Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học quercetin từ một số loài thực vật ở việt nam

Nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam, góp phần vào y học và bảo vệ sức khỏe.

• Tác giả: Trần Thị Kiều Oanh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về flavonoid
• 1.1.1. Giới thiệu chung về flavonoid
• 1.1.2. Sinh tổng hợp flavonoids
• 1.1.3. Các dạng khác nhau của flavonoid
• 1.1.4. Quercetin và một số tính chất đặc trưng
• 1.1.4.1. Định danh và đặc tính của quercetin
• 1.1.4.2. Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin
• 1.2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.2.1. Thiết bị thí nghiệm
• 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.3. Phương pháp định tính các nhóm chất của loài thực vật bằng phản ứng màu
• 1.2.4. Phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm thu dịch chiết dùng cho phân tích HPLC, TLC và hoạt tính sinh học
• 1.2.5. Phương pháp thủy phân mẫu dịch chiết trong HCL
• 1.2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng trong phân tích định tính dịch thủy phân
• 1.2.7. Xây dựng phương pháp phân tích HPLC
• 1.2.8. Phương pháp thử hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH
• 1.2.9. Phương pháp xác định tổng năng lực khử
• 1.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.3. Kết quả và thảo luận
• 1.3.1. Xác định các nhóm hợp chất thứ sinh có trong các mẫu
• 1.3.2. Kết quả phân tích TLC của các dịch chiết trước và sau khi thủy phân
• 1.3.3. Kết quả khảo sát DPPH và năng lực khử của các dịch chiết thực vật
• 1.3.4. Hoạt tính DPPH
• 1.3.5. Khảo sát khả năng lực khử của các mẫu thực vật
• 1.3.6. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC trên mẫu dược liệu chuẩn hoa hòe
• 1.3.7. Đánh giá độ ổn định của phương pháp HPLC được thiết lập
• 1.3.8. Xác định quercetin trong dịch chiết mẫu thực vật trước và sau thủy phân
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tách chiết quercetin từ thực vật Việt Nam

Nghiên cứu về quercetin từ thực vật Việt Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Quercetin là một flavonoid có nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm khả năng chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý. Việc tách chiết quercetin từ các loài thực vật bản địa không chỉ giúp bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào các phương pháp tách chiết hiệu quả và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin.

1.1. Định nghĩa và vai trò của quercetin trong y học

Quercetin là một flavonoid tự nhiên có mặt trong nhiều loại thực vật. Nó được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Nghiên cứu cho thấy quercetin có thể hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh như viêm, dị ứng và thậm chí là ung thư. Việc hiểu rõ về quercetin sẽ giúp tối ưu hóa việc sử dụng nó trong y học.

1.2. Tình hình nghiên cứu quercetin tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu về quercetin từ thực vật đang trong giai đoạn phát triển. Nhiều loài thực vật như hoa hòe, đinh lăng và rau đắng biển đã được xác định là nguồn cung cấp quercetin phong phú. Tuy nhiên, việc tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin từ các loài này vẫn còn hạn chế. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để khai thác tiềm năng của quercetin trong y học và thực phẩm chức năng.

II. Những thách thức trong nghiên cứu tách chiết quercetin

Mặc dù quercetin có nhiều lợi ích, việc tách chiết nó từ thực vật gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như hiệu suất tách chiết thấp, sự biến đổi của quercetin trong quá trình chiết xuất và sự hiện diện của các hợp chất khác có thể làm giảm hoạt tính sinh học của nó. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp tách chiết hiệu quả và an toàn là rất cần thiết.

2.1. Khó khăn trong việc tối ưu hóa quy trình tách chiết

Quá trình tách chiết quercetin thường gặp khó khăn trong việc tối ưu hóa các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và loại dung môi. Những yếu tố này có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và độ tinh khiết của quercetin thu được. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định điều kiện tối ưu cho từng loại thực vật.

2.2. Sự biến đổi của quercetin trong quá trình chiết xuất

Trong quá trình tách chiết, quercetin có thể bị biến đổi thành các hợp chất khác, làm giảm hoạt tính sinh học của nó. Việc kiểm soát các điều kiện chiết xuất là rất quan trọng để bảo toàn hoạt tính của quercetin. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp chiết xuất nhẹ nhàng hơn để bảo vệ quercetin.

III. Phương pháp tách chiết quercetin hiệu quả từ thực vật

Để tách chiết quercetin hiệu quả, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Các phương pháp như chiết xuất bằng dung môi, chiết xuất siêu âm và chiết xuất bằng lò vi sóng đã cho thấy hiệu quả cao trong việc thu nhận quercetin. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, do đó cần lựa chọn phương pháp phù hợp với từng loại thực vật.

3.1. Chiết xuất bằng dung môi truyền thống

Phương pháp chiết xuất bằng dung môi truyền thống là một trong những phương pháp phổ biến nhất để tách chiết quercetin. Phương pháp này sử dụng các dung môi như ethanol, methanol hoặc nước để hòa tan quercetin từ thực vật. Tuy nhiên, hiệu suất chiết xuất có thể không cao và thời gian chiết xuất thường kéo dài.

3.2. Chiết xuất siêu âm và lò vi sóng

Chiết xuất siêu âm và lò vi sóng là những phương pháp hiện đại giúp tăng cường hiệu suất tách chiết quercetin. Các phương pháp này sử dụng sóng siêu âm hoặc bức xạ vi sóng để làm tăng tốc độ hòa tan và giảm thời gian chiết xuất. Nghiên cứu cho thấy rằng các phương pháp này có thể thu được quercetin với độ tinh khiết cao hơn so với phương pháp truyền thống.

IV. Đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin

Hoạt tính sinh học của quercetin đã được nghiên cứu rộng rãi. Các nghiên cứu cho thấy quercetin có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Ngoài ra, quercetin còn có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Việc đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin từ các loài thực vật Việt Nam là rất quan trọng để xác định tiềm năng ứng dụng của nó.

4.1. Hoạt tính chống oxy hóa của quercetin

Nghiên cứu cho thấy quercetin có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp ngăn chặn sự hình thành gốc tự do và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Các thử nghiệm in vitro đã chỉ ra rằng quercetin có thể giảm thiểu thiệt hại do oxy hóa trong các tế bào. Điều này mở ra cơ hội cho việc sử dụng quercetin trong các sản phẩm chống lão hóa.

4.2. Tác dụng kháng viêm và kháng khuẩn của quercetin

Ngoài khả năng chống oxy hóa, quercetin còn có tác dụng kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và virus, đồng thời giảm viêm trong cơ thể. Điều này cho thấy quercetin có thể được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng.

V. Ứng dụng thực tiễn của quercetin trong y học và thực phẩm chức năng

Với những lợi ích sức khỏe nổi bật, quercetin đang được ứng dụng rộng rãi trong y học và thực phẩm chức năng. Nhiều sản phẩm bổ sung chứa quercetin đã được phát triển để hỗ trợ sức khỏe tim mạch, tăng cường miễn dịch và chống lão hóa. Việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ quercetin sẽ góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

5.1. Sản phẩm thực phẩm chức năng chứa quercetin

Nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng hiện nay đã bổ sung quercetin như một thành phần chính. Các sản phẩm này thường được quảng cáo với khả năng tăng cường sức khỏe, hỗ trợ miễn dịch và chống lão hóa. Việc sử dụng quercetin trong thực phẩm chức năng đang trở thành xu hướng mới trong ngành công nghiệp thực phẩm.

5.2. Tiềm năng ứng dụng quercetin trong điều trị bệnh

Nghiên cứu về quercetin cho thấy nó có tiềm năng lớn trong việc điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Các thử nghiệm lâm sàng đang được tiến hành để xác định hiệu quả của quercetin trong việc điều trị bệnh tim mạch, tiểu đường và ung thư. Việc phát triển các liệu pháp điều trị dựa trên quercetin có thể mở ra hướng đi mới trong y học.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu quercetin

Nghiên cứu về quercetin từ thực vật Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và thực phẩm chức năng. Việc tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin sẽ giúp khai thác tiềm năng của nó trong việc phát triển các sản phẩm có lợi cho sức khỏe. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cộng đồng.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo về quercetin

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tách chiết quercetin từ các loài thực vật khác nhau. Đồng thời, việc đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin trong các điều kiện khác nhau cũng cần được thực hiện để xác định tiềm năng ứng dụng của nó.

6.2. Tầm quan trọng của quercetin trong sức khỏe cộng đồng

Với những lợi ích sức khỏe nổi bật, quercetin có thể đóng góp lớn vào việc nâng cao sức khỏe cộng đồng. Việc phát triển các sản phẩm từ quercetin sẽ giúp người tiêu dùng tiếp cận dễ dàng hơn với các giải pháp chăm sóc sức khỏe tự nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hợp chất flavonoid là một trong những nhóm chất chuyển hóa thứ sinh phong phú nhất trong giới thực vật với hơn 6.000 cấu trúc khác nhau đã được phát hiện trên toàn cầu. Trong đó, quercetin (công thức hóa học C15H10O7) là một hợp chất flavonol tự nhiên tiêu biểu, chiếm khoảng 60% đến 75% tổng lượng flavonoid trong các loại rau củ và thảo dược. Quercetin sở hữu hoạt tính sinh học đa dạng, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ hệ tim mạch, ức chế tế bào ung thư và hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Lượng tiêu thụ quercetin trung bình qua khẩu phần ăn uống dao động từ 25 đến 50 mg/người/ngày.

Trong ngành công nghiệp dược phẩm hiện nay, quercetin thương mại chủ yếu được sản xuất thông qua quá trình thủy phân hợp chất rutin (quercetin-3-O-rutinosid) tách chiết từ hoa hòe (Sophora japonica L.) với hàm lượng rutin chiếm từ 6% đến 30%. Tuy nhiên, nguồn dược liệu Việt Nam vô cùng phong phú với nhiều loài thực vật chứa flavonoid liên hợp chưa được khai thác có hệ thống. Việc tinh chế từng dạng dẫn xuất glycoside trước khi thủy phân thường phức tạp, tốn kém hóa chất và làm giảm hiệu suất thu hồi. Vấn đề khoa học đặt ra là cần xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất, thủy phân trực tiếp để thu nhận quercetin aglycone tự do từ nguồn thảo mộc bản địa.

Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm của học viên Trần Thị Kiều Oanh, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Quang Huy tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (2018), được thực hiện nhằm giải quyết trọn vẹn yêu cầu cấp thiết này. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể bao gồm:

1. Xác định thành phần hóa lý và đánh giá hoạt tính sinh học (khả năng dọn gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử) của dịch chiết từ 05 loài thực vật phổ biến tại miền Bắc Việt Nam gồm Hoa hòe, Bụp giấm, Rau đắng biển, Rau má và Đinh lăng.
2. Thiết lập và thẩm định các thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) phù hợp để phân tách, định tính và định lượng quercetin trực tiếp từ dịch chiết và dịch thủy phân.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc chuẩn hóa nguyên liệu dược, cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy giúp các doanh nghiệp dược phẩm tối ưu hóa chuỗi chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa tự nhiên.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên và cơ chế tác dụng sinh hóa của polyphenol thực vật:

• Con đường sinh tổng hợp Phenylpropanoid: Flavonoid được hình thành từ axit amin L-phenylalanine và tiền chất 4-coumaroyl-CoA kết hợp với 3 phân tử malonyl-CoA. Dưới sự xúc tác tuần tự của enzyme chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H) và flavonol synthase (FLS), phân tử quercetin được tổng hợp với khung carbon C6-C3-C6 đặc trưng.
• Cơ chế chống oxy hóa dọn gốc tự do (Halliwell & Gutteridge): Khả năng chống oxy hóa của quercetin bắt nguồn từ cấu trúc 5 nhóm hydroxyl (-OH), đặc biệt là nhóm catechol ở vòng B (vị trí 3',4'-OH) kết hợp với liên kết đôi C2=C3 và nhóm 4-oxo ở vòng C. Cấu hình này giúp quercetin dễ dàng nhượng nguyên tử hydro (H+) cho các gốc tự do ROS, ONOO- và gốc lipid peroxyl, chuyển hóa thành gốc quinone trung gian bền vững, từ đó ngăn chặn phản ứng dây chuyền phá hủy màng tế bào.
• Lý thuyết sắc ký pha đảo (Reversed-Phase HPLC): Dựa trên sự khác biệt về độ phân cực giữa quercetin aglycone tự do (tính axit yếu với pKa1 = 5,87; pKa2 = 8,48) và các dẫn xuất glycoside phân cực hơn như rutin. Pha tĩnh C18 không phân cực kết hợp với pha động axit yếu (pH 3,0 – 4,0) giúp kiểm soát trạng thái ion hóa của quercetin, nâng cao độ chọn lọc và hiệu lực tách đỉnh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn mẫu và chuẩn bị nguyên liệu: Nghiên cứu khảo sát 05 loài thực vật gồm hoa hòe (Sophora japonica L.), bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.), rau đắng biển (Bacopa monnieri), rau má (Centella asiatica) và đinh lăng (Polyscias fruticosa (L) Harms) thu hái tại Hà Nội và các tỉnh phía Bắc. Mẫu thực vật được sấy khô, nghiền thành bột mịn nhằm tăng diện tích tiếp xúc với dung môi. Sử dụng chất đối chiếu quercetin chuẩn (độ ẩm 8,75%, hàm lượng nguyên trạng chất khan đạt 90,87%) và dược liệu chuẩn Hoa hòe (hàm lượng rutin chuẩn hóa đạt 21,1%, độ ẩm 10,0%) từ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
• Kỹ thuật chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm (UAE): Cân chính xác 1,0 g bột mẫu chiết với 25 mL dung môi methanol, rung siêu âm trên thiết bị Elmasonic S-100 ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút. Quá trình chiết được lặp lại 2 lần để thu hồi triệt để hoạt chất.
• Quy trình thủy phân bằng axit HCl: Dịch chiết methanol được thủy phân trực tiếp theo tỷ lệ thể tích (Dịch chiết : H2O : HCl = 50 : 20 : 8), đun cách thủy ở nhiệt độ 90°C trong 60 phút (lắc định kỳ 15 phút/lần). Dịch sau thủy phân được trung hòa, lọc thu cắn và tái hòa tan bằng ethanol phục vụ phân tích sắc ký bản mỏng (TLC) và HPLC.
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD): Sử dụng hệ thống Agilent 1260 Infinity Bio-Inert LC. Cột phân tích pha đảo ZORBAX SB-C18 (kích thước 4,6 × 150 mm, kích thước hạt 5 µm). Khảo sát 06 hệ pha động đẳng dòng (isocratic) phối trộn giữa Methanol (kênh A), Hỗn hợp C (Methanol : Acetonitril : H2O = 40:15:45 chứa 1% axit axetic) và Acetonitril (kênh D). Đầu dò DAD quét đồng thời 4 bước sóng (283 nm, 330 nm, 367 nm, 370 nm), tốc độ dòng 0,5 mL/min, nhiệt độ cột 25°C, thể tích tiêm 20 µL.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
  • Thử nghiệm khử gốc tự do DPPH: Đo độ giảm hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm trên phiến 96 giếng với nồng độ mẫu thử từ 0,1 đến 1,0 mg/mL sau 20 phút ủ ở 37°C.
  • Thử nghiệm xác định tổng năng lực khử: Dựa trên phản ứng khử ion Fe3+ thành Fe2+ tạo phức xanh Prussian, đo mật độ quang OD tại bước sóng 700 nm ở các nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg/mL.

---

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Định tính các nhóm hoạt chất thứ sinh và quercetin: Phản ứng màu xác nhận cả 05 loài thực vật đều dương tính với flavonoid. Phân tích sắc ký bản mỏng (TLC) cho thấy, trước khi thủy phân, duy nhất dịch chiết hoa hòe xuất hiện vệt quercetin aglycone tự do. Tuy nhiên, sau khi thủy phân bằng dung dịch HCl ở 90°C trong 60 phút, toàn bộ 05 loài thực vật đều xuất hiện vệt sắc ký đặc trưng của quercetin aglycone trùng khớp với chất chuẩn, trong đó hoa hòe cho độ đậm và diện tích vết lớn nhất.
2. Khả năng dọn gốc tự do DPPH vượt trội: Dịch chiết hoa hòe thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao nhất và ổn định nhất, đạt 75,30% ngay ở nồng độ thấp 0,1 mg/mL và duy trì ở mức 76,73% (nồng độ 0,5 mg/mL). Rau đắng biển có sự gia tăng hoạt tính ấn tượng nhất theo nồng độ, từ 5,09% (ở 0,1 mg/mL) tăng vọt lên 79,12% (ở 1,0 mg/mL). Bụp giấm thể hiện khả năng ức chế mạnh đạt 78,92% ở nồng độ 0,5 mg/mL, trong khi rau má và đinh lăng đạt mức trung bình lần lượt là 45,93% và 43,43% ở nồng độ 1,0 mg/mL.
3. Tổng năng lực khử ion sắt (Fe3+): Năng lực khử tỷ lệ thuận tuyến tính với nồng độ mẫu thử từ 0,1 đến 1,0 mg/mL. Hoa hòe thể hiện năng lực khử mạnh nhất với giá trị OD đạt từ 0,444 (ở 0,1 mg/mL) lên đến 1,314 (ở 1,0 mg/mL), cao gấp 2,5 đến 3,0 lần so với các mẫu dược liệu còn lại. Rau đắng biển (OD đạt 0,189 - 0,514) và bụp giấm (OD đạt 0,193 - 0,417) đứng vị trí tiếp theo, vượt trội hơn hẳn đinh lăng (0,174 - 0,412) và rau má (0,084 - 0,316).
4. Thiết lập điều kiện sắc ký HPLC-DAD tối ưu: Hệ pha động số 4 gồm Methanol : Acetonitril : Hỗn hợp C (tỷ lệ thể tích 15 : 20 : 65, pH = 3,63) được lựa chọn là tối ưu nhất. Phương pháp giúp tách hoàn toàn quercetin khỏi đỉnh rutin phía trước với độ phân giải sắc ký Rs = 2,45 (vượt xa tiêu chuẩn yêu cầu Rs > 1,5), số đĩa lý thuyết N > 2000, thời gian lưu tr = 8,835 ± 0,037 phút ở áp suất 35 bar, hệ số kéo đuôi T = 0,999 (đạt độ đối xứng chuẩn 1,0). Khi tăng áp suất lên mức 59 bar, thời gian lưu của quercetin được rút ngắn xuống còn khoảng 4,0 phút nhưng vẫn duy trì độ ổn định cao.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hoa hòe có mối liên hệ mật thiết với hàm lượng hoạt chất rutin tiêu chuẩn hóa rất cao (21,1%) và sự hiện diện của quercetin dạng aglycone tự do ngay trước khi thủy phân. Cấu trúc phenolic đa nhóm OH của quercetin phản ứng tức thì với các gốc tự do DPPH, giải thích tại sao hoa hòe đạt ngưỡng ức chế tối đa 75,30% ngay tại nồng độ 0,1 mg/mL.

Đối với rau đắng biển và bụp giấm, hoạt tính DPPH tăng mạnh khi tăng nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg/mL (tăng từ 5,09% lên 79,12% ở rau đắng) chứng minh các loài này chứa lượng lớn glycoside flavonoid liên hợp có hoạt lực mạnh khi đạt ngưỡng nồng độ nhất định. Quy trình thủy phân bằng axit HCl 90°C đã bẻ gãy hoàn toàn các liên kết đường glycosidic (như glucose, rhamnose), giải phóng hoàn toàn quercetin aglycone tự do có hoạt tính sinh học cao.

Về mặt phân tích sắc ký, việc sử dụng hệ pha động không chứa hệ đệm muối mà chỉ dùng 1% axit axetic đã bảo vệ độ bền của cột sắc ký ZORBAX SB-C18 và hạn chế tối đa hiện tượng ăn mòn thiết bị. Dữ liệu thực nghiệm sắc ký đồ có thể được biểu diễn trực quan qua đồ thị phổ 3D DAD đa bước sóng (từ 283 nm đến 370 nm), khẳng định bước sóng phát hiện tối ưu nhất của quercetin là 370 nm. Thử nghiệm lặp lại 5 lần trên mẫu dịch chiết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích đỉnh chỉ đạt 0,68% và chiều cao đỉnh đạt 0,54% (nhỏ hơn nhiều so với giới hạn cho phép RSD < 2,0%), khẳng định phương pháp HPLC được thiết lập có độ tin cậy và độ lặp lại xuất sắc.

---

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình chiết siêu âm quy mô công nghiệp: Các viện nghiên cứu và nhà máy dược phẩm cần đầu tư dây chuyền chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) ở nhiệt độ 65°C với dung môi methanol/ethanol thu hồi, đặt mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi quercetin lên trên 85% trong giai đoạn 2024–2025.
2. Triển khai công nghệ thủy phân axit trực tiếp một bước: Khuyến nghị các doanh nghiệp sản xuất cao dược liệu áp dụng trực tiếp quy trình thủy phân bằng dung dịch axit HCl (tỷ lệ dịch chiết : H2O : HCl = 50 : 20 : 8 đun ở 90°C trong 60 phút) trên dịch chiết thô của hoa hòe và bụp giấm. Giải pháp này giúp cắt giảm 40% chi phí tinh chế phân đoạn trung gian và rút ngắn 50% thời gian sản xuất quercetin nguyên liệu.
3. Áp dụng phương pháp phân tích HPLC-DAD không đệm vào kiểm nghiệm thường quy: Trung tâm kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm chức năng nên ban hành quy trình vận hành chuẩn (SOP) phân tích quercetin trên cột C18 với pha động Methanol/Acetonitril/Axit axetic 1% (pH 3,63) ở bước sóng 370 nm, duy trì độ lệch chuẩn RSD < 1,0% trong kiểm tra chất lượng định kỳ hàng quý.
4. Phát triển vùng trồng dược liệu đạt chuẩn GACP-WHO: Khuyến nghị ngành nông nghiệp và các hợp tác xã dược liệu mở rộng diện tích canh tác hoa hòe, rau đắng biển và bụp giấm tại các tỉnh phía Bắc, hướng tới mục tiêu cung ứng 500 tấn dược liệu sạch đạt chuẩn mỗi năm cho ngành công nghiệp chiết xuất flavonoid trong nước.

---

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm và Hóa thực vật: Tài liệu cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về định tính 6 nhóm hoạt chất thứ sinh, kỹ thuật thủy phân liên kết glycoside và phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro (DPPH, năng lực khử Fe3+).
• Kỹ sư R&D và chuyên viên phân tích tại các nhà máy Dược phẩm: Ứng dụng ngay quy trình HPLC-DAD đẳng dòng không dùng đệm muối để định tính, định lượng hoạt chất rutin và quercetin đạt độ phân giải Rs = 2,45 và độ ổn định cao.
• Nhà nghiên cứu phát triển Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Nutraceuticals): Nắm bắt dữ liệu khoa học về tiềm năng chống oxy hóa của các loài thảo mộc quen thuộc như hoa hòe, rau đắng biển, bụp giấm để bào chế các sản phẩm ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm mỡ máu và tăng cường tuần hoàn não.
• Cán bộ quản lý chất lượng và giảng viên đại học: Sử dụng số liệu thực nghiệm, hệ thống bảng biểu và quy trình thẩm định HPLC làm tài liệu tham khảo giảng dạy trong các học phần Kiểm nghiệm dược liệu và Hóa sinh thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

Tại sao hoa hòe lại thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và năng lực khử cao nhất trong 5 loài khảo sát?

Hoa hòe chứa hàm lượng rutin chuẩn hóa lên tới 21,1% cùng lượng lớn quercetin tự do chưa qua thủy phân. Tại nồng độ thấp 0,1 mg/mL, hoa hòe đạt khả năng dọn gốc DPPH 75,30% và năng lực khử OD = 0,444 (cao gấp 2,5 đến 3,0 lần các mẫu khác), nhờ cấu trúc catechol 3',4'-OH nhượng điện tử cực nhanh.

Ưu điểm nổi bật của hệ pha động HPLC được tối ưu hóa trong luận văn là gì?

Hệ pha động số 4 (Methanol : Acetonitril : Hỗn hợp C tỷ lệ 15:20:65, chứa 1% axit axetic, pH 3,63) không sử dụng muối đệm, giúp bảo vệ cột ZORBAX SB-C18 không bị nghẹt hay ăn mòn, đạt độ phân giải Rs = 2,45 và hệ số đối xứng đỉnh chuẩn T = 0,999.

Quá trình thủy phân bằng axit HCl đóng vai trò gì trong việc thu nhận quercetin?

Trong tự nhiên, quercetin chủ yếu tồn tại ở dạng liên hợp glycoside khó hấp thu. Thủy phân bằng HCl (tỷ lệ 50:20:8) ở 90°C trong 60 phút giúp cắt đứt các phân tử đường, giải phóng 100% quercetin aglycone tự do, giúp vệt TLC đậm rõ trên cả 5 loài thực vật sau phản ứng.

Phương pháp chiết siêu âm (UAE) có ưu thế gì so với ngâm chiết truyền thống?

Chiết xuất hỗ trợ siêu âm ở 65°C trong 30 phút sử dụng sóng cơ học phá vỡ vách tế bào thực vật, tăng tốc độ khuếch tán dung môi methanol vào mô lá/hoa, giúp rút ngắn thời gian chiết từ vài ngày xuống 60 phút và bảo toàn trọn vẹn hoạt tính của flavonoid.

Có thể rút ngắn thời gian phân tích sắc ký HPLC của quercetin dưới 8 phút không?

Hoàn toàn có thể. Kết quả thực nghiệm chứng minh khi nâng áp suất đầu cột từ 35 bar lên khoảng 59 bar, thời gian lưu của đỉnh quercetin giảm từ 8,835 phút xuống chỉ còn khoảng 4,0 phút mà vẫn duy trì độ phân giải sắc ký và độ lặp lại ổn định với RSD < 1,0%.

---

Kết luận

• Xác định thành công 6 nhóm hợp chất thứ sinh trên 05 loài thực vật Việt Nam, chứng minh toàn bộ các loài đều chứa flavonoid và giải phóng quercetin aglycone sau thủy phân.
• Thiết lập quy trình chiết siêu âm UAE (65°C, 30 phút) kết hợp thủy phân trực tiếp bằng HCl (90°C, 60 phút) giúp thu hồi triệt để quercetin tự do từ nguyên liệu thô.
• Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp HPLC-DAD trên cột C18 tại bước sóng 370 nm, đạt độ phân giải Rs = 2,45, hệ số kéo đuôi T = 0,999 và độ lặp lại RSD < 1,0%.
• Chứng minh hoạt tính chống oxy hóa vượt trội của hoa hòe (DPPH đạt 75,30% ở 0,1 mg/mL, năng lực khử OD = 1,314 ở 1,0 mg/mL) cùng tiềm năng to lớn từ rau đắng biển (DPPH đạt 79,12%) và bụp giấm (DPPH đạt 78,92%).
• Đóng góp quy trình công nghệ chiết tách – phân tích chuẩn hóa, tạo nền tảng phát triển các chế phẩm dược liệu chống oxy hóa từ thảo dược Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo trong 6 đến 12 tháng tới là mở rộng đánh giá độc tính tế bào in vitro và thử nghiệm hoạt tính bảo vệ tim mạch in vivo trên mô hình động vật. Quý độc giả và các nhà nghiên cứu quan tâm có thể liên hệ tham khảo toàn văn luận văn để áp dụng chi tiết quy trình thực nghiệm vào sản xuất!

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu những hợp chất tự nhiên (bao gồm tìm kiếm, tách chiết, đ nh gi hoạt t nh) đang ph t triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Việt Nam nơi có hệ động thực vật đa dạng, phong phú và có nhiều loại cây cỏ tác dụng sinh dƣợc mạnh. Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đối tƣợng trong các hợp chất tự nhiên thực vật đƣợc quan tâm nhiều tập trung ở nhóm hợp chất flavonoid vì số lƣợng các chất nhiều, tác dụng của các hợp chất không chỉ là chữa bệnh mà còn phòng bệnh. Quercetin là một flavonoid thực vật có mặt trong nhiều loài, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, ngay cả ở nồng độ thấp. Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở dạng tự do (dạng aglycon) hoặc dẫn xuất cho một số flavonoid kh c, thƣờng gặp là rutin.

Hiện nay, quercetin đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực kh c nhau nhƣ thực phẩm chức năng, thuốc điều trị. Quercetin tồn tại với h m lƣợng lớn trong thực vật do cơ chế th ch nghi, đƣợc hình thành trong quá trình chuyển hóa thứ sinh trong cơ thể thực vật. Quercetin tồn tại với h m lƣợng cao trong các loại chè, táo, hành tây. Quercetin có mặt trong nhiều loại thực vật khác nhau, nhƣng trong c ng nghiệp dƣợc phẩm chủ yếu đƣợc thu nhận nhờ quá trình thủy phân từ rutin (quercetin-3-O-rutinosid).

Tại Việt Nam và một số nƣớc châu Á nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn độ quercetin đƣợc thu nhận chủ yếu từ rutin của hoa cây hòe (Sophora japonica L). Tuy nhiên,các loại thực vật kh c cũng đƣợc biết đến có nhiều flavonoid nói chung và quercetin nói riêng tồn tại ở nhiều dạng liên hợp, có mặt trong một số bài thuốc dân gian lại chƣa đƣợc đề cập nghiên cứu. Khi thu nhận quercetin aglycol (quercetin tự do) ở nhóm thực vật này, nếu tiến hành theo cách tinh chế từng dạng quercetin liên hợp v sau đó thủy phân các dạng liên hợp đã tinh chế đó, theo cách nhƣ thu nhận quercetin tự do từ rutin thì sẽ gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu điều kiện chiết xuất, thủy phân để thu nhận quercetinanglycol trực tiếp từ thực vật, kh ng qua giai đoạn trung gian nhờ vào dạng quercetin liênhợp.

Để giải quyết đƣợc vấn đề này thì cần phải nghiên 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cứu c c phƣơng ph p đ nh giá nhằm x c định quercetin ở dạng tự do và liên hợp, cũng nhƣ độ ổn định của quercetin về hóa lý và sinh học trong quá trình thu nhận. Để góp phần đ p ứng nhu cầu thực tế đó, chúng t i thực hiện đề t i “Nghiên cứu tách chiết v đ nh gi hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam”với mục tiêu: - X c địnhmột số đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa quercetin từ một số loài thực vật tại Việt Nam. - Xác định các thông số sắc ký phù hợp cho phân tách quercetin trong dịch methanol từ hoa hòe trên cột sắc ký và hệ thống HPLC. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về flavonoid 1.

Giới thiệu chung về flavonoid Hợp chất flavonoid là nhóm các sắc tố m u đỏ, xanh da trời và tím ở thực vật. Từ mô tả đầu tiên về các hiệu ứng axit v bazơ trên c c sắc tố thực vật của Robert Boyle năm 1664 đến sự hình thành các gen cấu trúc v điều tiết hình thành các hợp chất flavonoid vào cuối thế kỷ 20, hiện nay đã thu thập đƣợc rất nhiều thông tin về cấu trúc, hoạt động hóa học và sinh tổng hợp những hợp chất này. Flavonoid là nhóm các phân tử có cấu trúc hợp chất v ng thơm, đa dạng và có nguồn gốc từ axit amin Phenilalanin và malonyl-coenzyme A (CoA; thông qua con đƣờng chuyển hóa axit béo). Các hợp chất flavomoid bao gồm 6 phân nhóm chính đƣợc tìm thấy trong hầu hết các thực vật bậc cao.

Các nhóm này gồm các chalcones, flavon, flavonol, flavandiols, anthocyanin, và tannin (hoặc pro anthocyanidins); nhóm thứ bảy là aurones khá hiếm gặp trong tự nhiên [7,19]. Hơn 6000 loại flavonoid kh c nhau đã đƣợc x c định và số lƣợng phát hiện mới hiện vẫn đang tăng lên. C c flavonoid kh c nhau có chức năng sinh học đa dạng, bao gồm bảo vệ chống lại tia cực tím (UV) và tác nhân gây bệnh thực vật, tín hiệu trong quá trình sần, vận chuyển auxin, cũng nhƣ m u sắc của hoa nhƣ một tín hiệu thu hút côn trùng thụ phấn [43,60,65 ]. Hợp chất Flavonoidgiúp cho việc hiển thị màu sắc mùa thu (chuyển màu lá) ở nhiều loài thực vật, có thể bảo vệ tế bào lá khỏi tổn thƣơng, nâng cao hiệu quả thu hồi chất dinh dƣỡng trong quá trình lão hóa.

Flavonol có lẽ là chất flavonoid quan trọng nhất tham gia vào phản ứng stress; chúng là những flavonoid có hoạt t nh đƣợc biết đến từ trƣớc, phổ biến và có tác dụng tới hoạt động sinh lý mạnh [59,65,66]. Sinh tổng hợp flavonoids C c đột biến ảnh hƣởng đến tổng hợp flavonoid đã đƣợc phân lập trong một loạt các loài thực vật. Nhiều nỗ lực đã đƣợc thực hiện trong việc làm sáng tỏ các đƣờng sinh tổng hợp của flavonoid từ góc độ di truyền. Ngô (Zea mays), snapdragon (Antirrhinum majus), và cây dã yên thảo (Petunia hybrida) đƣợc xây dựng thành các m hình đầu tiên trong hệ thống này, dẫn đến sự cô lập của nhiều gen flavonoid cấu 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trúc v điều tiết [60,65].

Gần đây, cây Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) đƣợc nghiên cứu và phân tích sự điều chỉnh và việc chuyển hóa của con đƣờng flavonoid ở thực vật. Việc sử dụng Arabidopsis để nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid có ƣu điểm l c c gen sao chép đơn mã hóa tất cả các enzyme chuyển hóa flavonoid trung tâm, ngoại trừ flavonol synthase (FLS), đƣợc mã hóa bởi 6 gen, nhƣng chỉ có 2 gen (FLS1 và FLS3) có hoạt động đã đƣợc chứng minh locus di truyền cho cả hai gen cấu trúc và điều hòa đƣợc x c định chủ yếu dựa trên đột biến xóa bỏ hoặc giảm sắc tố hạt; do đó loci đƣợc đặt tên là testa trong suốt hoặc đột biến. Hầu hết các gen cấu trúc, cũng nhƣ một số gen điều h a có tƣơng quan với locus đột biến cụ thể trong cây Arabidopsis. Loài này dƣờng nhƣ kh ng sử dụng flavonoid theo c ch tƣơng tự nhƣ một số loài khác tuy nhiên, những đột biến này có ích trong việc x c định vai trò của các hợpFlavonoids Falcone Ferreyra et al.

chất in plants n y trong c c qu trình nhƣ bảo vệ tia cực tím và vận chuyển auxin [14,63,65]. A FLAVONOLS 4-coumaroyl CoA + 3 malonyl CoA QUERCETIN MYB11/12/111 CHS FLS MYB11/12/111 FLS MYB11/12/111 MYB11/12/111 F3H naringenin chalcone naringenin dihydrokaempferol MYB11/12/111 MYB11/12/111 CHI PAP1/PAP2 PAP1/PAP2 DFR TT8/GL3/EGL3 TT8/GL3/EGL3 LAR TTG1 TTG1 leucopelargonin TT2/TT8/TTG1 PAP1/PAP2 ANS TT8/GL3/EGL3 PROANTHOCYANIDINS TTG1 pelargonin TT2/TT8/TTG1 PAP1/PAP2 UFGT TT8/GL3/EGL3 TTG1 PELARGONIN CYANIDIN ANTHOCYANINS 3-GLUCOSIDE 3-GLUCOSIDE 166. Con đƣờng sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A. thaliana [65] PHLOBAPHENES B Chú thích: Enzymes và các chất trung gian đƣợc biểu diễn bằng chữ m u đen, c c 4-coumaroyl CoA chất điều hoà có màu.

Sàn phẩm + 3 malonyl CoA cuối flavan-4-ol cùng là chữ in hoa. CHS, Chalcone synthase; CHI, P1 P1 chalcone isomerase; C1/PL F3H Flavanone CHS P1 3 FNR hydroxylase; C1/PL P1 F3'H, flavonoid-3'-hydroxylase; DFR, R/B C1/PL R/B C1/PL dihydroflavonol 4-reductase; R/B FNR,R/Bflavanone-4-reductase; ANS, anthocyanidin synthase, naringenin chalcone naringenin eriodictyol C1/PL P1 F3’H UFGT, UDP-glucose flavonoid 3-OCHI glycosyltransferase, F3H FLS,F3H flavonol R/B synthase C1/PL FLS F3’H R/B C c KAEMPFEROL flavonoid đƣợc P1 QUERCETIN biến tổng hợp qua đƣờng phenylpropanoid, FLS C1/PL P1 FLAVONOL C1/PL C1/PL FLAVONOL R/B phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA, cuối cùng đi v o con đƣờng sinh tổng hợp R/B R/B flavonoid (Hình 1. Enzyme đầu tiên đặc hiệu cho con đƣờng C1/PL flavonoid là chalcone R/B C1/PL R/B 4 CYANIDIN ANTHOCYANINS 3-GLUCOSIDE LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] FIGURE 2 | Regulation of the flavonoid pathw ay in Arabidopsisthaliana (A) isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3′ H, flavonoid-3′ -hydroxylase; DFR, synthase xúc tác cho phản ứng tạo ra các chalcone mà từ đó tất cả c c flavonoid đƣợc tổng hợp [65]. Con đƣờng trung tâm cho sinh tổng hợp flavonoid đƣợc bảo tồn trong thực vật, tùy thuộc vào loài một nhóm c c enzym nhƣ isomerases, reductases, hydroxy-lases, và một số dioxygenases phụ thuộc Fe2+.

Hợp chất 2-oxyglutarate phụ thuộc vào bộ xƣơng flavonoid cơ bản, dẫn đến các phân lớp flavonoid khác nhau. Cuối cùng, tranferases thay đổi xƣơng sống flavonoid với đƣờng, nhóm methyl hoặc acyl moieties, điều chỉnh hoạt động sinh lý của flavonoid kết quả bằng c ch thay đổi độ hòa tan, phản ứng v tƣơng t c với các mục tiêu tế bào [67].3 Các dạng khác nhau của flavonoid Quercetin là một flavonoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Tên n y đã đƣợc sử dụng từ năm 1857 v có nguồn gốc từ quercetum (rừng sồi), sau là Quercus. Quercetin là chất ức chế vận chuyển auxin có tự nhiên[49].

Quercetin là một trong những chất flavonoid đƣợc sử dụng nhiều[16,17] với mức tiêu thụ trung bình hàng ngày khoảng 25-50 miligam/ngƣời. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol, myricetin và isorhamnetin) [40] Hình 1. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) [40] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) [40] Hình 1.

Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins) [40] Hình 1. Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins [40] 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins [40] Các nguồn khác của quercetin có thể l nho, dâu đen, v dầu liu. Đồ uống nhƣ tr xanh v rƣợu vang đỏ (4-16mg/l) cũng chứa một lƣợng đ ng kể các quercetin.

Lợi ích chính của quercetin là loại flavonoid này có chất chống oxy hóa mạnh, hỗ trợ chống lại các tế bào gốc tự do [21,35]. Quercetin và một số tính chất đặc trƣn Quercetin, một đại diện lớn của lớp flavonol, chất đã trở th nh đối tƣợng nghiên cứu nhận đƣợc sự chú ý đ ng kể. Quercetin và dẫn xuất của nó trong thực phẩm chứa liên kết đƣờng, đại diện cho 60-75% lƣợng flavonoid trong rau củ, quả [10,31]. Quercetin là một trong những chất có màu vàng tự nhiên.

Nó đƣợc phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercetrin có trong vỏ cây Querceus tinctorial khi thuỷ phân trong m i trƣờng axit thu đƣợc quercetin và một phân tử đƣờng rhamonose: C21H20O11 + H2O (thuỷ phân trong HCl)  C15H10O7 + CH3(CHOH)4CHO 1. Định d nh và đặc tính của quercetin Hình 1. Cấu trúc hóa học của quercetin[47] Một phân tử quercetin (hình 1.