Tổng quan luận án

Công trình luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Macaranga balansae Gagnep., thuộc chi Mã rạng (Macaranga) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Phạm Toàn Thắng, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Trần Thu Hương và PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hương. Luận án thuộc chuyên ngành Hóa học (mã số đào tạo: 9440112), hoàn thành tại Bộ môn Hóa Hữu cơ thuộc Viện Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với nguồn kinh phí tài trợ từ Đề tài độc lập cấp Nhà nước mã số ĐTĐLCN.14/16.

Tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trong y học về việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học nhằm phòng ngừa và điều trị các bệnh nan y, đặc biệt là bệnh ung thư. Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có hơn 3.200 loài được dùng làm thuốc trong y học dân gian. Chi Mã rạng (Macaranga) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) gồm khoảng hơn 300 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Các nghiên cứu hóa học và sinh học trên thế giới đã ghi nhận chi Macaranga chứa nhiều hợp chất có cấu trúc và hoạt tính sinh học đáng chú ý, đặc biệt là nhóm flavonoid prenyl hóa, stilbene prenyl hóa và terpenoid có khả năng gây độc tế bào ung thư.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định rõ: loài Macaranga balansae Gagnep. (tên tiếng Việt là Ba soi lông tơ) là một loài thực vật đặc hữu của Việt Nam nhưng chưa được khảo sát đầy đủ và toàn diện về thành phần hóa học cũng như hoạt tính gây độc tế bào. Kết quả sàng lọc ban đầu trong khuôn khổ hợp tác khoa học Pháp - Việt cho thấy dịch chiết ethyl acetate từ quả và thân cây Macaranga balansae có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư biểu mô người KB ở nồng độ 1 µg/ml với tỷ lệ ức chế lần lượt là 20% và 9%. Đây là tiền đề trực tiếp để tác giả lựa chọn nghiên cứu chuyên sâu về loài này.

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học của loài Macaranga balansae và tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng hợp lý và định hướng nghiên cứu ứng dụng loài thực vật này.

Nội dung nghiên cứu cụ thể gồm 3 nhiệm vụ:

  1. Phân lập các hợp chất từ các bộ phận thân, lá và quả của loài Macaranga balansae bằng các phương pháp sắc ký.
  2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại.
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư người.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thực vật quả, thân và lá của loài Macaranga balansae Gagnep. (Ba soi lông tơ).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 7 năm 2011 tại huyện Tuyên Hóa, tỉnh Quảng Bình, Việt Nam; được định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Thế Cường thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản mang ký hiệu VN-2223-F, VN-2223-T được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển. Luận án bảo vệ năm 2020 tại Hà Nội.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) là một trong những họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6.700 đến 7.500 loài. Tại Việt Nam, họ này có 75 chi cùng khoảng hơn 450 loài và 16 thứ, trong đó có 1 chi đặc hữu (Oligoceras - Noi), 131 loài đặc hữu (chiếm 31,58%) và 9 thứ đặc hữu (chiếm 56,25%). Khoảng 75 loài thuộc 30 chi trong họ Thầu dầu đã được ghi nhận sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc tại Việt Nam.

Chi Mã rạng (Macaranga) là chi duy nhất của phân tông Macaranginae, gồm khoảng hơn 300 loài. Theo danh lục của Phạm Hoàng Hộ trong "Cây cỏ Việt Nam", tại Việt Nam có 13 loài Macaranga, bao gồm: M. triloba, M. tanarius, M. indica, M. kurzii, M. denticulata, M. henryi, M. sampsonii, M. microcarpa, M. trichocarpa, M. andamanica, M. auriculata, M. balansae, và M. trachyphylla. Nhiều loài trong chi được dùng trong y học cổ truyền ở châu Á để trị viêm gan thể hoàng đản, trướng nước, bí tiểu tiện, đắp mụn nhọt, chống viêm và lọc máu sau sinh.

Về tình hình nghiên cứu hóa học trên thế giới, khoảng 26 trên 300 loài Macaranga đã được khảo sát. Các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính được phát hiện bao gồm:

  • Hợp chất flavonoid prenyl hóa: Jang DS và cộng sự (2002) phân lập từ lá M. conifera các dẫn xuất flavanone ức chế enzyme cyclooxygenase (COX-1, COX-2). Nhóm nghiên cứu tại Đài Loan phân lập tanariflavanone A, tanariflavanone B, nymphaeol A, B, C từ lá M. tanarius (ức chế sự sinh trưởng của Lactuca sativa L.). Các nhà khoa học Thái Lan (2005) tách tanariflavanone C, D từ lá M. tanarius. Yoder BJ và cộng sự (2007) phân lập alnifoliol, bonanniol A, diplacol, bonannione A và diplacone từ quả M. alnifolia (hoạt tính trên dòng tế bào A2780 với $IC_{50} = 3,5$ µg/ml). Li X và cộng sự (2009) tách macaranone A-D từ M. sampsonii, trong đó macaranone C và D có khung peltogynoid cấu trúc vòng hóa qua cầu ether. Nhóm nghiên cứu Indonesia phân lập macagigantin từ M. gigantifolia (độc tế bào bạch cầu P-388, $IC_{50}$ từ 5,1 - 6,0 µM), macatrichocarpin A-E và 4'-O-methylmacagigantin từ lá M. trichocarpa ($IC_{50} = 8 - 19$ µM).
  • Hợp chất stilbene: Odile Thoison và cộng sự (1992) phân lập vedelianin từ M. vedeliana. Năm 1998, các nhà nghiên cứu Mỹ tách schweinfurthin A-C từ M. schweinfurthii (ức chế trên 60 dòng tế bào ung thư). Năm 2007, các hợp chất vedelianin và dãy schweinfurthin E-H được phân lập từ quả M. alnifolia, trong đó vedelianin thể hiện $IC_{50} = 0,13$ µM và schweinfurthin E có $IC_{50} = 0,26$ µM trên dòng ung thư buồng trứng A2780. Năm 2001, mappain được tách từ lá M. mappa ($IC_{50} = 1,3$ µM trên tế bào A2780). Năm 2017, nhóm nghiên cứu Pháp tách schweinfurthin K-Q từ quả M. tanarius, trong đó schweinfurthin O có hoạt tính ức chế tế bào ung thư thần kinh U87 với $EC_{50} = 0,025$ µM.
  • Hợp chất terpenoid và phenolic: Acid kolavenic và acid 2-oxo-kolavenic từ vỏ thân M. monandra (2003) có hoạt tính kháng nấm Colletotrichum fragariae (25 - 50 µg/ml); các diterpenoid cembrane deheiculatin M-O từ M. pustulata (2009); macarangioside A-D từ M. tanarius (Matsunami và cộng sự, 2006); scopoletin từ M. denticulata có hoạt tính quét gốc tự do DPPH ($IC_{50} = 0,342$ µM); macabarterin và các ellagitannin, tannin thủy phân từ M. barteri và M. tanarius.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu tập trung chủ yếu tại Viện Hóa sinh biển và Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh:

  • Từ quả M. tanarius: Phân lập 3 hợp chất stilbene prenylate, trong đó vedelianin có tính chọn lọc cao đối với các dòng tế bào KB, MCF-7, HCT116, HL60 với $IC_{50}$ lần lượt là 5; 30; 8.500 µM.
  • Từ lá M. kurzii (Yên Bái): Phân lập 19 hợp chất (5 chất mới), hợp chất ức chế enzyme acetylcholinesterase và ức chế tế bào KB.
  • Từ M. triloba: Phân lập diterpene grayanotoxin IV.
  • Từ lá M. sampsonii (Hà Giang): Phân lập 8 hợp chất gồm macarecurvatin A ($IC_{50} = 130$ µM), scopoletin ($IC_{50} = 3,8$ µM), methyl brevifolin carboxylate ($IC_{50} = 5,84$ µM).
  • Từ lá M. indica (2019): Phân lập các flavonoid prenyl mới macarindicin I-IV và macarindicin D-F; macarindicin II, E, F thể hiện độc tính tế bào trên các dòng KB, MCF-7, HepG2, Lu-1 với $IC_{50}$ dao động từ 10,6 đến 20,3 µM.
  • Từ M. denticulata (2019): Phân lập flavonoid geranyl mới 3'-dehydroxy-solophenol C, gây độc tế bào A549 ($IC_{50} = 16,0$ µM) và Hela ($IC_{50} = 36,9$ µM).

Vị trí của luận án: Kế thừa và mở rộng chuỗi nghiên cứu về chi Macaranga tại Việt Nam, luận án tập trung giải quyết đối tượng chưa từng được nghiên cứu toàn diện là Macaranga balansae, phân lập triệt để thành phần hóa học từ 3 bộ phận (quả, thân, lá), xác định các cấu trúc mới và đánh giá độc tính tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư người.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết của hóa học các hợp chất thiên nhiên (phân loại, sinh tổng hợp và tính chất hóa lý của flavonoid, stilbene, triterpenoid, steroid, lignan và các dẫn xuất acid phenolic) kết hợp với các nguyên lý quang phổ phân tử trong xác định cấu trúc hữu cơ và phương pháp thử độc tính sinh học in vitro.

Quy trình chiết xuất và phân lập

  • Xử lý mẫu: Mẫu quả, thân, lá của M. balansae được rửa sạch, phơi khô, sấy ở nhiệt độ 40 - 45°C, sau đó nghiền thành bột mịn.
  • Phương pháp chiết: Chiết ngâm kiệt phân đoạn sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần. Bột mẫu khô (ví dụ 200 g quả) được ngâm với ethyl acetate (EtOAc) ở 25°C trong 24 giờ (4 lần), thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được cặn EtOAc. Bã thực vật tiếp tục được ngâm chiết với methanol (MeOH) ở 25°C trong 24 giờ (4 lần), thu hồi dung môi được cặn MeOH. Quy trình tương tự được áp dụng cho mẫu thân và lá.
  • Kỹ thuật sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\text{ F}_{254}$ đế nhôm, độ dày 0,25 mm (hãng Merck). Hệ dung môi khai triển gồm các hỗn hợp n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol, nước, acid formic.
    • Sắc ký cột pha thường (CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel 60, kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh, Merck), rửa giải gradient với các hệ dung môi như n-hexane/dichloromethane, n-hexane/ethyl acetate, n-hexane/acetone, dichloromethane/methanol.
    • Sắc ký cột lọc gel: Pha tĩnh Sephadex LH-20 (Merck), rửa giải bằng MeOH tinh khiết hoặc hỗn hợp dichloromethane/MeOH (tỷ lệ 2:8 hoặc 8:2).
    • Sắc ký cột pha đảo (RP-CC): Pha tĩnh silica gel pha đảo RP-18 (Merck), rửa giải bằng hệ dung môi methanol/nước.
    • Phương pháp kết tinh phân đoạn (KT).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Các trang thiết bị phân tích hiện đại được sử dụng tại Viện Hóa học và Viện Hóa sinh biển (VAST):

  • Điểm nóng chảy ($Đ_{nc}$): Đo trên thiết bị MEL TEMP 3.0 (Thermo Scientific, Mỹ).
  • Độ quay cực ($[\alpha]_D$): Đo trên máy Polartronic D (Hänsch) và Jasco P-2000 (Nhật Bản).
  • Phổ hồng ngoại (IR): Ghi trên máy FTIR-Impact-410 theo phương pháp ép viên nén KBr.
  • Phổ khối lượng (MS): Đo phổ khối va chạm electron (EI-MS, 70 eV) trên máy MS-Engine-5989-HP hoặc HP 5989 B serie II; phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS / FT-ICR-MS) ghi trên máy Varian 320-MS.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ 1D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và 2D ($^1\text{H}-^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY) trên máy Bruker Avance 500 MHz, chất nội chuẩn tetramethylsilane (TMS).
  • Phổ lưỡng sắc tròn (CD): Ghi trên thiết bị Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, Vương quốc Anh).

Phương pháp thử hoạt tính sinh học

  • Phương pháp: Đánh giá độc tính tế bào in vitro theo phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) theo quy chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) và quy trình chuẩn của Tim Mosmann (1983).
  • Nguyên lý: Muối MTT màu vàng bị khử bởi enzyme dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống tạo thành tinh thể formazan màu tím không tan. Hòa tan formazan bằng isopropanol và đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 570 nm.
  • Hệ thống dòng tế bào: 8 dòng tế bào ung thư người (do ATCC và GS. Jeong-Hyung Lee, Đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc cung cấp), bao gồm:
    • KB: Tế bào ung thư biểu mô người (mật độ nuôi cấy $2,5 \times 10^4$ tế bào/giếng).
    • HepG2 và Hep3B: Tế bào ung thư gan người (mật độ $2,5 \times 10^4$ tế bào/giếng).
    • MCF-7: Dòng tế bào ung thư vú người ($5,4 \times 10^4$ tế bào/giếng).
    • Lu-1 và A549: Dòng tế bào ung thư phổi người ($2,5 \times 10^4$ và $2,5 \times 10^5$ tế bào/giếng).
    • Hela: Dòng tế bào ung thư cổ tử cung người ($5,0 \times 10^4$ tế bào/giếng).
    • Pan C1: Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người ($1,0 \times 10^5$ tế bào/giếng).
  • Điều kiện nuôi cấy: Môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS), 100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin sulphate; ủ ở 37°C, 5% $\text{CO}_2$, độ ẩm 98% trong 48 giờ.
  • Chất đối chứng dương: Ellipticine và Camptothecin (ở nồng độ 0,1 và 5 µM). Mẫu thử được pha trong DMSO với nồng độ ban đầu 20 mg/ml hoặc dung dịch gốc 100 mM, sau đó pha loãng bậc 2 trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ.
  • Tính toán kết quả:
    • Tỷ lệ sống sót của tế bào: $$CS (%) = \frac{OD_{test} - OD_{blank}}{OD_{control} - OD_{blank}} \times 100%$$
    • Tỷ lệ phần trăm ức chế: $$% \text{ ức chế} = \left(1 - \frac{OD_{test} - OD_{blank}}{OD_{control} - OD_{blank}}\right) \times 100% = 100% - CS(%)$$
    • Giá trị $IC_{50}$ (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) được xác định thông qua đường cong tương quan nồng độ - đáp ứng bằng phần mềm Rawdata.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tổng quan về bối cảnh kinh tế - xã hội, nhu cầu cấp thiết trong tìm kiếm thuốc chống ung thư từ thảo dược tự nhiên, đặc điểm hệ thực vật Việt Nam, tiềm năng của chi Macaranga, lý do lựa chọn loài Macaranga balansae, mục tiêu và nội dung nhiệm vụ nghiên cứu.

Chương 1: Tổng quan

Hệ thống hóa toàn bộ các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

  • Đặc điểm thực vật học, hình thái, phân loại học của họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) và chi Mã rạng (Macaranga).
  • Thống kê 13 loài Macaranga ghi nhận tại Việt Nam cùng phân bố sinh thái và kinh nghiệm sử dụng trong y học dân gian (như M. denticulata, M. indica, M. triloba, M. henryi, M. tanarius, M. kurzii, M. trichocarpa, M. balansae, M. sampsonii, M. andamanica, M. auriculata).
  • Tổng quan cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên phân lập từ chi Macaranga: nhóm flavonoid (flavone, flavanone prenyl hóa, flavonol farnesyl hóa, peltogynoid), nhóm stilbene (schweinfurthin A-Q, mappain, vedelianin), nhóm terpenoid (clerodane diterpene, lathyrol, cembrane, triterpene friedelan và taraxerane) cùng các dẫn xuất phenolic, tannin thủy phân.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết địa điểm và thời gian thu hái mẫu thực vật tại Quảng Bình, quy trình lưu trữ tiêu bản; thiết lập quy trình thực nghiệm chiết xuất phân đoạn với ethyl acetate và methanol cho từng bộ phận (thân, lá, quả); mô tả hệ thống dung môi, quy trình triển khai sắc ký (CC, RP-CC, Sephadex LH-20, TLC, PTLC); các thông số kỹ thuật của thiết bị đo phổ vật lý ($Đ_{nc}$, $[\alpha]D$, IR, MS, HR-MS, 1D/2D NMR, CD); quy trình chi tiết nuôi cấy tế bào, hóa chất, thiết bị và thuật toán tính toán thông số $IC{50}$ trong phép thử MTT.

Chương 3: Thực nghiệm tách chiết và phân lập các hợp chất

Trình bày chi tiết các sơ đồ phân đoạn và thông số vật lý, dữ liệu phổ của các hợp chất thu được từ từng bộ phận của Macaranga balansae:

  1. Tách chiết và phân lập từ quả cây M. balansae:
    • Từ 200 g bột quả khô, ngâm chiết thu được 20 g cặn EtOAc (QM-E) và 29 g cặn MeOH (QM-M).
    • Cặn QM-E (20 g) qua cột silica gel (n-hexane/acetone 0 - 100%) chia thành 17 phân đoạn (QM-E1 đến QM-E17). Phân đoạn QM-E4 cho hợp chất QM3 (22 mg). Phân đoạn QM-E10 cho QM2 (40 mg) qua kết tinh lại trong dichloromethane. Phân đoạn QM-E12 (3,57 g) qua sắc ký cột silica gel và tinh chế tiếp phân đoạn QM-E12.5 thu được QM1 (chất mới), QM11 (chất mới), QM12, QM13, QM14. Phân đoạn QM-E13, QM-E14, QM-E17 qua cột Sephadex LH-20 và silica gel thu được QM4 - QM10, QM16, QM17.
    • Cặn QM-M (29 g) qua cột Sephadex LH-20 (rửa giải MeOH) chia thành 11 phân đoạn (QM-M1 đến QM-M11). Phân đoạn QM-M2 qua silica gel (n-hexane/acetone 7:3) cho QM15 (5 mg); phân đoạn QM-M3 qua Sephadex LH-20 cho QM18 (7 mg).
  2. Tách chiết và phân lập từ thân cây M. balansae:
    • Chiết phân đoạn bột thân khô với EtOAc và MeOH, thu hồi dung môi được cặn EtOAc và cặn MeOH.
    • Sắc ký cột phân lập được các hợp chất ký hiệu TM1 đến TM17.
  3. Tách chiết và phân lập từ lá cây M. balansae:
    • Chiết phân đoạn bột lá khô với EtOAc và MeOH, tiến hành phân lập cặn chiết thu được các hợp chất ký hiệu LM3, LM7, LM9, LM10.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này dành cho việc biện giải cấu trúc hóa học chi tiết dựa trên dữ liệu phổ ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY/ROESY, HR-MS, CD) của các hợp chất phân lập được và công bố kết quả thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào.

Bộ phận thực vật Ký hiệu chất Tên hóa học / Cấu trúc xác định Ghi chú
Quả (M. balansae) QM1 4’-O-methyl-8-prenyltaxifolin Hợp chất mới
QM2 5,7-dihydroxy-4’-methoxy-8-prenylflavanone Flavonoid prenyl hóa
QM3 Hợp chất flavonoid (tương tự lonchocarpol A) 22 mg
QM4 - QM10 Các dẫn xuất flavonoid / stilbene liên quan Đã xác định phổ NMR
QM11 4’-deprenyl-4-O-methylmappain Hợp chất mới
QM14 4’-deprenyl mappain Hợp chất stilbene
QM15 Acid 3,3’,4’-tri-O-methyl ellagic Dẫn xuất acid ellagic
QM16 Acid protocatechuic Acid phenolic
QM17 Acid gallic Acid phenolic
QM18 Acid ellagic Hợp chất phenolic
Thân (M. balansae) TM1 Acid acetylaleuritolic Triterpenoid
TM3 6-hydroxystigmast-4-en-3-one Steroid
TM5 Stigmast-4-en-3-one Steroid
TM7 Stigmastane-3,6-dione Steroid
TM8 Stigmast-4-en-3,6-dione Steroid
TM9 Coniferyl aldehyde Phenylpropanoid
TM10 Acid vanillic Dẫn xuất acid benzoic
TM13 Stigmastane-3β,5α,6β-triol Steroid polyhydroxy
TM15 Hợp chất khung diterpenoid/lignan Đã giải phổ 2D-NMR
TM17 Acid 3,4’-dimethylellagic Dẫn xuất acid ellagic
Lá (M. balansae) LM3 7-carboxyl-6’-methoxycarbonyl-dehydroxycubebin Hợp chất mới
LM7 Methyl gallate Dẫn xuất gallate
LM9, LM10 Các hợp chất phenolic / flavonoid Đã xác định dữ liệu phổ
  • Xác định cấu trúc các hợp chất mới:
    • Hợp chất QM1 (4’-O-methyl-8-prenyltaxifolin): Phân lập từ quả, là một dẫn xuất dihydroflavonol prenyl hóa mới. Cấu trúc được xác lập dựa trên phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, các tương tác chìa khóa trên phổ HMBC giữa proton nhóm prenyl tại vị trí C-8 với các carbon vòng A, nhóm methoxy tại C-4' vòng B, và phổ lưỡng sắc tròn (CD) để xác định cấu hình tuyệt đối.
    • Hợp chất QM11 (4’-deprenyl-4-O-methylmappain): Phân lập từ quả, là một dẫn xuất stilbene prenyl hóa mới. Cấu trúc được chứng minh qua hệ thống tương tác COSY và HMBC giãn rộng, so sánh trực tiếp với dữ liệu phổ của mappain và 4'-deprenyl-mappain.
    • Hợp chất LM3 (7-carboxyl-6’-methoxycarbonyl-dehydroxycubebin): Phân lập từ lá, là một dẫn xuất lignan mới thuộc khung dehydroxycubebin. Cấu trúc hóa học và cấu hình không gian được làm sáng tỏ dựa trên các tương tác NOESY, HMBC và phổ phân giải cao.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học: Báo cáo giá trị $IC_{50}$ (µg/ml hoặc µM) của các chất sạch phân lập được trên các dòng tế bào ung thư người (KB, HepG2, Hep3B, MCF-7, Lu-1, A549, Hela, Pan C1), so sánh đối chiếu với các chất chuẩn dương ellipticine và camptothecin.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về mặt hóa học thực vật:
    • Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách hệ thống và toàn diện về thành phần hóa học của loài thực vật đặc hữu Macaranga balansae Gagnep. thu hái tại Quảng Bình, Việt Nam.
    • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hàng loạt hợp chất thuộc các nhóm cấu trúc chuyển hóa thứ cấp đa dạng (flavonoid prenyl hóa, stilbene, triterpenoid khung aleuritolic, steroid khung stigmastane, lignan và các acid phenolic) từ 3 bộ phận: quả, thân và lá.
    • Đã phát hiện, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 3 hợp chất tự nhiên mới:
      • 4’-O-methyl-8-prenyltaxifolin (QM1) phân lập từ quả cây.
      • 4’-deprenyl-4-O-methylmappain (QM11) phân lập từ quả cây.
      • 7-carboxyl-6’-methoxycarbonyl-dehydroxycubebin (LM3) phân lập từ lá cây.
  2. Về mặt hoạt tính sinh học:
    • Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập từ M. balansae trên 8 dòng tế bào ung thư người (KB, HepG2, Hep3B, MCF-7, Lu-1, A549, Hela, Pan C1) sử dụng phương pháp chuẩn MTT.
    • Xác định được các hợp chất có hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư với các giá trị $IC_{50}$ cụ thể, đóng góp cơ sở khoa học giải thích cho tác dụng sinh học của chi Macaranga.

Kiến nghị và đề xuất

  • Tiếp tục mở rộng khảo sát các phân đoạn phân cực khác và các bộ phận khác của cây Macaranga balansae.
  • Triển khai nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử gây chết tế bào ung thư (apoptosis, chu kỳ tế bào) và đánh giá độc tính trên mô hình in vivo đối với các hợp chất có hoạt tính mạnh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Mẫu thực vật Macaranga balansae mới được thu thập tại một địa điểm duy nhất (huyện Tuyên Hóa, tỉnh Quảng Bình) vào một thời điểm nhất định (tháng 7/2011), chưa phản ánh được sự biến động về hàm lượng hoạt chất theo mùa và theo các vùng sinh thái phân bố khác nhau.
    • Các thử nghiệm sinh học trong luận án mới dừng lại ở mức độ đánh giá độc tính tế bào in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy, chưa tiến hành trên các mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Khảo sát sự tích lũy hoạt chất của loài M. balansae theo mùa và theo các tọa độ phân bố sinh thái khác nhau tại miền Trung và miền Bắc Việt Nam.
    • Nghiên cứu bán tổng hợp hoặc biến đổi cấu trúc hóa học trên các khung hợp chất chính nhằm nâng cao hoạt tính sinh học và độ tan.
    • Nghiên cứu chi tiết cơ chế tác động dược lý của các hợp chất mới (QM1, QM11, LM3) đối với các đích phân tử nội bào.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị khoa học cao phục vụ các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn về chiết xuất phân đoạn, quy trình sắc ký cột phân lập các hợp chất flavonoid prenyl hóa, stilbene, lignan và phương pháp giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR, phổ khối HR-MS, phổ CD.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành Hóa học và Dược liệu: Tài liệu tham khảo hữu ích trong việc tra cứu số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HMBC, HSQC) của các dẫn xuất khung taxifolin, mappain, cubebin, stigmastane và dẫn xuất acid ellagic.
  • Các nhà nghiên cứu thực vật học và bảo tồn tài nguyên: Cung cấp dữ liệu hóa phân loại học (chemotaxonomy) phục vụ việc phân loại và đánh giá giá trị dược liệu của các loài đặc hữu thuộc chi Macaranga và họ Euphorbiaceae tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện được những hợp chất hóa học mới nào?

Luận án đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 3 hợp chất tự nhiên mới lần đầu tiên được ghi nhận:

  • Hợp chất QM1: 4’-O-methyl-8-prenyltaxifolin (phân lập từ quả).
  • Hợp chất QM11: 4’-deprenyl-4-O-methylmappain (phân lập từ quả).
  • Hợp chất LM3: 7-carboxyl-6’-methoxycarbonyl-dehydroxycubebin (phân lập từ lá).

2. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu hái ở đâu và xác định tên khoa học như thế nào?

Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 7 năm 2011 tại huyện Tuyên Hóa, tỉnh Quảng Bình, Việt Nam. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - VAST) giám định là Macaranga balansae Gagnep. (tên tiếng Việt: Ba soi lông tơ). Mẫu tiêu bản mang ký hiệu VN-2223-F và VN-2223-T được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển (VAST).

3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được đánh giá bằng phương pháp nào và trên những dòng tế bào ung thư nào?

Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá in vitro bằng phương pháp so màu MTT (đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 570 nm sau khi hòa tan formazan trong isopropanol). Phép thử được thực hiện trên 8 dòng tế bào ung thư người gồm: KB (ung thư biểu mô), HepG2 và Hep3B (ung thư gan), MCF-7 (ung thư vú), Lu-1 và A549 (ung thư phổi), Hela (ung thư cổ tử cung), Pan C1 (ung thư tuyến tụy), sử dụng chất đối chứng dương là ellipticine và camptothecin.

4. Những kỹ thuật phổ nào đã được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất trong luận án?

Tác giả đã sử dụng kết hợp các phương pháp quang phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (FTIR-Impact-410), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS / FT-ICR-MS trên máy Varian 320-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY trên máy Bruker Avance 500 MHz), phổ lưỡng sắc tròn (CD trên máy Chirascan) cùng các phép đo nhiệt độ nóng chảy và năng suất quay cực ($[\alpha]_D$).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Phạm Toàn Thắng đã giải quyết một cách khoa học và hệ thống nhiệm vụ làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài thực vật đặc hữu Macaranga balansae Gagnep. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất thuộc các khung cấu trúc flavonoid prenyl hóa, stilbene, triterpenoid, steroid, lignan và acid phenolic, trong đó có 3 hợp chất mới là 4’-O-methyl-8-prenyltaxifolin (QM1), 4’-deprenyl-4-O-methylmappain (QM11) và 7-carboxyl-6’-methoxycarbonyl-dehydroxycubebin (LM3). Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên 8 dòng tế bào ung thư người đã cung cấp các bằng chứng khoa học quan trọng về hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập, tạo nền tảng phục vụ công tác tra cứu hóa thực vật và định hướng nghiên cứu ứng dụng nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam.