Thách thức trong sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu, việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của sản phẩm, chi phí sản xuất và khả năng biểu hiện protein trong E. coli cần được giải quyết. Những thách thức này ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả và khả năng thương mại hóa sản phẩm.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết của protein

Độ tinh khiết của Interleukin-2 là một yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả điều trị. Việc tách chiết và tinh chế protein từ E. coli thường gặp khó khăn do sự hiện diện của các protein không mong muốn. Các phương pháp tinh chế như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cần được tối ưu hóa để đạt được độ tinh khiết cao nhất.

2.2. Chi phí sản xuất và khả năng thương mại hóa

Chi phí sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp vẫn còn cao, điều này làm giảm khả năng tiếp cận của bệnh nhân. Việc nghiên cứu và phát triển quy trình sản xuất hiệu quả hơn là cần thiết để giảm giá thành và tăng khả năng thương mại hóa sản phẩm.

III. Phương pháp sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp trong E

Để sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp, quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men là một phương pháp hiệu quả. Quy trình này bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy vi khuẩn, và thu hoạch protein. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để đạt được năng suất cao.

3.1. Quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men

Quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường, cấy giống, và theo dõi các thông số như pH, nhiệt độ và nồng độ oxy. Việc kiểm soát các yếu tố này giúp tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Interleukin-2.

3.2. Kỹ thuật tinh chế Interleukin 2

Sau khi thu hoạch, Interleukin-2 cần được tinh chế để loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di SDS-PAGE được sử dụng để đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính của protein. Việc áp dụng các kỹ thuật này giúp nâng cao chất lượng sản phẩm cuối cùng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Interleukin 2 tái tổ hợp

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác. Việc sử dụng IL-2 trong liệu pháp miễn dịch đã cho thấy hiệu quả tích cực trong việc cải thiện tình trạng bệnh nhân. Nghiên cứu này không chỉ mang lại lợi ích cho bệnh nhân mà còn mở ra cơ hội cho ngành công nghiệp dược phẩm tại Việt Nam.

4.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

IL-2 đã được chứng minh có hiệu quả trong việc kích thích hệ miễn dịch, giúp tiêu diệt tế bào ung thư. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp cung cấp nguồn dược phẩm chất lượng cao cho bệnh nhân ung thư, đặc biệt là ở các nước đang phát triển.

4.2. Tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển

Nghiên cứu về Interleukin-2 tái tổ hợp mở ra nhiều cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực miễn dịch học và công nghệ sinh học. Việc phát triển các sản phẩm mới từ IL-2 có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết để nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng thực tiễn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y tế và công nghệ sinh học tại Việt Nam.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli có thể đạt được năng suất cao và độ tinh khiết tốt. Các phương pháp tinh chế hiện đại đã được áp dụng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và phát triển các sản phẩm mới từ Interleukin-2. Việc hợp tác giữa các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sẽ là chìa khóa để đưa sản phẩm ra thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh ung thư 1. Khái niệm về bệnh ung thư Ở hầu hết các mô và cơ quan của cơ thể trưởng thành, quá trình sản sinh ra các tế bào mới và quá trình tiêu diệt các tế bào già được giữ ở trạng thái cân bằng. Mỗi loại tế bào khác nhau trong cơ thể có một thời gian tồn tại nhất định, sẽ được thay thế bằng bằng các tế bào mới có cùng chức năng khi tế bào đó chết đi.

Dưới các điều kiện bình thường, sự sản sinh của các tế bào mới được kiểm soát để số lượng một loại tế bào bất kỳ nào trong cơ thể là tương đối ổn định [5]. Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u (tumor). Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành ác tính (malignant).

Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis). Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [4]. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy xương [26]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào bình thường dần tạo nên các khối u gồm nhiều lớp tế bào chồng chất lên nhau.

Nếu các tế bào khối u khu trú ở một vùng duy nhất của cơ thể, không có biểu hiện xâm lấn các mô xung quanh thì được gọi là khối u lành tính. Ngược lại nếu các tế bào khối u tách khỏi vị trí ban đầu và xâm lấn ra các mô khác của cơ thể thì được gọi là khối u ác tính. Các khối u lành tính thường khá an toàn trừ khi kích thước của chúng quá lớn dẫn đến chèn ép các cơ quan hoặc các cấu trúc sống khác. Các khối u ác tính thì ngược lại, thường gây hậu quả nghiêm trọng vì xâm lấn đến các cơ quan khác, lan ra những mô ở xa hơn và hình thành những khối u thứ cấp (di căn) gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của các cơ quan đó.

Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học U lành tính U ác tính Tế bào biệt hóa cao Tế bào ít biệt hóa Phân bào ít và chậm Phân chia nguyên phân liên tục Không xâm lấn xung quanh Xâm lấn lan rộng Không có hoại tử Thường có hoại tử trung tâm Có vỏ bọc Không có vỏ bọc Rất ít tái phát Luôn tái phát Không di căn Di căn Ít ảnh hưởng đến cơ thể Ảnh hưởng lớn đến chức năng bình thường đến cơ thể Trước kia các nhà nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện các nguyên nhân gây bệnh, vì vậy ung thư được xếp vào 3 nhóm dựa vào nguyên nhân gây bệnh như sau: (1) các virus gây ung thư, (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư, (3) một số trường hợp ung thư mang tính di truyền như bệnh ung thư ruột do di truyền có tên là Familial Polyposis, bướu Wilms. Vào các năm 1980 – 1990, khi các kỹ thuật di truyền được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, dù ung 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thư có biểu hiện rất đa dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn nguyên của bệnh thực chất là do các sai hỏng của gene, hay nói cách khác là sự rối loạn của bộ máy di truyền [29]. Tuy vậy, thông thường phải có vài sai hỏng xảy ra đồng thời mới chuyển một tế bào bình thường sang trạng thái ung thư. Các nhà nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gene chính khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư.

Nhóm thứ nhất bao gồm các gene thúc đẩy quá trình phân chia tế bào một cách không kiểm soát, được gọi là các gene gây khối u (hay gene ung thư, oncogene). Các gene gây khối u điển hình nhất được tìm thấy đầu tiên ở các retrovirut. Liên quan đến những gene này là các tiền gene gây khối u (proto-oncogene) được tìm thấy ở các tế bào chủ. Các tiền gene gây khối u có thể đột biến thành các gene gây khối u.

Nhóm thứ hai bao gồm các gene khi ở dạng bình thường có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào, được gọi là các gene ức chế khối u (tumor suppressor gene, còn gọi là gene kiềm chế gene ung thư). Một nhóm các gene này trực tiếp tham gia vào các cơ chế sửa chữa DNA, nên khi bị đột biến chúng lại làm tăng tần số đột biến của những gene khác, vì vậy dạng đột biến của chúng được gọi là các gene gây đột biến (mutator gene) [4]. Một số gene ung thư và gene ức chế khối u liên quan đến ung thư ở người [27] Gene ung thư Bcl-2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung thư bạch cầu. c-myc Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi.

L-myc Liên quan đến ung thư phổi. PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trưởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thư não. RET Liên quan đến ung thư tuyến giáp. Ki-ras Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy.

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] N-ras Liên quan đến ung thư máu. Gene ức chế khối u APC Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày. DPC4 Mã hóa cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào, liên quan đến ung thư tuyến tụy. p53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và kích thích tế bào bất thường tự chết.

Liên quan đến rất nhiều loại ung thư. BRCA1 Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung. BRCA2 Liên quan đến ung thư vú. VHL Liên quan đến ung thư thận.

WT1 Liên quan đến khối u Wilm của thận. Tế bào bình thường cần có tín hiệu sinh trưởng của tế bào để vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, một tế bào bình thường không thể tiến hành quá trình phân chia nếu không có đủ các điều kiện như đạt đến kích thước và sinh khối nhất định, tích lũy đủ chất dinh dưỡng, các quá trình nhân đôi DNA xảy ra chính xác; nếu như những sai hỏng trong quá trình sinh trưởng của tế bào quá nghiêm trọng và không thể sửa chữa được, các gene ức chế khối u sẽ khởi động quá trình cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) để bảo vệ tình toàn vẹn của hệ gene và duy trì số lượng tế bào ở một mức độ nhất định [36]. Ở các tế bào khối u, một mặt các gene gây khối u hoạt động quá mức bình thường, dẫn đến việc tế bào luôn luôn nhận được các tín hiệu cho phép vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, mặt khác các gene ức chế khối u bị sai hỏng, dẫn đến quá trình apoptosis không xảy ra, các tế bào mang hệ gene sai hỏng vẫn tiếp tục tồn tại và phân chia. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Douglas và Robert Weinberg đã đưa ra 6 cột mốc trong quá trình phát sinh ung thư ác tính [42] là: - Các tế bào nhận được tín hiệu thúc đẩy tăng sinh tế bào (xuất hiện các gene gây ung thư).

- Các tế bào ung thư trở nên không nhạy cảm với các tín hiệu ức chế. - Đột biến xảy ra ở gene ức chế khối u, dẫn đến không còn hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), các tế bào ung thư không còn bị kiểm soát. - Các tế bào ung thư phân chia không giới hạn. - Các tế bào ung thư phát triển hệ thống mạch máu dẫn đến khối u để tăng cường chất dinh dưỡng nuôi khối u.

- Các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vùng mô khác và hình thành ổ ung thư mới (di căn). Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay, bệnh ung thư được xem là một trong những bệnh nan y, đòi hỏi các nhà nghiên cứu cần nhiều nỗ lực cố gắng để tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị hiệu quả. Đến nay trên thế giới đã nghiên cứu thành công một số loại thuốc và phương pháp chữa trị hiệu quả trong điều trị ung thư vú, ung thư máu… Tuy nhiên, với mức độ đa dạng của ung thư như hiện nay thì các nghiên cứu về ung thư cần được quan tâm hơn nữa để có thể tìm ra cách điều trị hiệu quả và phù hợp. Sự biến đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền.

Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma. Có vô số các khả năng có thể gây ra ung thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gene tiền ung thư (proto-oncogene), sự bất hoạt gene ức chế khối u, hay sự đột biến ở gene sửa sai DNA trở thành gene gây đột biến. Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường. Quá trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể.

Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường.