MỞ ĐẦU B-galactosidase (B-D-galactohydrolase, EC 3.23), thường gọi là lactase, là một enzyme thủy phân gốc D-galactosyl từ các polymer, oligosaccharide hoặc sản phẩm trao đôi chất. Enzyme này có hai ứng dụng chính: làm giảm hàm lượng lactose trong các sản phẩm sữa dành cho người mắc hội chứng không dung nạp lactose và tong hợp các sản phẩm galactosyl hóa [11, 14, 29]. B-galactosidase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để làm tăng độ ngọt, khả năng hòa tan, hương vị và khả năng tiêu hóa cho các sản phẩm sữa [33, 65]. Lactose là cơ chất chủ yếu của quá trình thủy phân xúc tác bởi B-galactosidase.
Lactose có khả năng ứng dung trong nhiêu lĩnh vực thực phẩm nhưng vi nó có những hạn chế rất lớn về độ tan, một số tính chất vật lý đặc trưng và đặc biệt là một SỐ người không có khả năng tiêu hóa lactose nên carbohydrate này vẫn còn được ứng dụng hết sức hạn chế. Trong tự nhiên, lactose có mặt trong thành phan hầu hết các loại sữa có nguồn gốc từ động vật, trong dich whey - sản phẩm thải của ngành công nghiệp sản xuất phô mai. Vi sinh vật là đối tượng tiềm năng để khai thác thu nhận P-galactosidase. Enzyme nay được chia làm hai loại tùy theo nguồn gốc của nó: enzyme từ nam sợi — còn gọi là lactase acid — có thể hoạt động tốt trong môi trường pH dao động từ 3,0 đến 5,0; nhiệt độ phản ứng từ 50°C đến 60°C; enzyme từ vi khuẩn và nắm men — còn gọi là lactase trung tính — hoạt động trong khoảng pH trung tính và nhiệt độ 30°C đến 40°C.
ÿ- galactosidase từ nắm sợi là enzyme phù hợp để thủy phân lactose có mặt trong các sản phẩm có tính acid như whey — nguồn nguyên liệu tiềm năng dé sản xuất syrup từ lactose hiện nay [49]. Trong các đối tượng nắm sợi, Aspergillus oryzae hiện đang được đánh giá là đối tượng vi sinh vật tiềm năng vì chủng này có xu hướng tạo được ÿ- galactosidase ngoại bào với hoạt tính cao. Các nghiên cứu sản xuất B-galactosidase từ nam sợi chủ yếu tập trung ở quá trình lên men bán ran nhờ vào các đặc điểm vượt trội khi nuôi cay nam sợi theo phương pháp này: không cần khuấy đảo hay thông khí; thành phần môi trường đơn giản, rẻ tiền, thường là phế liệu của các ngành sản xuất nông nghiệp, thực phẩm; dễ phát hiện và loại bỏ nhiễm tạp; không cần trang thiết bị tốn kém ở quá trình lên men. Bên cạnh đó, lên men bán ran van còn tổn tại những nhược điểm nhất định như hạn chế trong quá trình kiểm soát tạp nhiễm, đồng đều chất lượng sản phẩm, chi phí tinh sạch.
Tuy nhiên, các công bố cho thay đối tượng nắm sợi có xu hướng phù hợp với quá trình lên men bán ran vì là chủng vi sinh vật hiếu khí, đòi hỏi nhiều oxy cho quá trình sinh trưởng pha phát triển, có khả năng phát triển trên nguồn dinh dưỡng đa dạng và có khả năng lấn át nhiều chủng vi sinh vật khác. Mặt khác, hiện nay các sản phẩm của công nghệ lên men ở quy mô công nghiệp thường được hướng tới sản xuất băng phương pháp lên men chìm. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát quá trình sinh tổng hợp ÿ- galactosidase từ Aspergillus oryzae băng các phương pháp lên men” với các mục tiêu sau: “Khảo sát quá trình lên men B-galactosidase từ Aspergillus oryzae bang hai phương pháp lên men cơ bản là lên men bán ran và lên men chìm nhằm lựa chọn phương pháp lên men phù hợp; = Bước dau thăm dò khả năng ứng dung tao syrup nông độ cao từ lactose. Với các mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện dé tài bao gom các nội dung sau: # Sang loc chung Aspergillus oryzae có hoạt tính B-galactosidase cao; = Tối ưu quá trình lên men bán ran thu nhận B-galactosidase từ Aspergillus oryzae: = Tối ưu quá trình lên men chìm thu nhận B-galactosidase từ Aspergillus oryzae: = So sánh, lựa chọn phương pháp lên men tối ưu; = Khảo sát một số đặc điểm của enzyme ƒ-galactosidase; = Bước đầu thăm dò khả năng thủy phân phân lactose ứng dụng tao syrup nồng độ cao sử dụng sinh khối Aspergillus oryzae trong cột phản ứng.
CHUONG 1 TONG QUAN 1. Giới thiệu enzyme B-galactosidase B-galactosidase (B-D-galactohydrolase, EC 3.23) là một enzyme thủy phân gốc D-galactosyl từ các polymer, oligosaccharide hoặc sản phẩm trao đối chat. Enzyme này có hai ứng dụng chính: làm giảm hàm lượng lactose trong các sản phẩm sữa dành cho người mac hội chứng không dung nap lactose và tong hợp các sản pham galactosyl hóa [11, 14, 29]. B-galactosidase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm dé làm tăng độ ngọt, kha năng hòa tan, hương vi và khả năng tiêu hóa cho các sản phẩm sữa [33, 65].
Enzyme nay còn được su dụng như một mô hình để nghiên cứu hoạt tính trong chất kết dính vô định hình [49]. B-galactosidase hoạt động trong khoảng pH rộng: enzyme từ nam sợi có khoảng hoạt động từ pH 2,5 đến 5,4; nam men và vi khuẩn tổng hợp enzyme hoạt động tốt trong khoảng pH trung tính. Các enzyme này được xếp vào nhóm glycoside hydrolase 2 (GH2) và glycoside hydrolase 35 (GH35). Cac enzyme thuộc nhóm GH2 chiếm da số trong tự nhiên và thường thấy ở enzyme vi sinh vật.
Trong khi đó, 70% enzyme thuộc nhóm GH35 có nguồn gốc từ thực vật [49]. Nguồn thu nhận và tính chất enzyme B-galactosidase B-galactosidase thường được tìm thay ở vi sinh vật (vi khuẩn, nắm men va nam sợi), thực vật đặc biệt là ở quả hạnh, đào, mơ, táo và cơ quan của động vật. Enzyme thương mại chủ yếu được thu nhận từ Aspergillus sp. va Kluyveromyces sp.
B-galactosidase từ Kluyveromyces lactis là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi nhất [49]. Một số enzyme ÿ-galactosidase đã được các nhà sản xuất thương mại hóa được thé hiện ở bang 1. Thu nhận enzyme từ nguon vi sinh vat có nhiều thuận lợi vượt trội so với nguồn động thực vật như: dễ kiểm soát, tốc độ sinh trưởng nhanh và enzyme thu được có sản lượng cao. Nhiều loại enzyme j-galactosidase đã được tinh sạch, giải trình tự và xác định các đặc tính.
Một vài loại đã được tạo dòng và biểu hiện trên vật chủ khác; tuy nhiên, sản phẩm này cần phải được phân tích, đánh giá về nhiều chỉ tiêu trước khi sử dung, đặc biệt là tinh an toàn với người khi áp dụng vào các sản phẩm thực phẩm [46]. Một số ezyme -galactosidase thương mại Nguồn enzyme Tên thương mại ˆ Nhà cung cấp Vi khuẩn Bacillus sp. Novozyme 231 Novozymes A/S, Dan Mach Escherichia coli B-galactosidase Sigma-Aldrich, Anh Nam men Kluyveromyces lactis Maxilact DSM Food Specialties, Ha Lan Lactase SNAM Progetti, Y B-galactosidase Sigma-Aldrich, Anh Saccharomyces fragillis B-galactosidase Sigma-Aldrich, Anh Kluyveromyces marxianus Lactozyme Novozymes A/S, Dan Mach Kluyveromyces sp. Lactase NL Enzyme Development Corporation, MY Candida pseudotropicalis — Lactase trung tinh Pfizer, Mỹ Nam soi Aspergillus niger Sumylact Sumitomo Chemical, Nhat Ban Lactase Valio Laboratory, Phan Lan Aspergillus oryzae Fungal lactase Enzyme Development Corporation, Mỹ Biolactase Biocon (US) Inc.
Lexington, Mỹ Lactase 2214C Rohm, Duc B-galactosidase Sigma-Aldrich, Anh [46] Enzyme được nghiên cứu nhiều nhất có nguồn gốc từ Escherichia coli mã hóa bởi gene lacZ. Enzyme nay là mô hình dé tìm hiểu cơ chế phan ứng của B-galactosidase, nhưng lại không phải là đối tượng thu nhận enzyme phù hợp với mục đích ứng dụng trong thực phẩm vì vật chủ thuộc nhóm coliform. Tuy nhiên, bên cạnh Escherichia coli, số lượng vi sinh vật có khả năng sinh tong hợp -galactosidase cũng khá đa dang trong tự nhiên (Bang 1. Các vi sinh vật được chú ý là nguồn thu nhận enzyme tiêm năng trong sản xuất công nghiệp.
Tuy nhiên, giữa chúng có sự khác biệt về điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất và tinh sạch enzyme. Giá thành của enzyme cũng khác nhau ở mức độ sản xuất và tinh sạch. Vì thê, hiện nay người ta dang chú ý đền việc tìm ra loài vi sinh vật có các đặc tính đáp ứng cho sản xuất công nghiệp, sản lượng cao và chi phí tinh sạch thấp va phù hợp với định hướng ứng dụng [46]. Nguồn vi sinh vật tong hợp ñ-galactosidase Nguồn Loài Nắm sợi Alternaria alternate, Alternnaria palmi Aspergillus foetidis, Aspergillus fosecaeus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus carbonarius Auerobasidium pullulans Beauveria bassiana Curvularia inaequalis Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum Mucor meihei, Mucor pusillus Neurospora crassa Paecilomyces varioti Penicillium conescens, Penicillium chrysogenum Rhizobium meliloti Saccharopolyspora rectivirgula Scopulariopsis sp.
Streptomyces violaceus Trichoderma ressei Nâm men Bullera singularis Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensis, Saccharomyces fragilis Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces fragilis, Kluveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus Vi khuẩn Arthrobacter sp. Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus Bacteroides polypragmatus Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloaceae Escherichia coli Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus thermophiles, Lactobacillus delbrueckii Leuconostoc citrovorum Pediiciccus acidilacti, Pediococcus pento Propionibacterium shermanii Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophiles Sulfolobus solfataricus Thrmoanaerobacter sp. Thermus rubus, Thermus aquaticus, Thermus thermophiles Vibrio cholera Xanthomonas campestris [46] 1. Enzyme tir nam soi Enzyme từ nam sợi có pH tối ưu trong khoảng acid từ pH 2,5 đến 5,4.
Do đó, các enzyme này phù hợp cho các quá trình xử lý acid whey và permeate siêu lọc. Các enzyme này có giá trị nhiệt độ hoạt động khá cao và thường sử dụng ở nhiệt độ phản ứng lên đến 50°C, nhiệt độ mà chúng có hoạt động ồn định. Enzyme từ nắm sợi đa số là enzyme chịu nhiệt; tuy nhiên, chúng rất nhạy với chat ức chế galactose. B- galactosidase tinh sạch từ Aspergillus niger có giá trị K,, đối với lactose vào khoảng 85 đến 125 mmol/L, giá trị K,, với cơ chất 2-nitrophenyl B-D-galactopyranoside là 2.
Enzyme có hoạt tính ôn định khi nâng nhiệt độ phản ứng lên đến 60°C. Tuy nhiên, enzyme tinh sạch từ Beauveria bassiana có nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50°C và không ôn định ở nhiệt độ 60°C. Hầu hết enzyme sinh ra bởi nắm sợi là enzyme ngoại bảo, do đó chi phí sản xuất giảm di do không cần trải qua quá trình phá vỡ tế bào. Enzyme ngoại bào từ chủng nam sợi chịu nhiệt Rhizomucor sp.
cho thay nó chuyên biệt với cơ chat có chứa goc liên kết B-galactose. Gid tri Km Và Vmax của cơ chat 4- nitrophenyl B-D-galactopyranoside và 2-nitrophenyl B-D-galactopyranoside thấp hơn so với cơ chất lactose [46]. Enzyme từ nam men Nam men Kluyveromyces lactis là một nguồn thu nhận B-galactosidase thương mai rất quan trọng bởi vì chủng này phân bố tự nhiên trong môi trường sữa. Sản xuất B- galactosidase từ nam men được chú ý từ khi enzyme nay sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cho quá trình sản xuất sữa nghèo lactose.
Các chủng nam men lên men lactose tổng hợp B-galactosidase nội bao và đây là nguồn ezyme hiệu qua. Enzyme này nhờ vào hoạt tính thủy phân mạnh đã được ứng dụng trong quá trình thủy phân sữa. Enzyme có khoảng pH hoạt động tôi ưu từ pH 6,0 đến 7,0. Đây cũng chính là khoảng pH thường gặp ở sữa.