Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu cho vi khuẩn Escherichia coli O157:H7

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn escherichia coli o157h7, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Thủy
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi vật và plasmid
• 2.2. Môi trường và dung dịch
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
• 2.5. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E.
• 2.6. Phương pháp PCR
• 2.7. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.8. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.9. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
• 2.10. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.
• 2.11. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E.
• 2.12. Phương pháp giải trình tự acid nucleic tự động
• 2.13. Phương pháp tạo phức hệ aptamer – hạt nano vàng
• 2.14. Phương pháp lai Dot blot
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
• 3.1. Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu vi khuẩn E.
• 3.2. Chuẩn bị thư viện
• 3.3. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E.
• 3.4. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E.
• 3.5. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E.
• 3.6. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2
• 3.7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.
• 3.8. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E.
• 3.9. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E.
• 3.10. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano vàng với E.
• 3.11. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E.
• 3.12. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu aptamer cho vi khuẩn Escherichia coli O157 H7

Nghiên cứu về việc tạo ra aptamer đặc hiệu cho vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và y học. Aptamer là các phân tử oligonucleic có khả năng liên kết với các phân tử đích cụ thể, giúp phát hiện và chẩn đoán các bệnh do vi khuẩn gây ra. Vi khuẩn E. coli O157:H7 là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, do đó việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh chóng và chính xác là rất cần thiết.

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Escherichia coli O157 H7

Vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, là một loại vi khuẩn Gram âm có khả năng gây bệnh nghiêm trọng. Chúng có thể gây ra các triệu chứng như tiêu chảy phân máu và hội chứng tán huyết. Việc hiểu rõ về đặc tính và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp phát hiện hiệu quả.

1.2. Tình hình nghiên cứu về aptamer hiện nay

Nghiên cứu về aptamer đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây. Các nghiên cứu cho thấy aptamer có nhiều ưu điểm so với kháng thể truyền thống, bao gồm khả năng ổn định cao và dễ dàng tổng hợp. Việc ứng dụng aptamer trong phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 hứa hẹn sẽ mang lại những tiến bộ trong lĩnh vực chẩn đoán.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn Escherichia coli O157 H7

Việc phát hiện E. coli O157:H7 gặp nhiều thách thức do tính chất của vi khuẩn này. Chúng có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và có khả năng sinh độc tố cao. Các phương pháp phát hiện hiện tại thường tốn thời gian và yêu cầu thiết bị phức tạp. Do đó, cần có những giải pháp mới để cải thiện độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện vi khuẩn này.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập và xác định vi khuẩn

Phân lập và xác định E. coli O157:H7 là một quá trình phức tạp, đòi hỏi các phương pháp nuôi cấy đặc biệt và thời gian dài. Vi khuẩn này có thể bị nhầm lẫn với các chủng khác, dẫn đến việc chẩn đoán sai. Việc phát triển aptamer có thể giúp giải quyết vấn đề này bằng cách cung cấp một phương pháp phát hiện nhanh chóng và chính xác.

2.2. Tính kháng của vi khuẩn đối với các phương pháp hiện tại

Vi khuẩn E. coli O157:H7 có khả năng kháng lại nhiều phương pháp phát hiện truyền thống, bao gồm cả các xét nghiệm sinh hóa. Điều này làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn hơn. Aptamer có thể cung cấp một giải pháp mới, với khả năng nhận biết đặc hiệu và nhạy hơn so với các phương pháp hiện tại.

III. Phương pháp nghiên cứu aptamer cho Escherichia coli O157 H7

Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) là một trong những kỹ thuật chính được sử dụng để phát triển aptamer. Kỹ thuật này cho phép sàng lọc các phân tử có khả năng liên kết cao với mục tiêu. Quy trình này bao gồm nhiều bước, từ tổng hợp ssDNA đến sàng lọc và xác định trình tự của aptamer.

3.1. Quy trình SELEX trong nghiên cứu aptamer

Quy trình SELEX bao gồm các bước như tổng hợp ssDNA, sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7, và xác định trình tự của các aptamer này. Mỗi vòng sàng lọc giúp tăng cường khả năng liên kết của aptamer với mục tiêu, từ đó tạo ra các phân tử có độ nhạy cao.

3.2. Tách dòng và xác định trình tự aptamer

Sau khi sàng lọc, các aptamer cần được tách dòng và xác định trình tự để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện E. coli O157:H7. Việc này thường sử dụng các phương pháp như PCR và giải trình tự DNA để xác định cấu trúc của aptamer.

IV. Ứng dụng thực tiễn của aptamer trong phát hiện Escherichia coli O157 H7

Các aptamer được phát triển có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ chẩn đoán y tế đến an toàn thực phẩm. Việc sử dụng aptamer trong phát hiện E. coli O157:H7 có thể giúp cải thiện độ nhạy và độ chính xác của các phương pháp phát hiện hiện tại, đồng thời giảm thiểu thời gian và chi phí.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán y tế

Các aptamer có thể được sử dụng như các công cụ chẩn đoán nhanh chóng và chính xác cho các bệnh do E. coli O157:H7 gây ra. Chúng có thể được phát triển thành các bộ kit chẩn đoán, giúp phát hiện vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm một cách hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong an toàn thực phẩm

Việc phát hiện E. coli O157:H7 trong thực phẩm là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Các aptamer có thể được sử dụng trong các cảm biến sinh học để phát hiện nhanh chóng vi khuẩn trong thực phẩm, từ đó giúp ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu aptamer

Nghiên cứu về aptamer đặc hiệu cho vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 mở ra nhiều triển vọng trong việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do vi khuẩn gây ra. Với những ưu điểm vượt trội, aptamer có thể trở thành một công cụ quan trọng trong lĩnh vực y học và an toàn thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp mới và hiệu quả hơn trong việc đối phó với các vấn đề liên quan đến vi khuẩn gây bệnh.

5.1. Triển vọng nghiên cứu và phát triển aptamer

Nghiên cứu về aptamer sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều ứng dụng tiềm năng trong các lĩnh vực khác nhau. Việc cải tiến các phương pháp sàng lọc và phát triển aptamer sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn và các bệnh lý liên quan.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu vi sinh vật học

Nghiên cứu về aptamer không chỉ dừng lại ở việc phát hiện E. coli O157:H7, mà còn có thể mở rộng ra nhiều loại vi khuẩn khác. Điều này sẽ góp phần nâng cao hiểu biết về vi sinh vật học và phát triển các phương pháp chẩn đoán mới trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E.

Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E.000 dân: Tại Liên minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại Argentina 22 ngƣời. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC - Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga.

coli O157:H7 là đối tƣợng gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận (HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong.

coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong.

Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm – Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. coli là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Tuy đã có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa đáng với mức độ nguy hiểm của nó. coli O157:H7 còn gặp nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại, phân tích viên có trình độ chuyên môn cao.

Do đó, việc phân tích chính xác E. coli O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế. Aptamer có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào.

Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E.

Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. - Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Tổng quan về Escherichia coli O157:H7 1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5]. Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1.

Kích thƣớc: dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20 nm. coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế bào, không có màng nhân bao bọc. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm: Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất.

Tế bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8].1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp, gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình 1. Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25].

coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Hệ gen pO157 pOSAK1 Độ dài 5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Tỉ lệ G+C 50.4 % Khung đọc mở (ORF): 5,361 83 3 Vùng mã hóa protein 88.8 % Chiều dài trung bình của các ORF 904 bp 922 bp 579 bp rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và tmRNA 103 0 0 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Đặc tính của E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C.

coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. coli O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật. Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C.

Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm vào các tế bào vật chủ mới [14]. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo agar khuẩn lạc E. coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E.

coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult® E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise. Vi khuẩn này không tạo ra  -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4- methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phân biệt với các E.

coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [26]. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố. Chúng có khả năng sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero.

Loại độc tố này không gây hại đối với động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí tử vong [38]. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O: - Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h.

- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết O.

Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7]. Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20]. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E.

coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết tắt của Shiga – like – toxin [8]. Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời.

coli O157:H7 gây tiêu chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt. Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là Gb4).

Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25].