CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về melanin 1. Melanin và vai trò trong cơ thể Sắc tố là một trong những đặc điểm kiểu hình rõ ràng nhất trong thế giới tự nhiên. Trong các tế bào động vật hoặc thực vật, một sắc tố được định nghĩa là bất kỳ chất tạo màu do chúng phản xạ và hấp thụ một số sóng ánh sáng đặc hiệu [6].
Trong các sắc tố sinh học đó, melanin được phân bố rộng rãi nhất và được tìm thấy trong suốt quá trình phát sinh loài, từ các vi sinh vật cho đến động vật, có cả con người [7]. Ở người, melanin được tìm thấy chủ yếu trong da, tóc, võng mạc [8]. Melanin được tiết ra bởi tế bào sắc tố phân bố ở lớp đáy của biểu bì. Vai trò của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia tử ngoại, đặc biệt là tia cực tím UVB bằng cách hấp thụ và tán xạ ánh sáng mặt trời và loại bỏ các gốc oxy hóa tự do.
Các rối loạn khác nhau ở da là kết quả của sự tích tụ quá mức sắc tố ở biểu bì. Tăng sắc tố có thể do tăng tế bào tạo sắc tố hoặc do tăng hoạt động của các enzym hình thành sắc tố. Các tế bào biểu bì tạo sắc tố của động vật có vú có thể sản xuất hai loại melanin là eumelanin và pheomelanin. Eumelanin có màu từ nâu đến đen, không tan trong hầu hết các dung môi, liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị.
Pheomelanin có màu từ vàng đến đỏ, có bộ khung được tạo bởi các tiểu đơn vị là các benzothiazin và cũng liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị. Tỷ lệ về số lượng và mật độ của hai melanin này sẽ quyết định màu sắc của da, mắt và tóc[9]. Quá trình tổng hợp sắc tố melanin trong da Bước đầu tiên và cũng là bước bắt buộc trong quá trình hình thành sắc tố là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon. Đây là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp tyrosin do chuỗi phản ứng còn lại có thể tự diễn ra tại một giá trị pH sinh lý nhất định.
Dopaquinon sinh ra được chuyển thành leukodopachrom, sau đó chuyển thành dopachrom. Cuối cùng eumelanin được hình thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ các sản phẩm chuyển hóa của dopachrom là 5,6-dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA). Trong trường hợp có sự có mặt 3 của cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển hóa thành cysteyldopa hoặc glutathionyldopa. Cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin [10, 11].1: Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin 1.
Tổng quan về enzym tyrosinase 1. Enzym tyrosinase Enzym tyrosinase (EC 1.1) hay còn gọi là enzym polyphenol oxidase (PPO), là một enzym monooxygenase được phân bố rộng rãi trong nấm, động vật và thực vật, có chứa đồng tham gia vào hai phản ứng riêng biệt của quá trình chuyển hóa melanin. Một là hydroxyl hóa monophenol thành Odiphenol, hai là oxi hóa O-diphenol thành O-quinon; sau đó, Oquinon tham gia một loạt các phản ứng để tạo thành melanin [12].2: Quá trình oxy hóa phenol thông qua enzym tyrosinase Enzym tyrosinase có thể tồn tại ở 3 dạng là: oxy, deoxy, met-tyrosinase được biểu diễn qua sơ đồ trong Hình 1. Cả dạng met-tyrosinase và dạng oxy- tyrosinase đều có hoạt tính diphenolase, trong khi chỉ có dạng oxy-tyrosinase là có hoạt tính monophenolase.
Dạng deoxy-tyrosinase là dạng yếu, không ổn định; phản ứng với oxy để tạo thành dạng oxy-tyrosinase.3: Các dạng oxi hóa của enzym tyrosinase 1. Cơ chế ức chế tyrosinase Thường thì enzym tyrosinase bị ức chế theo 3 cơ chế chính là: ức chế cạnh tranh (competitive inhibition), ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition) và ức chế hỗn hợp (mixed inhibition) ngoài ra còn có cơ chế ức chế phi cạnh trạnh (noncompetitive inhibition) là một trường hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp. Và hiện nay để xác định được cơ chế ức chế của enzym người ta thường dựa vào dạng đường thẳng của Michaelis-Menten gọi là phương trình Lineweaver – Burk [14]. 5 Michaelis-Menten là mô hình động học đơn giản đưa ra công thức thể hiện mối liên quan giữa tốc độ phản ứng của enzym và nồng độ cơ chất.
Phương trình Michaelis- Menten như sau: Trong đó: Vo: là tốc độ phản ứng ban đầu Vmax::tốc đô phản ứng cực đại khi toàn bộ enzym liên kết cơ chất. Km: là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzym {S}: nồng độ của cơ chất. Từ phương trình Michaelis-Menten chúng ta có thể biến đổi thành các phương trình khác để vẽ ra được dữ liệu thực nghiệm và một trong những cách biến đổi đơn giản đó là nghịch đảo cả 2 vế của phương trình: Phương trình nghịch đảo này được gọi là phương trình Lineweaver-Burk. Đồ thị Lineweaver-Burk là một đường thẳng thể hiện mối tương quan giữa nồng độ cơ chất và vận tốc của phản ứng.4: Đồ thị Lineweaver-Burk.
6 Trong các cơ chế ức chế khác nhau thì đồ thị Lineweaver-Burk thể hiện mối tương quan giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng cũng sẽ khác nhau [14]. * Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition) Trong trường hợp ức chế cạnh tranh thì cơ chất và chất ức chế đều tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym, Chất ức chế gắn vào vị trí của cơ chất ở enzym.5: Cơ chế ức chế cạnh tranh Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể làm giảm hoặc mất tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàn toàn. Trong trường hợp này thì phương trình và đồ thị Lineweaver-Burk như sau: Không có chất ức chế 7 Hình 1.6: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế cạnh tranh [14]. * Ức chế không cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) Đặc trưng của kiểu ức chế này là chất ức chế chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzym tự do.7: Cơ chế ức chế không cạnh tranh Ở đây chất ức chế không tranh chấp vị trí gắn trên enzym với cơ chất mà cùng với cơ chất gắn vào enzym.
Đồ thị và phương trình Lineweaver-Burk như sau: Không có chất ức chế Hình 1.8: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế không cạnh tranh. *Ức chế hỗn hợp (Mixed inhibition) 8 Hình 1.9: Cơ chế ức chế hỗn hợp Trong trường hợp này chất ức chế không những liên kết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS và không tạo được sản phẩm P. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế. Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế.
Đồ thị và phương trình Lineweaver-Burk như sau: Không có chất ức chế Hình 1.10: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế hỗn hợp Trường hợp ức chế phi cạnh tranh (noncompetitive inhibition) là một trường hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp. Trong trường hợp này thì điểm giao nhau của đồ thị đường thẳng nằm trên trục hoành [14]. Các chất ức chế enzym tyrosinase 1.Các chất ức chế enzym tyrosinase có nguồn gốc thiên nhiên 9 Polyphenol thực vật là nhóm các hợp chất có nhiều nhóm chức phenol, tiêu biểu là flavonoid. Hơn 4000 flavonoid phân bố trong lá, hạt, vỏ cây và hoa đã được xác định.
Ở thực vật các hợp chất này bảo vệ thực vật bằng cách chống lại tia cực tím và tác nhân gây bệnh [15]. Một số flavonoid như kaempferol, quercetin và morin thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase, trong khi những chất khác, ví dụ catechin và rhamnetin, đóng vai trò là các cơ chất của tyrosinase. Một số nghiên cứu cho thấy rằng flavonoid có chứa nhóm α- keto có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh [16]. Các aldehyd và nhiều hợp chất khác cũng được phân lập và xác định là có tác dụng ức chế enzym tyrosinase như cinnamaldehyd, (2E) -alkenal, 2-hydroxy-4- methoxybenzaldehyd, anisaldehyd, cuminaldehyd và acid cumic[17].
Hoạt động ức chế tyrosinase của anisaldehyd và cuminaldehyd mạnh hơn khoảng 2,5 và 16 lần so với benzaldehyd. Một số alkanal có tác dụng ức chế tyrosinase có thể là do sự tương tác kỵ nước của chúng với các enzym, làm ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 3 của enzym. Metallothionein từ Aspergillus niger là một chất ức chế tyrosinase và có tác dụng ức chế quá trình oxy hoá mạnh hơn trên các catechin so với acid chlorogenin [19]. Các chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp Một lượng đáng kể các hợp chất có nguồn gốc tổng hợp như hydroxylamin, các hợp chất chứa thiol, acid cacboxylic thơm, dẫn xuất của acid cinnamic, trihydroxy chalconas, peptid, acid alkylbenzoic [20], N-hydroxy-N’-phenyl ure và N-hydroxyN’- phenyl thioure[21] có tác dụng ức chế enzym tyrosinase.
Tropolon (2-hydroxy-2,4,6- cycloheptatrien-1-on) là một trong những chất ức chế tyrosinase mạnh nhất. Nó có cấu trúc tương tự như các cơ chất O-diphenolic của tyrosinase [22]. Resorcinol được gắn nhóm thế ở vị trí 4 là các chất ức chế tyrosinase yếu. Trong các hợp chất này, tác dụng ức chế mạnh nhất đạt được khi thay thế nhóm kỵ nước vào vị trí thứ 4, chẳng hạn như 4-hexyl resorcinol và 4-dodecyl resorcinol.
4- hexyl resorcinol là các chất ức chế tyrosinase hiệu quả nhất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm vì nó hòa tan trong nước, ổn định, không độc hại, không gây đột biến và không gây ung thư, và chất 10 này cũng đã được công nhận là an toàn trong việc kiểm soát sự sẫm màu của lát táo cũng như khoai tây và bơ khi để ngoài không khí lâu [23]. Các dược liệu có tác dụng ức chế enzym tyrosinase Năm 2021, Ni Putu Linda Laksmiani và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy hợp chất quercetin chiết xuất từ lá chùm ngây (Moringa oleifera L.) có tác dụng ức chế tyrinase và là một chất tiềm năng giúp làm sáng da [24]. Năm 2022 An Nisaa Nurzak và cộng sự đã đánh giá và cho thấy dịch chiết lá chùm ngây có tác dụng ức chế enzym tyrosinase tốt, và có thể phát triển thành kem làm trắng da [25]. Các hợp chất quan phenolic chính trong lá chùm ngây là flavonoid như quercetin và kaempferol.
Dung môi methanol 80% và ethanol 70% là dung môi thích hợp nhất để chiết xuất các chất chống oxy hoá trong lá chùm ngây [26]. Với mục đích phát triển các sản phẩm làm trắng da, nghiên cứu của Lee năm 1997 cho thấy dịch chiết nụ hoa hoè (Sophora japonica L. ức chế 80% hoạt tính enzym tyrosianse ở nồng độ 333 g/ml [27]. Ngoài ra, các hoạt chất chiết xuất từ hoè có tác dụng ức chế melanin, do đó chúng có thể được cân nhắc ứng dụng trong mỹ phẩm làm trắng da [28].