Luận văn thạc sĩ: Tinh chế Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli ở quy mô nồi lên men

Luận văn thạc sĩ phân tích hus tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Đào Trọng Khoa
• Người hướng dẫn: GS. Trương Nam Hải
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tinh chế Interleukin-2 người tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư
• 1.2. Khái niệm về bệnh ung thư
• 1.3. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Các phương pháp điều trị ung thư
• 1.5. Tổng quan về Interleukin-2
• 1.6. Cấu trúc của Interleukin-2
• 1.7. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2. Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
• 1.8. Hệ thống lên men nuôi cấy E. coli tái tổ hợp
• 1.9. Tinh sạch protein dạng thể vùi
• 1.10. Tổng quan về tinh sạch protein
• 1.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• 1.12. Công thức pha chế bán thành phẩm
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng giống và vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi khuẩn E. coli BL21 DE3
• 2.3. Vector biểu hiện
• 2.4. Máy móc và thiết bị
• 2.5. Các môi trường và dung dịch
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E. coli ở quy mô nồi lên men 5 lít
• 2.8. Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2
• 2.9. Phương pháp tinh chế Interleukin-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 2.10. Kiểm tra sản phẩm protein bằng điện di SDS-PAGE
• 2.11. Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western Blot
• 2.12. Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm và đông khô
• 2.13. Phương pháp xử lý kết quả điện di SDS-PAGE bằng phần mềm Quantity One
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn
• 3.2. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít
• 3.3. Khảo sát thành phần dinh dưỡng
• 3.4. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 IL-2
• 3.5. Lên men chủng E. coli BL21 IL-2 đợt 2
• 3.6. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp
• 3.7. Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC
• 3.8. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One
• 3.9. Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu Interleukin 2 tái tổ hợp trong E

Nghiên cứu về Interleukin-2 (IL-2) tái tổ hợp trong E. coli đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. IL-2 là một cytokine có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, đặc biệt trong điều trị ung thư. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của IL-2 mà còn mở ra hướng đi mới trong sản xuất dược phẩm sinh học.

1.1. Khái niệm về Interleukin 2 và vai trò của nó

Interleukin-2 là một cytokine được sản xuất chủ yếu bởi tế bào T. Nó có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển và hoạt động của các tế bào miễn dịch. IL-2 được sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thư, đặc biệt là ung thư thận và ung thư hắc tố. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong E. coli giúp tạo ra nguồn cung cấp dồi dào và tiết kiệm chi phí.

1.2. Tình hình nghiên cứu IL 2 trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng IL-2 có thể cải thiện khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư. Các sản phẩm IL-2 tái tổ hợp như Proleukin® đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị. Tuy nhiên, giá thành cao của sản phẩm này vẫn là một rào cản lớn, đặc biệt ở các nước đang phát triển.

II. Thách thức trong sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu, việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như độ tinh khiết của sản phẩm, chi phí sản xuất và khả năng biểu hiện protein trong E. coli cần được giải quyết. Những thách thức này ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả và khả năng thương mại hóa sản phẩm.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết của protein

Độ tinh khiết của Interleukin-2 là một yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả điều trị. Việc tách chiết và tinh chế protein từ E. coli thường gặp khó khăn do sự hiện diện của các protein không mong muốn. Các phương pháp tinh chế như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cần được tối ưu hóa để đạt được độ tinh khiết cao nhất.

2.2. Chi phí sản xuất và khả năng thương mại hóa

Chi phí sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp vẫn còn cao, điều này làm giảm khả năng tiếp cận của bệnh nhân. Việc nghiên cứu và phát triển quy trình sản xuất hiệu quả hơn là cần thiết để giảm giá thành và tăng khả năng thương mại hóa sản phẩm.

III. Phương pháp sản xuất Interleukin 2 tái tổ hợp trong E

Để sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp, quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men là một phương pháp hiệu quả. Quy trình này bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy vi khuẩn, và thu hoạch protein. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để đạt được năng suất cao.

3.1. Quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men

Quy trình nuôi cấy E. coli trong nồi lên men bao gồm các bước như chuẩn bị môi trường, cấy giống, và theo dõi các thông số như pH, nhiệt độ và nồng độ oxy. Việc kiểm soát các yếu tố này giúp tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Interleukin-2.

3.2. Kỹ thuật tinh chế Interleukin 2

Sau khi thu hoạch, Interleukin-2 cần được tinh chế để loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di SDS-PAGE được sử dụng để đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính của protein. Việc áp dụng các kỹ thuật này giúp nâng cao chất lượng sản phẩm cuối cùng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Interleukin 2 tái tổ hợp

Sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác. Việc sử dụng IL-2 trong liệu pháp miễn dịch đã cho thấy hiệu quả tích cực trong việc cải thiện tình trạng bệnh nhân. Nghiên cứu này không chỉ mang lại lợi ích cho bệnh nhân mà còn mở ra cơ hội cho ngành công nghiệp dược phẩm tại Việt Nam.

4.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

IL-2 đã được chứng minh có hiệu quả trong việc kích thích hệ miễn dịch, giúp tiêu diệt tế bào ung thư. Việc sản xuất IL-2 tái tổ hợp giúp cung cấp nguồn dược phẩm chất lượng cao cho bệnh nhân ung thư, đặc biệt là ở các nước đang phát triển.

4.2. Tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển

Nghiên cứu về Interleukin-2 tái tổ hợp mở ra nhiều cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực miễn dịch học và công nghệ sinh học. Việc phát triển các sản phẩm mới từ IL-2 có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm chi phí cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết để nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng thực tiễn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y tế và công nghệ sinh học tại Việt Nam.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sản xuất Interleukin-2 tái tổ hợp trong E. coli có thể đạt được năng suất cao và độ tinh khiết tốt. Các phương pháp tinh chế hiện đại đã được áp dụng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và phát triển các sản phẩm mới từ Interleukin-2. Việc hợp tác giữa các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sẽ là chìa khóa để đưa sản phẩm ra thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới, toàn cầu ghi nhận khoảng 14,1 triệu ca mắc ung thư mới vào năm 2012 và con số này tiếp tục gia tăng nhanh chóng tại các quốc gia đang phát triển. Riêng tại Hoa Kỳ năm 2014, ước tính có 1.665.000 trường hợp mắc mới và gần 586.000 ca tử vong, trung bình khoảng 1.600 người tử vong mỗi ngày. Trong các phương pháp hiện đại, liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt hệ thống phòng thủ tự nhiên của cơ thể để tiêu diệt tế bào ác tính. Cụ thể, Interleukin-2 người tái tổ hợp đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt trong phác đồ điều trị ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố di căn với tỷ lệ giảm di căn khối u từ 15% đến 20%.

Tuy nhiên, rào cản lớn nhất đối với bệnh nhân là chi phí điều trị quá đắt đỏ, điển hình như chế phẩm thương mại Proleukin có mức giá lên tới 2.532 USD cho mỗi lọ 1,3 mg. Bên cạnh đó, protein Interleukin-2 tự nhiên có chuỗi tín hiệu dễ bị glycosyl hóa gây độc tính rò rỉ mao mạch và cấu trúc chứa ba gốc Cysteine tự do dễ tạo liên kết sai lệch. Luận văn tập trung giải quyết vấn đề tối ưu hóa quy trình biểu hiện phân tử Interleukin-2 cải biến, tinh chế từ dạng thể vùi trong vi khuẩn Escherichia coli ở quy mô nồi lên men 5 lít và thiết lập công thức bán thành phẩm đông khô ổn định. Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2012 - 2015 tại Phòng Kỹ thuật Di truyền thuộc Viện Công nghệ Sinh học phối hợp cùng Công ty Trách nhiệm hữu hạn Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1. Thành công của đề tài tạo tiền đề vững chắc giúp giảm giá thành sản xuất sinh phẩm xuống hơn 70%, nâng cao khả năng tiếp cận thuốc chất lượng cao cho bệnh nhân trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết chuyên ngành vững chắc:

• Lý thuyết điều hòa miễn dịch qua cytokine: Interleukin-2 là một glycoprotein monome có khối lượng phân tử xấp xỉ 15 kDa gồm 133 amino acid, cấu trúc không gian đặc trưng bởi 4 xoắn alpha. Cytokine này thúc đẩy sự tăng sinh và hoạt hóa mạnh mẽ các tế bào lympho T, tế bào diệt tự nhiên và tế bào diệt được hoạt hóa bởi lymphokine nhằm nhận diện và tiêu diệt khối u.
• Lý thuyết biểu hiện gene tái tổ hợp trong hệ thống vi khuẩn: Sử dụng vector pET22b(+) mang promoter T7 điều khiển bởi chất cảm ứng Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside trên chủng vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) khuyết hai enzyme protease nội bào và ngoại bào là Lon và OmpT.
• Lý thuyết cuộn gập và biến tính protein thể vùi: Protein ngoại lai biểu hiện ở mức độ cao trong vi khuẩn thường kết tụ thành dạng thể vùi không tan, đòi hỏi quá trình biến tính bằng tác nhân hòa tan mạnh và tái cuộn gập có kiểm soát để tạo cầu disulfide chính xác giữa Cys58 và Cys105.

Mô hình nghiên cứu ứng dụng biến thể Interleukin-2 cải biến đã loại bỏ amino acid Alanine ở đầu N nhằm triệt tiêu vị trí glycosyl hóa gây độc, đồng thời thay thế Cysteine tại vị trí 125 bằng Serine nhằm ngăn chặn sự hình thành cầu disulfide sai lệch. Các khái niệm then chốt bao gồm: thể vùi nội bào, sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo, chất biến tính Guanidine hydrochloride và bán thành phẩm đông khô.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp từ các mẻ lên men 3 lít dịch nuôi cấy trong hệ thống nồi lên men bioreactor dung tích 5 lít và quá trình tinh chế tại phòng thí nghiệm chuyên sâu. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 6 công thức tá dược thử nghiệm được ký hiệu từ A đến F, cùng 2 mẫu đối chứng âm và đối chứng dương chuẩn quốc tế, được tiến hành lặp lại độc lập 3 lần để đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy thống kê.

Phương pháp chọn mẫu phân tầng có kiểm soát được áp dụng xuyên suốt các khâu: thu nhận sinh khối tế bào vi khuẩn sau 6 giờ cảm ứng, thu gom thể vùi qua các bước rửa giải ly tâm, phân đoạn sắc ký lỏng hiệu năng cao từ phút thứ 9 đến phút thứ 12, và kiểm tra các lọ đông khô sau 30 giờ vận hành.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 12,6% kết hợp phần mềm Quantity One để định lượng mật độ quang và xác định độ tinh sạch.
• Phản ứng lai miễn dịch Western Blot sử dụng kháng thể đơn dòng kháng Interleukin-2 nồng độ 0,2 - 0,4 µg/ml để nhận diện độ đặc hiệu.
• Sắc ký pha đảo RP-HPLC sử dụng cột Bio Wide Pore C5 kích thước 10 mm x 250 mm với hạt nhồi 10 µm, bước sóng phát hiện 280 nm và tốc độ dòng 5 ml/phút.
• Đo độ đục hoàn nguyên trên thiết bị quang học đạt chuẩn Dược điển Châu Âu với các ngưỡng đối chứng từ 3 đến 60 NTU.

Lý do lựa chọn tổ hợp phương pháp này là nhằm kết hợp giữa khả năng tách chiết hóa lý có độ phân giải cực cao của sắc ký pha đảo và độ nhạy miễn dịch tuyệt đối của Western Blot, đảm bảo sinh phẩm tạo ra đáp ứng toàn diện các tiêu chuẩn khắt khe của ngành dược.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được 4 kết quả thực nghiệm mang tính đột phá với các thông số định lượng cụ thể:

• Tối ưu hóa điều kiện lên men 5 lít: Nuôi cấy nạp mẻ bổ sung glucose 1% và cao nấm men 0,5% tại thời điểm nồng độ oxy hòa tan dOT biến thiên đột ngột, kết hợp cảm ứng bằng 0,1 mM IPTG ở tốc độ khuấy 600 vòng/phút và sục khí 1 vvm. Mật độ quang OD600 của dịch tế bào thu nhận sau 6 giờ cảm ứng tăng gấp 2,5 lần so với nuôi cấy bình tam giác, hàm lượng Interleukin-2 tái tổ hợp chiếm khoảng 30% đến 35% tổng lượng protein nội bào.
• Quy trình tiền xử lý thể vùi chọn lọc: Sau khi siêu âm phá vỡ tế bào vi khuẩn và ly tâm qua đệm chứa sucrose 20%, thể vùi được hòa tan hoàn toàn trong đệm Guanidine hydrochloride 7M. Khi pha loãng dịch biến tính về nồng độ Guanidine hydrochloride 3M, Interleukin-2 kết tủa chọn lọc trở lại, giúp loại bỏ hơn 60% lượng protein tạp của tế bào chủ Escherichia coli.
• Tinh chế sắc ký pha đảo RP-HPLC: Thiết lập chương trình gradient dung môi đệm B chứa 60% iso-propanol và 0,5% acid citric trong 20 phút. Phân đoạn protein mục tiêu rửa giải tập trung từ phút thứ 9 đến phút thứ 12. Phân tích diện tích pic trên phần mềm Quantity One chứng minh độ tinh khiết của sản phẩm đạt trên 95%, Western Blot xác nhận một băng đơn duy nhất ở kích thước 15 kDa.
• Phát triển công thức bán thành phẩm đông khô ưu việt: Trong 6 công thức khảo sát, công thức A chứa 1% Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, 300 mM Glycine, 10% PEG-400, 10% Tween-20, 40% Sucrose, 5% SDS và 20% Mannitol cho kết quả vượt trội. Sau chu trình đông khô 30 giờ và hoàn nguyên bằng 1,1 ml nước cất pha tiêm, mẫu đạt độ đục dưới 3 NTU, tương đương chuẩn 1 Dược điển Châu Âu về độ trong suốt.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả tinh chế và độ ổn định vượt bậc của protein bắt nguồn từ thiết kế cấu trúc phân tử hợp lý. Việc biến đổi Cys125Ser đã loại bỏ sự cạnh tranh tạo cầu nối sai lệch với Cys58 và Cys105, giúp phân tử tái tạo chính xác cấu trúc bậc ba gồm 4 xoắn alpha mà không bị vón tụ. Đồng thời, việc loại bỏ bộ ba Ala-Pro-Thr ở đầu N giúp giảm thiểu tối đa phản ứng kích ứng mô và hạ thấp độc tính sinh học.

Khi so sánh với các công thức truyền thống sử dụng Albumin huyết thanh người nồng độ 0,5 - 20 mg/ml theo các sáng chế quốc tế, công thức mới đã thay thế hoàn toàn bằng hệ tá chất gồm Cyclodextrin kết hợp với Glycine và Mannitol. Giải pháp này loại trừ triệt để nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh từ máu người, đáp ứng xu hướng an toàn sinh học hiện đại.

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua hệ thống đồ thị và bảng biểu:

• Biểu đồ đường biểu diễn tương quan giữa động học sinh trưởng OD600 và lượng oxy hòa tan dOT giúp xác định chính xác thời điểm bổ sung cơ chất.
• Sắc ký đồ HPLC với trục hoành là thời gian lưu và trục tung là độ hấp thụ quang học 280 nm thể hiện pic rửa giải sắc nét, đối xứng tại phút thứ 10,5.
• Bảng so sánh chỉ số độ đục NTU giữa 6 công thức cho thấy sự phân hóa rõ rệt: công thức A đạt dưới 3 NTU (trong suốt hoàn toàn), trong khi các công thức C, D, E không có hệ tá dược đồng bộ đều bị đục với độ đục dao động từ 6 đến 30 NTU.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, 4 giải pháp hành động cụ thể được đề xuất nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ:

• Mở rộng quy mô lên men lên hệ thống bioreactor công nghiệp 50 - 100 lít: Nâng sản lượng Interleukin-2 tái tổ hợp đạt mức 50 - 100 g mỗi mẻ lên men, duy trì nồng độ oxy hòa tan và kiểm soát pH tự động trong khoảng thời gian từ 12 đến 18 tháng, do Viện Công nghệ Sinh học chủ trì thực hiện.
• Chuẩn hóa quy trình đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và in vivo: Triển khai kiểm tra hoạt tính tăng sinh tế bào phụ thuộc Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL-2 với mục tiêu đạt hoạt tính riêng trên 1,5 x 10^7 IU/mg, thực hiện trong lộ trình 6 - 9 tháng tại các phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc (GLP).
• Tối ưu hóa thông số kỹ thuật chu trình đông khô quy mô lớn: Nghiên cứu rút ngắn thời gian sấy từ 30 giờ xuống còn 20 - 24 giờ nhằm tiết kiệm 25% chi phí năng lượng, đảm bảo độ ẩm tồn dư dưới 1,5% và độ đục sau hoàn nguyên luôn duy trì dưới 3 NTU, thời gian triển khai trong vòng 6 tháng do Công ty Vabiotech phối hợp thực hiện.
• Thiết lập hồ sơ tiền lâm sàng và đăng ký cấp phép thử nghiệm: Hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở và độc tính học theo quy định của Bộ Y tế trong vòng 24 tháng, hướng tới mục tiêu cung ứng chế phẩm điều trị ung thư với giá thành dự kiến thấp hơn 60% đến 70% so với thuốc ngoại nhập.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình cung cấp nhiều giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng:

• Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và di truyền phân tử: Cung cấp quy trình chi tiết từ thiết kế đột biến điểm gene il-2 đến kỹ thuật biểu hiện protein dị nguyên ở mức độ cao trong vi khuẩn, có thể tái sử dụng cho các nghiên cứu sản xuất cytokine hoặc kháng thể đơn chuỗi.
• Kỹ sư công nghệ lên men và xử lý sau thu hoạch sinh học: Nắm bắt phương pháp tối ưu hóa nạp mẻ dựa trên biến thiên dOT và kỹ thuật hòa tan chọn lọc thể vùi bằng nồng độ muối biến tính phân đoạn, áp dụng để giải quyết bài toán tinh chế các protein kết tụ khó tan.
• Chuyên gia bào chế và phát triển dược phẩm sinh học: Khai thác công thức phối trộn tá dược không chứa albumin huyết thanh, tận dụng ưu thế của dẫn xuất cyclodextrin và polyol để làm bền protein tái tổ hợp trong công nghệ đông khô dược phẩm.
• Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và nhà quản trị y tế: Bổ sung căn cứ khoa học về cơ chế tác động miễn dịch của phân tử Interleukin-2 cải biến, phục vụ việc đánh giá hiệu quả điều trị và xây dựng định hướng tự chủ nguồn sinh phẩm y tế quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

• Việc loại bỏ Alanine ở đầu N và đột biến Cys125Ser mang lại lợi ích sinh học gì? Cải biến loại bỏ bộ ba Ala-Pro-Thr ở đầu N giúp ngăn chặn hiện tượng glycosyl hóa ngoại lai, giảm thiểu phản ứng viêm và độc tính rò rỉ mao mạch khi đưa vào cơ thể. Đột biến thay thế Cysteine bằng Serine tại vị trí 125 giúp giữ nguyên hoạt tính sinh học và ngăn hình thành liên kết disulfide sai với Cys58 hoặc Cys105, tăng hiệu suất tái cuộn gập cấu trúc.

• Phương pháp tinh chế sơ bộ thể vùi trong nghiên cứu có ưu điểm gì? Nghiên cứu sử dụng Guanidine hydrochloride 7M để hòa tan hoàn toàn thể vùi, sau đó pha loãng có kiểm soát về nồng độ 3M. Quá trình này kích thích Interleukin-2 tái kết tủa chọn lọc trong khi các protein tạp của vi khuẩn vẫn hòa tan trong dịch nổi, giúp loại bỏ trên 60% tạp chất trước khi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao.

• Vì sao công thức bán thành phẩm không sử dụng Albumin huyết thanh người? Albumin huyết thanh người có nguy cơ tiềm ẩn lây truyền các tác nhân virus nguy hiểm qua đường máu và khó kiểm soát độ đồng nhất giữa các lô sản xuất. Công thức mới sử dụng 1% Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin cùng hệ đệm Glycine và Mannitol vừa tạo khung xốp ổn định cho bánh đông khô, vừa an toàn sinh học tuyệt đối.

• Hệ thống sắc ký pha đảo RP-HPLC kiểm soát chất lượng protein như thế nào? Cột sắc ký Bio Wide Pore C5 với pha động gradient iso-propanol phân tách protein dựa trên mức độ kỵ nước phân tử. Tốc độ dòng 5 ml/phút và bước sóng 280 nm cho phép thu hồi phân đoạn Interleukin-2 tinh khiết ở phút 9 - 12, đạt độ tinh sạch trên 95% theo phân tích phần mềm Quantity One.

• Khả năng ứng dụng thực tiễn của quy trình sản xuất này tại Việt Nam ra sao? Quy trình được thực hiện trên hệ thống nồi lên men 5 lít tại Viện Công nghệ Sinh học và Vabiotech, cho thấy tính khả thi cao khi nâng quy mô. Sản phẩm trong nước có tiềm năng thay thế Proleukin nhập khẩu với giá thành giảm tới hơn 70%, mở ra cơ hội tiếp cận thuốc cho hàng nghìn bệnh nhân ung thư.

Kết luận

• Biểu hiện thành công Interleukin-2 người tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli BL21(DE3) ở quy mô nồi lên men 5 lít với năng suất sinh khối tăng 2,5 lần.
• Hoàn thiện quy trình xử lý thể vùi bằng Guanidine hydrochloride phân đoạn, loại bỏ trên 60% protein tạp của tế bào chủ một cách nhanh chóng.
• Thiết lập quy trình tinh chế RP-HPLC trên cột C5 Bio Wide Pore đạt độ tinh khiết vượt trên 95% và được xác thực bằng Western Blot đặc hiệu.
• Phát triển thành công công thức bán thành phẩm đông khô A không chứa Albumin huyết thanh, đạt độ trong suốt hoàn hảo dưới 3 NTU sau hoàn nguyên.
• Đóng góp giải pháp công nghệ toàn diện giúp tự chủ sản xuất sinh phẩm điều trị ung thư tại Việt Nam, tiết kiệm hơn 70% chi phí y tế cho người bệnh.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã hoàn thiện công nghệ từ khâu biểu hiện lên men đến tinh chế và bào chế bán thành phẩm đông khô đạt chuẩn dược dụng. Lộ trình tiếp theo bao gồm việc triển khai sản xuất thử nghiệm ở quy mô 50 lít và hoàn tất các thử nghiệm hoạt tính sinh học trong vòng 12 - 24 tháng tới. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp dược phẩm được khuyến khích liên kết chuyển giao công nghệ để sớm đưa sản phẩm vào ứng dụng thực tiễn lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh ung thư 1. Khái niệm về bệnh ung thư Ở hầu hết các mô và cơ quan của cơ thể trưởng thành, quá trình sản sinh ra các tế bào mới và quá trình tiêu diệt các tế bào già được giữ ở trạng thái cân bằng. Mỗi loại tế bào khác nhau trong cơ thể có một thời gian tồn tại nhất định, sẽ được thay thế bằng bằng các tế bào mới có cùng chức năng khi tế bào đó chết đi.

Dưới các điều kiện bình thường, sự sản sinh của các tế bào mới được kiểm soát để số lượng một loại tế bào bất kỳ nào trong cơ thể là tương đối ổn định [5]. Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u (tumor). Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành ác tính (malignant).

Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis). Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [4]. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy xương [26]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào bình thường dần tạo nên các khối u gồm nhiều lớp tế bào chồng chất lên nhau.

Nếu các tế bào khối u khu trú ở một vùng duy nhất của cơ thể, không có biểu hiện xâm lấn các mô xung quanh thì được gọi là khối u lành tính. Ngược lại nếu các tế bào khối u tách khỏi vị trí ban đầu và xâm lấn ra các mô khác của cơ thể thì được gọi là khối u ác tính. Các khối u lành tính thường khá an toàn trừ khi kích thước của chúng quá lớn dẫn đến chèn ép các cơ quan hoặc các cấu trúc sống khác. Các khối u ác tính thì ngược lại, thường gây hậu quả nghiêm trọng vì xâm lấn đến các cơ quan khác, lan ra những mô ở xa hơn và hình thành những khối u thứ cấp (di căn) gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của các cơ quan đó.

Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học U lành tính U ác tính Tế bào biệt hóa cao Tế bào ít biệt hóa Phân bào ít và chậm Phân chia nguyên phân liên tục Không xâm lấn xung quanh Xâm lấn lan rộng Không có hoại tử Thường có hoại tử trung tâm Có vỏ bọc Không có vỏ bọc Rất ít tái phát Luôn tái phát Không di căn Di căn Ít ảnh hưởng đến cơ thể Ảnh hưởng lớn đến chức năng bình thường đến cơ thể Trước kia các nhà nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện các nguyên nhân gây bệnh, vì vậy ung thư được xếp vào 3 nhóm dựa vào nguyên nhân gây bệnh như sau: (1) các virus gây ung thư, (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư, (3) một số trường hợp ung thư mang tính di truyền như bệnh ung thư ruột do di truyền có tên là Familial Polyposis, bướu Wilms. Vào các năm 1980 – 1990, khi các kỹ thuật di truyền được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, dù ung 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thư có biểu hiện rất đa dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn nguyên của bệnh thực chất là do các sai hỏng của gene, hay nói cách khác là sự rối loạn của bộ máy di truyền [29]. Tuy vậy, thông thường phải có vài sai hỏng xảy ra đồng thời mới chuyển một tế bào bình thường sang trạng thái ung thư. Các nhà nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gene chính khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư.

Nhóm thứ nhất bao gồm các gene thúc đẩy quá trình phân chia tế bào một cách không kiểm soát, được gọi là các gene gây khối u (hay gene ung thư, oncogene). Các gene gây khối u điển hình nhất được tìm thấy đầu tiên ở các retrovirut. Liên quan đến những gene này là các tiền gene gây khối u (proto-oncogene) được tìm thấy ở các tế bào chủ. Các tiền gene gây khối u có thể đột biến thành các gene gây khối u.

Nhóm thứ hai bao gồm các gene khi ở dạng bình thường có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào, được gọi là các gene ức chế khối u (tumor suppressor gene, còn gọi là gene kiềm chế gene ung thư). Một nhóm các gene này trực tiếp tham gia vào các cơ chế sửa chữa DNA, nên khi bị đột biến chúng lại làm tăng tần số đột biến của những gene khác, vì vậy dạng đột biến của chúng được gọi là các gene gây đột biến (mutator gene) [4]. Một số gene ung thư và gene ức chế khối u liên quan đến ung thư ở người [27] Gene ung thư Bcl-2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung thư bạch cầu. c-myc Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi.

L-myc Liên quan đến ung thư phổi. PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trưởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thư não. RET Liên quan đến ung thư tuyến giáp. Ki-ras Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy.

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] N-ras Liên quan đến ung thư máu. Gene ức chế khối u APC Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày. DPC4 Mã hóa cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào, liên quan đến ung thư tuyến tụy. p53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và kích thích tế bào bất thường tự chết.

Liên quan đến rất nhiều loại ung thư. BRCA1 Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung. BRCA2 Liên quan đến ung thư vú. VHL Liên quan đến ung thư thận.

WT1 Liên quan đến khối u Wilm của thận. Tế bào bình thường cần có tín hiệu sinh trưởng của tế bào để vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, một tế bào bình thường không thể tiến hành quá trình phân chia nếu không có đủ các điều kiện như đạt đến kích thước và sinh khối nhất định, tích lũy đủ chất dinh dưỡng, các quá trình nhân đôi DNA xảy ra chính xác; nếu như những sai hỏng trong quá trình sinh trưởng của tế bào quá nghiêm trọng và không thể sửa chữa được, các gene ức chế khối u sẽ khởi động quá trình cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) để bảo vệ tình toàn vẹn của hệ gene và duy trì số lượng tế bào ở một mức độ nhất định [36]. Ở các tế bào khối u, một mặt các gene gây khối u hoạt động quá mức bình thường, dẫn đến việc tế bào luôn luôn nhận được các tín hiệu cho phép vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, mặt khác các gene ức chế khối u bị sai hỏng, dẫn đến quá trình apoptosis không xảy ra, các tế bào mang hệ gene sai hỏng vẫn tiếp tục tồn tại và phân chia. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Douglas và Robert Weinberg đã đưa ra 6 cột mốc trong quá trình phát sinh ung thư ác tính [42] là: - Các tế bào nhận được tín hiệu thúc đẩy tăng sinh tế bào (xuất hiện các gene gây ung thư).

- Các tế bào ung thư trở nên không nhạy cảm với các tín hiệu ức chế. - Đột biến xảy ra ở gene ức chế khối u, dẫn đến không còn hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), các tế bào ung thư không còn bị kiểm soát. - Các tế bào ung thư phân chia không giới hạn. - Các tế bào ung thư phát triển hệ thống mạch máu dẫn đến khối u để tăng cường chất dinh dưỡng nuôi khối u.

- Các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vùng mô khác và hình thành ổ ung thư mới (di căn). Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay, bệnh ung thư được xem là một trong những bệnh nan y, đòi hỏi các nhà nghiên cứu cần nhiều nỗ lực cố gắng để tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị hiệu quả. Đến nay trên thế giới đã nghiên cứu thành công một số loại thuốc và phương pháp chữa trị hiệu quả trong điều trị ung thư vú, ung thư máu… Tuy nhiên, với mức độ đa dạng của ung thư như hiện nay thì các nghiên cứu về ung thư cần được quan tâm hơn nữa để có thể tìm ra cách điều trị hiệu quả và phù hợp. Sự biến đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền.

Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma. Có vô số các khả năng có thể gây ra ung thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gene tiền ung thư (proto-oncogene), sự bất hoạt gene ức chế khối u, hay sự đột biến ở gene sửa sai DNA trở thành gene gây đột biến. Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường. Quá trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể.

Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường.