CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về tyrosinase 1. Enzym tyrosinase và con đường hình thành hắc tố melanin 1. Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của enzym tyrosinase Enzym tyrosinase, còn được gọi là polyphenol oxyase, là một enzym chứa đồng (Cu) với nhiều chức năng, phổ biến ở nhiều sinh vật bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật [18].
TYR chỉ được sản xuất bởi các tế bào melanocyt. Sau khi được sản xuất và xử lý trong lưới nội chất và bộ máy golgi, nó được chuyển thành melanosom [60]. Oxy phân tử được tích hợp vào trung tâm phân tử để tạo thành oxy-tyrosinase hoạt động. Tại vị trí hoạt động, hai ion đồng tương tác với dioxygen tạo thành chất trung gian có tính phản ứng cao, tham gia trực tiếp vào quá trình hydroxyl hóa monophenol thành diphenol (hoạt tính monophenolase) và oxy hóa o-diphenol thành o-quinone (hoạt tính diphenolase) [14], [29].
Thuật ngữ tyrosinase được dùng để chỉ ra rằng chất nền điển hình của nó là tyrosin. Cả hai hoạt tính tyrosinase (monophenolase và diphenolase) đều có cơ chất rộng, mặc dù enzym này có ái lực cao hơn với các đồng phân L của cơ chất so với các đồng phân D tương ứng. TYR có nguồn gốc từ Streptomyces glausescens , nấm Neurospora crassa và Agaricus bisporus thì cho hoạt tính tốt nhất. Ở nấm và động vật có xương sống, TYR xúc tác bước đầu tiên trong quá trình hình thành sắc tố melanin từ tyrosin.
Ở thực vật, nhiều loại phenolic là cơ chất của TYR. Khi các mô bị tổn thương, TYR oxy hóa chúng theo con đường hóa nâu, gây giảm chất lượng và giá trị dinh dưỡng. TYR được chiết xuất từ nấm A. bisporus rất tương đồng với TYR của động vật có vú, do đó nó rất phù hợp làm mô hình cho các nghiên cứu về quá trình hình thành hắc tố.
Trên thực tế, hầu hết các nghiên cứu về chất ức chế TYR được thực hiện cho đến nay đều sử dụng TYR từ nấm vì loại TYR này có sẵn trên thị trường [9]. Đặc điểm chung quan sát thấy ở TYR từ các nguồn khác nhau đó là liên kết đồng ở trung tâm được bảo tồn [63], [76]. Từ quan điểm cấu trúc, hai ion đồng được bao quanh bởi 6 gốc histidin chịu trách nhiệm cho hoạt động xúc tác của TYR [57].1: Cấu trúc không gian của enzym tyrosinase Trong quá trình hình thành hắc tố melanin, có ba loại TYR (oxy-, met- và deoxytyrosinase, hình 1.2) với các cấu trúc hai ion đồng tại vị trí hoạt động khác nhau. Phân tử oxy ngoại sinh được liên kết dưới dạng peroxid và là cầu nối giữa hai trung tâm đồng.
Mettyrosinase (Emet ) có cấu trúc tương tự như dạng oxy, chứa hai ion đồng (II) liên kết với nhau thông qua một cầu nối, các phối tử hydroxid ngoại sinh được liên kết với hai ion đồng. Deoxytyrosinase (Edeoxy ) chứa hai ion đồng (I) với cách sắp xếp phối hợp tương tự như dạng met, nhưng không có cầu hydroxid. TYR thu được sau khi tinh chế (tức là dạng nghỉ của enzym) chính là hỗn hợp của 85 % Emet và 15 % Eoxy.2: Cấu trúc của 3 loại enzym tyrosinase Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính xúc tác tối đa của TYR được quan sát thấy ở pH 7 và khoảng 50 % mức hoạt tính xúc tác tối đa được quan sát thấy ở pH từ 5 đến 8, 3 enzym TYR tương đối không ổn định ở pH thấp và ở nhiệt độ cao [25]. TYR được biết đến như một enzyme chủ chốt trong bước kiểm soát quá trình hình thành hắc tố [53].
Rối loạn sắc tố da và quá trình hình thành hắc tố melanin Melanin, một sắc tố chính trong da của động vật có vú, được biết đến có tác dụng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, stress oxy hoá và tổn thương DNA. Sự tích tụ hoặc sản xuất quá mức melanin có thể gây ra các vấn đề về thẩm mỹ cũng như các bệnh nghiêm trọng liên quan đến chứng tăng sắc tố. Melanin giúp điều chỉnh màu da, giảm sắc tố là tình trạng bệnh lý khi cơ thể sản xuất ít melanin hơn; mặt khác, tăng sắc tố là sự gia tăng tổng hợp melanin [58], [67]. Do vậy, màu da của một người có thể thay đổi, trở nên trắng sáng hơn (giảm sắc tố), như trong hình 1.3: A, B; hoặc sẫm màu hơn (tăng sắc tố), như trong hình 1.3: Các rối loạn về da Các bệnh liên quan đến tăng sắc tố da bao gồm nám, tàn nhang, đốm nắng, tăng sắc tố sau viêm và đốm đồi mồi.
Tăng sắc tố sau viêm xuất hiện ở nhiều tình trạng da, bao gồm mụn trứng cá, chàm và viêm da tiếp xúc [51]. Nguyên nhân thường gặp nhất của chứng tăng sắc tố là do tiếp xúc với ánh nắng mặt trời - tác nhân kích thích sản xuất melanin [70]. ❖ Các phương pháp có thể dùng để điều trị tăng sắc tố da bao gồm: + Sử dụng thuốc điều trị: Thuốc uống và kem bôi: Thuốc uống có tác dụng mạnh hơn các loại kem bôi và không cần phải bôi thường xuyên. Tuy nhiên, thuốc uống khá đắt tiền và gây ra nhiều tác dụng phụ hơn so với các liệu pháp bôi tại chỗ [8].
4 + Sử dụng các dược liệu thiên nhiên: Các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược giúp cải thiện độ sáng của da đang được quan tâm vì chúng được cho là an toàn và tốt cho sức khỏe hơn các sản phẩm tổng hợp hoàn toàn [30]. Các kem bôi da, thực phẩm chức năng hỗ trợ làm sáng da đã và đang ngày càng trở nên phổ biến trong chăm sóc sắc đẹp. + Sử dụng công nghệ hiện đại: liệu pháp laser đã và đang được ưa chuộng trong việc điều trị các vấn đề về sắc tố da [70]. ❖ Quá trình hình thành hắc tố Bước đầu tiên của quá trình hình thành hắc tố melanin là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon, phản ứng này được xúc tác bởi TYR.
Đây là bước giới hạn tốc độ trong quá trình tổng hợp melanin vì các phản ứng còn lại của chuỗi phản ứng có thể diễn ra một cách tự nhiên ở giá trị pH sinh lý [19]. Tiếp theo, Dopaquinon được chuyển thành dopa và dopachrom thông qua quá trình oxy hóa tự động. Dopa cũng là cơ chất của TYR bởi vì TYR oxy hóa dopa trở lại thành dopaquinon. Thông qua một vài phản ứng hóa học, dopachrom biến đổi tạo ra dihydroxyindole (DHI) và axit dihydroxyindole-2- carboxylic (DHICA).
Cuối cùng, eumelanin được hình thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ DHI và acid DHICA. Nếu có mặt của cystein hoặc glutathion, dopaquinon được chuyển thành cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa, sau đó tạo ra pheomelanin. Ngoài eumelanin và pheomelanin, các “melanin” khác được gọi là allomelanin [9].4: Sơ đồ quá trình tạo thành melanin trong tế bào hắc tố 5 Các chất ức chế tổng hợp melanin được sử dụng tại chỗ để điều trị chứng tăng sắc tố cục bộ ở người [72], các chất này có tầm quan trọng rất lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp thực phẩm [79]. Vai trò và các chất ức chế enzym tyrosinase ❖ Vai trò của ức chế TYR TYR có tầm quan trọng rất lớn trong việc điều trị các rối loạn về da như nám, tàn nhang, đốm đen và tăng sắc tố [22].
Bởi vì trong con đường sinh tổng hợp melanin, TYR xúc tác hai bước đầu tiên có tốc độ giới hạn, do đó việc ức chế enzym này cũng có thể ngăn chặn sự tích tụ của các chất trung gian phản ứng [68]. Ở thực vật, TYR xúc tác tạo ra các hợp chất quinon làm rau quả bị thâm. Không chỉ ảnh hưởng tới màu sắc mùi vị của hoa quả mà các hợp chất quinon sinh ra còn có thể làm giảm hoặc mất giá trị dinh dưỡng, dẫn đến việc không sử dụng được gây lãng phí nguồn thực phẩm [69]. Ức chế TYR cũng có tác dụng trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson.
Việc sản xuất quá nhiều TYR được cho là có thể dẫn đến sự gia tăng dopamin nội bào, tạo ra một lượng lớn melanin và do đó gây chết tế bào [21]. Vậy nên các chất ức chế TYR có vai trò rất quan trọng trong mỹ phẩm, dược phẩm và công nghiệp thực phẩm. Cho đến nay, mặc dù có nhiều chất ức chế TYR nhưng chỉ có một số ít được bán trên thị trường là an toàn [10]. Vì vậy, việc tìm kiếm các chất ức chế TYR mới có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị tăng sắc tố, phát triển các chất làm trắng da và sử dụng làm chất bảo quản trong công nghiệp thực phẩm [59].
❖ Các chất ức chế TYR Do cấu trúc, chức năng của enzym đã được xác định rõ ràng, việc ức chế TYR là mục tiêu chính để điều trị tình trạng tăng sắc tố [42]. Hầu hết các loại mỹ phẩm hoặc chất làm sáng da có bán trên thị trường đều có thành phần là chất ức chế TYR. Các chất ức chế melanin nhắm vào đích TYR có thể ức chế đặc hiệu sự hình thành hắc tố trong tế bào mà không gây ra tác dụng phụ bởi vì TYR chỉ được sản xuất bởi các tế bào hắc tố. ❖ Các chất ức chế TYR phổ biến Nhiều chất ức chế TYR như hydroquinon (HQ), arbutin, axit kojic (KA), axit azelaic, axit L -ascorbic, axit ellagic, axit tranexamic đã được sử dụng làm chất làm trắng da, tuy nhiên chúng đều có một số hạn chế nhất định [57].
+ Hydroquinone (HQ) là thành phần phổ biến nhất và được sử dụng thường xuyên trong các chất làm trắng da. Tuy nhiên, HQ cho là nguyên nhân chính gây kích ứng da, ngoài ra HQ còn gây đột biến tế bào động vật có vú và gây độc tế bào hắc tố [37]. 6 + Arbutin và axit kojic (KA) là những chất ức chế TYR thường được sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm để làm trắng da. Về mặt lâm sàng, các chất khử sắc tố này cũng được áp dụng để điều trị chứng tăng sắc tố.
Arbutin và KA có nguồn gốc tự nhiên và có hiệu quả vừa phải, do đó chúng được ưa chuộng sử dụng để thay thế cho HQ [37]. Tuy nhiên, ở nồng độ điều trị KA có thể gây mẫn cảm cho da và arbutin có khả năng gây độc tế bào [53]. + Acid L-ascorbic nhạy cảm với nhiệt độ nên dễ bị phân huỷ. Acid ellagic không hoà tan trong nước do đó sinh khả dụng kém.
Do đó nhu cầu tìm chất ức chế TYR từ thiên nhiên an toàn, ít gây tác dụng không mong muốn là rất lớn [84]. ❖ Các nguồn chất ức chế TYR tự nhiên Chất ức chế hoạt tính TYR có trong thực vật, vi khuẩn và nấm. Các nhà nghiên cứu cho rằng các hợp chất từ thiên nhiên ít độc tính và sinh khả dụng cao.