Khảo Sát Quá Trình Nhân Sinh Khối Vi Khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans

Khóa luận khảo sát quá trình nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans trong phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây họ cà.

• Tác giả: Nguyen Quang Hien
• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Ngọc Hà
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật
• Đề tài: Khảo Sát Quá Trình Nhân Sinh Khối Cấp II Và Tạo Dạng Chế Phẩm Của Vi Khuẩn Bacillus Subtilis Và Pantoea Agglomerans Phòng Trừ Bệnh Lở Cổ Rễ Trên Cây Họ Cà
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu tong quan về cây họ cà
• 1.2. Tổng quan bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà
• 1.2.1. Tác nhân gây bệnh
• 1.2.2. Triệu chứng bệnh
• 1.3. Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cổ rễ
• 1.3.1. Đặc điểm của nấm Rhizoctonia bicornis
• 1.3.2. Điều kiện phát triển và gây hại
• 1.3.3. Sự lan truyền và xâm nhiễm của nấm Rhizoctonia bicornis
• 1.4. Fusarium oxysporum gây bệnh lở cổ rễ
• 1.4.1. Đặc điểm của nấm Fusarium oxysporum
• 1.4.2. Điều kiện phát triển và gây hại
• 1.4.3. Sự lan truyền và xâm nhiễm của nấm Fusarium oxysporum
• 1.5. Pythium vexans gây bệnh lở cổ rễ
• 1.5.1. Đặc điểm của nấm Pythium vexans
• 1.5.2. Điều kiện gây hại và phổ kí chủ
• 1.6. Tổng quan về vi khuẩn đối kháng
• 1.6.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.6.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.6.1.2. Tính đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.6.1.3. Nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis
• 1.6.2. Vi khuẩn Pantoea agglomerans
• 1.6.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Pantoea agglomerans
• 1.6.2.2. Nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn Pantoea agglomerans
• 1.6.3. Tổng quan về khả năng tăng sinh khối của vi sinh vật
• 1.6.3.1. Môi trường và thời gian nuôi cấy
• 1.6.3.2. Các nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Dụng cụ, thiết bị máy móc
• 2.2. Mẫu nấm Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum và Pythium vexans
• 2.3. Môi trường và hóa chất
• 2.4. Đánh giá khả năng nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 2.4.1. Khảo sát môi trường và thời gian nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 2.4.2. Khảo sát điều kiện nhiệt độ nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 2.4.3. Khảo sát điều kiện pH nhân sinh khối cấp II thích hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 2.4.4. Khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 2.4.5. Đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2 trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nấm gây bệnh lở cổ rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 2.4.5.1. Đánh giá khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia bicornis chủng ODT02
• 2.4.5.2. Đánh giá khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum chủng KTDT01
• 2.4.5.3. Đánh giá khả năng đối kháng với nấm Pythium vexans chủng KTDT22
• 2.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả đánh giá khả năng tăng sinh khối cấp II của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT — ĐDI và Pantoea agglomerans chủng O — BT 1.2
• 3.1.1. Kết quả khảo sát môi trường và thời gian tăng sinh khối
• 3.1.2. Kết quả khảo sát điều kiện nhiệt độ tăng sinh khối
• 3.1.3. Kết quả khảo sát pH tăng sinh khối
• 3.1.4. Kết quả khảo sát nguyên liệu làm chất mang tạo chế phẩm dạng bột
• 3.1.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng trong chế phẩm sau thời gian tồn trữ với nấm gây bệnh lở cổ rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.1.5.1. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia bicornis
• 3.1.5.2. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum
• 3.1.5.3. Khả năng đối kháng với nấm Pythium vexans
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans

Nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà. Cây họ cà, bao gồm các loại như cà chua, khoai tây, và ớt, là nguồn thực phẩm quan trọng và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, bệnh lở cổ rễ do các tác nhân như Rhizoctonia bicornis và Fusarium oxysporum gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng cây trồng. Việc ứng dụng các vi khuẩn đối kháng như Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans có thể là giải pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh này.

1.1. Giới thiệu về cây họ cà và tầm quan trọng của chúng

Cây họ cà (Solanaceae) bao gồm nhiều loài quan trọng như cà chua, khoai tây, và ớt. Chúng không chỉ là nguồn thực phẩm mà còn có giá trị kinh tế lớn. Theo FAO, diện tích trồng cây họ cà trên toàn thế giới đạt khoảng 28 triệu ha, sản xuất ra khoảng 540 triệu tấn mỗi năm.

1.2. Bệnh lở cổ rễ và tác động của nó đến cây họ cà

Bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia sp. và Fusarium sp. gây ra, dẫn đến nhiều triệu chứng như thối gốc, thối thân, và chết cây. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng sản phẩm, gây thiệt hại lớn cho nông dân.

II. Thách thức trong việc phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

Việc phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà gặp nhiều thách thức do sự phát triển mạnh mẽ của các tác nhân gây bệnh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới. Sự tích lũy của nấm trong đất, cùng với việc sử dụng giống cây không sạch bệnh, đã tạo ra môi trường thuận lợi cho bệnh phát triển. Do đó, cần có các biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh này.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

Nhiệt độ, độ ẩm và điều kiện canh tác là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh lở cổ rễ. Nấm Rhizoctonia bicornis phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 28 đến 31°C, trong khi độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan của bệnh.

2.2. Tác động của biến đổi khí hậu đến bệnh lở cổ rễ

Biến đổi khí hậu có thể làm thay đổi điều kiện môi trường, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của các tác nhân gây bệnh. Sự gia tăng nhiệt độ và độ ẩm có thể tạo ra điều kiện lý tưởng cho nấm phát triển, làm gia tăng nguy cơ bùng phát bệnh lở cổ rễ.

III. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans. Việc xác định các yếu tố như nhiệt độ, pH, và thời gian nuôi cấy là rất quan trọng để đạt được mật độ vi khuẩn cao nhất, từ đó tạo ra chế phẩm có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh.

3.1. Điều kiện tối ưu cho việc nhân sinh khối

Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 35°C và pH 6.5, trong khi Pantoea agglomerans phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30°C và pH 7. Việc duy trì các điều kiện này là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc sản xuất chế phẩm.

3.2. Nguyên liệu làm chất mang cho chế phẩm

Cám gạo kết hợp với bột tale đã được xác định là chất mang hiệu quả nhất cho việc duy trì mật số vi khuẩn. Sự kết hợp này giúp bảo quản vi khuẩn trong thời gian dài mà không làm giảm khả năng đối kháng của chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu về khả năng đối kháng của chế phẩm

Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans có khả năng đối kháng cao đối với các tác nhân gây bệnh lở cổ rễ. Hiệu suất đối kháng của chế phẩm này đã được đánh giá qua nhiều thí nghiệm khác nhau, cho thấy tính khả thi trong việc ứng dụng thực tiễn.

4.1. Hiệu suất đối kháng của Bacillus subtilis

Chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT - DDI cho thấy hiệu suất đối kháng cao nhất là 64.83% đối với nấm Rhizoctonia bicornis. Điều này chứng tỏ khả năng của vi khuẩn trong việc kiểm soát bệnh lở cổ rễ.

4.2. Hiệu suất đối kháng của Pantoea agglomerans

Chế phẩm chứa vi khuẩn Pantoea agglomerans chủng O - BT 1.2 cũng cho thấy hiệu suất đối kháng 62.50% đối với Fusarium oxysporum và 58.06% đối với Pythium vexans. Kết quả này khẳng định tiềm năng của vi khuẩn trong việc phòng trừ bệnh hại trên cây họ cà.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans mở ra hướng đi mới trong việc phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà. Việc ứng dụng các chế phẩm sinh học không chỉ giúp kiểm soát bệnh hiệu quả mà còn bảo vệ môi trường. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng trong thực tiễn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu sinh học trong nông nghiệp

Nghiên cứu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng trừ bệnh an toàn và hiệu quả. Việc sử dụng vi khuẩn đối kháng như Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans là một trong những giải pháp bền vững cho nông nghiệp.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình sản xuất chế phẩm và đánh giá hiệu quả trong điều kiện thực tế. Việc mở rộng ứng dụng của các vi khuẩn đối kháng sẽ góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây họ cà (Solanaceae) là nhóm cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dưỡng quan trọng trên toàn thế giới, tiêu biểu là các loài như cà chua (Solanum lycopersicum L.), khoai tây (Solanum tuberosum L.), ớt (Capsicum annuum L.) và cà tím. Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) năm 2020, tổng diện tích canh tác cây họ cà toàn cầu đạt khoảng 28 triệu ha với sản lượng ước tính 540 triệu tấn, trong đó diện tích trồng khoai tây đạt 16.810 ha (sản lượng 359 nghìn tấn), cà chua đạt 5.983 ha (sản lượng 186 nghìn tấn) và ớt đạt 2.990 ha (sản lượng 36 nghìn tấn). Tại Việt Nam, cây họ cà được gieo trồng tập trung tại nhiều vùng chuyên canh, điển hình như tỉnh Lâm Đồng với quy mô trên 13.000 ha.

Tuy nhiên, tập quán canh tác thâm canh liên tục qua nhiều vụ làm tích tụ nguồn bệnh trong đất và nguồn nước tưới. Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các loài nấm đất có phổ ký chủ rộng phát sinh và gây hại nghiêm trọng, đặc biệt là bệnh lở cổ rễ. Tác nhân gây bệnh bao gồm các loài nấm nguy hiểm như Rhizoctonia bicornis, Fusarium oxysporum và Pythium vexans, gây nên hiện tượng chết rạp cây con, thối rễ, thối gốc thân và nghẽn bó mạch dẫn, dẫn đến thiệt hại nặng nề về năng suất.

Trước yêu cầu giảm thiểu thuốc bảo vệ thực vật hóa học nhằm bảo vệ môi trường sinh thái, biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật vùng rễ đối kháng như Bacillus subtilis và Pantoea agglomerans được xác định là giải pháp thay thế bền vững. Nhằm đưa các chủng vi khuẩn đối kháng vào sản xuất thực tế, việc tối ưu hóa điều kiện lên men nhân sinh khối cấp II với giá thành thấp và lựa chọn chất mang thích hợp để duy trì mật số cùng hiệu lực đối kháng sau tồn trữ là vấn đề cấp thiết.

Đề tài đặt ra các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá điều kiện nhân sinh khối cấp II tối ưu và tạo dạng chế phẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT – ĐD1 và Pantoea agglomerans chủng O – BT 1.2 nhằm phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà.
2. Nhiệm vụ/Yêu cầu nghiên cứu:
   • Xác định môi trường, thời gian, nhiệt độ và pH tối ưu để nhân sinh khối cấp II cho hai chủng vi khuẩn B. subtilis KT – ĐD1 và P. agglomerans O – BT 1.2.
   • Khảo sát các loại nguyên liệu chất mang (cám gạo, bột talc, biochar, humic) và đánh giá mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm dạng bột sau 7, 14 và 28 ngày tồn trữ.
   • Đánh giá khả năng và hiệu suất đối kháng của các chế phẩm sau 7, 14 và 28 ngày tồn trữ đối với 3 loài nấm gây bệnh lở cổ rễ (R. bicornis ODT02, F. oxysporum KTDT01 và P. vexans KTDT22) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng nghiên cứu: 2 chủng vi khuẩn đối kháng (Bacillus subtilis KT – ĐD1, Pantoea agglomerans O – BT 1.2); 3 chủng nấm gây bệnh (Rhizoctonia bicornis ODT02, Fusarium oxysporum KTDT01, Pythium vexans KTDT22); các nguồn cơ chất lên men và chất mang tồn trữ.
   • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
   • Phạm vi thời gian: Thực hiện từ tháng 02/2023 đến tháng 08/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết bệnh học thực vật và công nghệ vi sinh bảo vệ thực vật:

• Tác nhân nấm bệnh: Rhizoctonia bicornis phát triển hệ sợi nấm phân nhánh và hạch nấm tồn tại trong đất; Fusarium oxysporum (thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes) xâm nhiễm mạch xylem làm cản trở vận chuyển nước và tiết độc tố gây héo rũ, tồn tại lâu dài nhờ bào tử áo; Pythium vexans (lớp Oomycetes) sinh du động bào tử và bào tử noãn tấn công mạnh vào mô rễ non.
• Cơ chế đối kháng vi sinh vật: Vi khuẩn B. subtilis (Gram dương, hình que, có khả năng tạo nội bào tử bền nhiệt) sinh tổng hợp các peptide kháng sinh như surfactin, iturin A, bacilysin, polymyxin và tạo màng sinh học (biofilm); vi khuẩn P. agglomerans (Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae, khuẩn lạc màu vàng) sản sinh các hợp chất kháng sinh phổ rộng như herbicolin, pantocin, microcin, andrimid.
• Cơ chế bảo vệ của chất mang: Chất mang hữu cơ (cám gạo, humic) và vô cơ (bột talc $Mg_3Si_4O_{10}(OH)_2$, biochar) kết hợp phụ gia giúp duy trì độ ẩm, che chở cấu trúc tế bào, ổn định pH bằng $CaCO_3$ và gia tăng màng bảo vệ nhờ chất kết dính sinh học chitosan và carboxymethylcellulose (CMC).

Phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các bước:

• Phương pháp lên men và đo mật độ quang: Dịch huyền phù vi khuẩn cấp I được chuẩn hóa ở giá trị $OD_{600} = 0,3$, cấy chuyển vào môi trường lên men lỏng cấp II với tỷ lệ 1 mL khuẩn dịch/20 mL môi trường, nuôi lắc 150 vòng/phút trên máy lắc Stuart SSL1. Mật độ quang được xác định tại bước sóng 600 nm ($OD_{600}$) bằng máy đo quang phổ Nanovue Plus.
• Phương pháp tạo chế phẩm dạng bột: Phối trộn 1.000 g chất mang với 10 g CMC, 15 g $CaCO_3$ và 10% chitosan theo công thức cải tiến từ Vidhyasekaran và Muthamilan (1995). Hỗn hợp được chia đĩa (5 g/đĩa), hấp khử trùng 2 lần (cách nhau 24 giờ), phối trộn 2 mL dịch vi khuẩn ($OD_{600} = 0,3$), sấy ở 40°C trong 24 giờ và đóng gói túi zip bảo quản ở nhiệt độ phòng. Mật độ sống sót được kiểm tra định kỳ tại 7, 14 và 28 ngày sau tồn trữ (NSTT).
• Phương pháp cấy đối kháng kép (Dual culture test): Cấy đối kháng trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA) trong đĩa petri đường kính 80 mm theo phương pháp của Ferreira và ctv (1991). Dung dịch chế phẩm được quét 2 đường thẳng song song cách tâm đĩa 2,5 cm, đặt miếng thạch nấm bệnh (đường kính 5 mm) tại tâm.
• Chỉ tiêu và công thức tính toán:
  • Bán kính tản nấm trung bình: $r = (r_1 + r_2)/2$ (mm), đo định kỳ mỗi 24 giờ cho đến khi nghiệm thức đối chứng lan kín đĩa.
  • Hiệu suất đối kháng: $HSĐK (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$, trong đó $C$ là bán kính tản nấm đối chứng, $T$ là bán kính tản nấm ở nghiệm thức có vi khuẩn. Hiệu lực được đánh giá theo thang phân loại Soytong (1988).
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập, xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2019, phân tích phương sai (ANOVA) và trắc nghiệm phân hạng sự khác biệt trung bình bằng phần mềm SAS 9.2 ở mức ý nghĩa $p < 0,01$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về:

• Đặc điểm thực vật học, giá trị dinh dưỡng và tình hình sản xuất cây họ cà trên thế giới và tại Việt Nam.
• Triệu chứng học, đặc điểm hình thái và con đường lan truyền của ba loài nấm đất gây bệnh lở cổ rễ (R. bicornis, F. oxysporum, P. vexans).
• Đặc tính sinh học và hoạt tính đối kháng của vi khuẩn B. subtilis và P. agglomerans, tổng kết các hợp chất thứ cấp và enzyme phân giải vách tế bào nấm.
• Ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa (môi trường dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên, thời gian lên men, nhiệt độ, pH) đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật.
• Các dạng chất mang tồn trữ (cám gạo, bột talc, biochar, humic, phụ gia $CaCO_3$, CMC, chitosan) cùng các nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột nhằm duy trì mật số và hoạt lực đối kháng qua thời gian bảo quản.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hệ thống trang thiết bị thí nghiệm, hóa chất, môi trường nuôi cấy và thiết kế các sơ đồ thí nghiệm:

• Khảo sát nhân sinh khối cấp II theo mô hình hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD): Thí nghiệm 2 yếu tố đánh giá 5 loại môi trường (Bột bắp + mật rỉ đường, Cám gạo + mật rỉ đường, Khoai tây + mật rỉ đường, Cao nấm men + mật rỉ đường, Luria Broth - LB) tại 4 mốc thời gian (12, 24, 36, 48 giờ); Thí nghiệm đơn yếu tố khảo sát 3 mức nhiệt độ (25°C, 30°C, 35°C) và 4 mức pH (6; 6,5; 7; 7,5).
• Thí nghiệm đơn yếu tố khảo sát 7 công thức chất mang tạo chế phẩm dạng bột (Cám; Cám + talc; Humic; Humic + talc; Biochar; Biochar + talc; Talc, đều bổ sung 10% chitosan) qua các mốc 7, 14 và 28 NSTT.
• Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính đối kháng in vitro gồm 15 nghiệm thức (14 nghiệm thức chế phẩm vi khuẩn sau tồn trữ và 1 nghiệm thức đối chứng nấm bệnh), lặp lại 3 lần.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương 3 phân tích chi tiết các kết quả đạt được từ thực nghiệm:

• Tối ưu hóa quá trình nhân sinh khối cấp II:
  • Vi khuẩn B. subtilis KT – ĐD1 tăng sinh khối mạnh nhất trên môi trường cám gạo kết hợp mật rỉ đường tại thời điểm 36 giờ ($OD_{600} = 0,49$), đạt tối ưu ở nhiệt độ 35°C ($OD_{600} = 0,50$) và mức pH = 6,5 ($OD_{600} = 0,50$).
  • Vi khuẩn P. agglomerans O – BT 1.2 sinh trưởng tối ưu trên môi trường LB tại thời điểm 36 giờ ($OD_{600} = 0,51$), nhiệt độ tối ưu 30°C ($OD_{600} = 0,57$) và mức pH = 7,0 ($OD_{600} = 0,58$).
• Đánh giá khả năng duy trì mật số trong chất mang:
  • Công thức chất mang phối trộn Cám gạo + Bột talc (bổ sung chitosan) duy trì mật số tế bào vi khuẩn cao nhất và ổn định nhất qua 28 ngày bảo quản đối với cả hai chủng vi khuẩn. Tại mốc 28 NSTT, mật độ quang $OD_{600}$ của B. subtilis đạt 1,51 và P. agglomerans đạt 1,61, vượt trội so với các nghiệm thức đơn lẻ hoặc chất mang gốc humic/biochar.
• Đánh giá hiệu suất đối kháng nấm bệnh sau thời gian tồn trữ:
  • Đối với nấm Rhizoctonia bicornis chủng ODT02: Chế phẩm KT – Cám + talc duy trì hiệu lực ức chế cao nhất qua các mốc 7 NSTT (61,98%), 14 NSTT (63,38%) và đạt 64,83% tại 28 NSTT (bán kính tản nấm chỉ còn 14,07 mm so với đối chứng 40,00 mm).
  • Đối với nấm Fusarium oxysporum chủng KTDT01: Chế phẩm O – Cám + talc thể hiện khả năng đối kháng mạnh nhất với hiệu suất 61,11% (7 NSTT), 61,52% (14 NSTT) và 62,50% tại 28 NSTT (bán kính tản nấm 15,00 mm so với đối chứng 40,00 mm).
  • Đối với nấm Pythium vexans chủng KTDT22: Chế phẩm O – Cám + talc đạt hiệu suất đối kháng cao nhất tại 28 NSTT là 58,06%.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xác lập được bộ thông số kỹ thuật tối ưu phục vụ nhân sinh khối và sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột phòng trừ bệnh lở cổ rễ:

Chủng vi khuẩn đối kháng	Môi trường nhân cấp II tối ưu	Thời gian (giờ)	Nhiệt độ (°C)	pH tối ưu	Chất mang duy trì mật số tốt nhất (28 NSTT)	Hiệu suất đối kháng nấm bệnh cao nhất tại 28 NSTT (%)
Bacillus subtilis (KT – ĐD1)	Cám gạo + Mật rỉ đường	36	35	6,5	Cám + Bột talc ($OD_{600} = 1,51$)	64,83% (đối kháng R. bicornis ODT02)
Pantoea agglomerans (O – BT 1.2)	Luria Broth (LB)	36	30	7,0	Cám + Bột talc ($OD_{600} = 1,61$)	62,50% (đối kháng F. oxysporum KTDT01); 58,06% (đối kháng P. vexans KTDT22)

Các giải pháp và đóng góp khoa học chính của tác giả:

1. Tận dụng phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ: Đề tài đã chứng minh môi trường cám gạo kết hợp mật rỉ đường có thể thay thế các môi trường tổng hợp đắt tiền trong nhân sinh khối cấp II vi khuẩn B. subtilis, giúp hạ giá thành sản xuất chế phẩm vi sinh trên quy mô thực tế.
2. Xác lập công thức chất mang phối hợp ưu việt: Sự kết hợp giữa chất mang hữu cơ giàu dinh dưỡng (cám gạo) và khoáng chất bảo vệ (bột talc chứa Si, Mg) cùng phụ gia chitosan, CMC và $CaCO_3$ giúp duy trì sức sống của vi khuẩn đối kháng vượt trội hơn hẳn so với các chất mang đơn độc hoặc gốc than sinh học (biochar) và humic sau 28 ngày bảo quản.
3. Chứng minh hoạt lực đối kháng ổn định: Các chủng vi khuẩn sau khi đưa vào chất mang dạng bột và bảo quản 28 ngày vẫn giữ vững hiệu lực đối kháng cao ($> 58 - 64%$) trước 3 tác nhân nấm đất nguy hiểm gây bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Thử nghiệm đối kháng mới chỉ dừng lại ở phạm vi in vitro trên đĩa thạch trong phòng thí nghiệm; thời gian đánh giá khả năng tồn trữ của chế phẩm dạng bột mới giới hạn ở mốc 28 ngày sau bảo quản; phạm vi khảo sát vi sinh vật gây hại giới hạn trên 3 chủng nấm đại diện được cung cấp từ bộ môn.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Kéo dài thời gian theo dõi độ ổn định và mật độ sống sót của vi khuẩn trong chế phẩm lên các mốc 3 tháng, 6 tháng và 9 tháng tồn trữ.
  • Tiến hành khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh lở cổ rễ và khả năng kích thích sinh trưởng cây họ cà (cà chua, ớt) của các chế phẩm dạng bột trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng.
  • Nghiên cứu phối trộn đồng thời cả hai chủng B. subtilis KT – ĐD1 và P. agglomerans O – BT 1.2 trong cùng một công thức chế phẩm nhằm tạo phổ tác động phòng trừ đa nấm bệnh.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Sinh viên, học viên ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp: Tham khảo quy trình bố trí thí nghiệm vi sinh hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), phương pháp tối ưu hóa yếu tố lên men đa biến và kỹ thuật đánh giá đối kháng nấm bệnh kép (Dual culture).
• Cán bộ kỹ thuật và các đơn vị sản xuất chế phẩm sinh học: Ứng dụng trực tiếp công thức lên men cấp II từ cám gạo - mật rỉ đường và công thức phối trộn chất mang dạng bột (cám gạo + bột talc + phụ gia ổn định) nhằm thương mại hóa các dòng vi khuẩn đối kháng vùng rễ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường và điều kiện nhân sinh khối cấp II tối ưu cho vi khuẩn Bacillus subtilis chủng KT – ĐD1 là gì?
Vi khuẩn B. subtilis chủng KT – ĐD1 tăng sinh khối tối ưu trên môi trường Cám gạo kết hợp Mật rỉ đường (25 g cám gạo + 7 g mật rỉ đường/1.000 mL nước cất) ở thời gian nuôi cấy 36 giờ, nhiệt độ 35°C và độ pH = 6,5, đạt giá trị mật độ quang $OD_{600} = 0,50$.

2. Công thức chất mang nào cho hiệu quả bảo quản mật số vi khuẩn tốt nhất sau 28 ngày tồn trữ?
Công thức phối trộn Cám kết hợp Bột talc (tỷ lệ phối trộn cùng 10 g CMC, 15 g $CaCO_3$ và 10% chitosan) cho khả năng duy trì mật số cao nhất sau 28 ngày tồn trữ, đạt giá trị $OD_{600} = 1,51$ đối với B. subtilis KT – ĐD1 và $OD_{600} = 1,61$ đối với P. agglomerans O – BT 1.2.

3. Hiệu suất đối kháng nấm Rhizoctonia bicornis chủng ODT02 cao nhất đạt bao nhiêu sau 28 ngày bảo quản?
Chế phẩm Cám + Talc chứa vi khuẩn B. subtilis KT – ĐD1 tại thời điểm 28 ngày sau tồn trữ đạt hiệu suất đối kháng nấm R. bicornis ODT02 cao nhất là 64,83% với bán kính tản nấm thu hẹp còn 14,07 mm (so với đối chứng không xử lý là 40,00 mm).

4. Chế phẩm chứa Pantoea agglomerans chủng O – BT 1.2 ức chế các nấm bệnh Fusarium oxysporum và Pythium vexans với hiệu suất như thế nào?
Tại thời điểm 28 ngày sau tồn trữ, chế phẩm Cám + Talc chứa P. agglomerans O – BT 1.2 đạt hiệu suất đối kháng cao nhất đối với nấm F. oxysporum KTDT01 là 62,50% (bán kính tản nấm 15,00 mm) và đối với nấm P. vexans KTDT22 là 58,06%.

5. Quy trình phối chế phụ gia chất mang dạng bột trong đề tài được tiến hành như thế nào?
Hỗn hợp chất mang được phối chế theo công thức: 1.000 g chất mang + 10 g chất bám dính CMC + 15 g chất ổn định pH $CaCO_3$ + 10% chitosan; hấp tiệt trùng 2 lần (cách nhau 24 giờ), phối trộn với dịch vi khuẩn chuẩn độ ($OD_{600} = 0,3$), sấy khô ở 40°C trong 24 giờ và đóng gói túi zip ở nhiệt độ phòng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Quang Hiển đã khảo sát thành công điều kiện nhân sinh khối cấp II và tạo dạng chế phẩm dạng bột của hai chủng vi khuẩn đối kháng bản địa Bacillus subtilis KT – ĐD1 và Pantoea agglomerans O – BT 1.2. Đề tài chứng minh môi trường phụ phẩm nông nghiệp cám gạo - mật rỉ đường cùng chất mang phối hợp cám gạo - bột talc bổ sung chitosan giúp duy trì mật số tế bào vi khuẩn cao và ổn định sau 28 ngày tồn trữ. Các chế phẩm dạng bột được tạo ra thể hiện hiệu suất đối kháng in vitro đạt từ 58,06% đến 64,83% đối với ba loài nấm gây bệnh lở cổ rễ (R. bicornis, F. oxysporum, P. vexans), tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển thuốc trừ bệnh sinh học ứng dụng trong canh tác cây họ cà an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tong quan về cây họ cà Cây họ cà có tên danh pháp khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa. Tên khoa học của họ này có nguồn gốc từ tiếng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà dược”. Ở Việt Nam, họ cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bố rộng khắp cả nước. Một số loài được trồng dùng làm thực phẩm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoai tây), gia vị (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu.

Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Theo Somraj và ctv (2017), cà chua là một loại cây rau quan trọng, phô biến và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Theo tổ chức nông lương thé giới (FAO), năm 2020 diện tích trồng cà chua trên thế giới vào khoảng là 5.983 ha, với sản lượng 186. Là cây rau có giá trị, có san lượng chiếm 1/6 tông sản lượng rau hàng năm trên thê giới và luôn đứng ở vi trí sô 1 về sản lượng.

Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L. thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ. Khoai tây được trồng lâu đời ở Nam Mỹ và được đưa vào châu Âu từ thế kỉ 16. Ở nước ta, khoai tây được du nhập vào từ người Pháp từ đầu thế kỉ 19.

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO), năm 2020 diện tích trồng khoai tây trên thế giới vào khoảng 16.810 ha với sản lượng 359. Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ. Ở nước ta, cây ớt được du nhập từ Trung Quốc, An Độ. Theo tô chức nông lương thé giới (FAO) cây ớt được xem là cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới.

Năm 2020, diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng 2.990 ha với sản lượng 36.2 Tổng quan bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà 1.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh lở cô rễ cây họ cà do nam Rhizoctonia sp. gây ra là chủ yêu. Tuy nhiên, tùy điều kiện thời tiết, chế độ canh tác có thé do nhiều loại nam có trong đất gây ra như Fusarium sp.2 Triệu chứng bệnh Một sô triệu chứng bệnh lở cô rê đôi với cây ho cà như: chết rạp cây con, thôi rê, thối gốc, thối thân, thối quả. Chết Tạp cây con: cây con có thể bị hại trước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất.

Trước khi nay mầm, bệnh gây chết đỉnh sinh trưởng. Sau khi nảy mam, nam gây ra các vết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, phần thân non bị thắt lại, trở nên mềm, cây con bị đỗ gục và chết (Đã Tấn Dũng, 2013). Cây lớn cũng bị hại nhưng chủ yếu chỉ bị hại ở phần vỏ. Bệnh có thê xuất hiện gây hại ở cả cây trưởng thành gây hiện tượng thối rễ hoặc thối gốc thân khi điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho nam phát triển.

Ở gốc cây, triệu chứng ban đầu là vết lõm màu nâu hoặc hơi nâu đỏ sát mặt đất, vết bệnh có thê lan rộng quanh gốc thân và lan xuống rễ, gốc thân bị lở loét. Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất. Khi mới xuất hiện, nếu quan sát kỹ có thê thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bị rộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cô rễ hoặc gốc cây. Dần dần phần vỏ này khô teo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ âm cao sẽ bị thối nhũn, bong ra, cây sẽ héo dần và chết (Võ thị Thu Oanh, 2007).3 Rhizoctonia bicornis gây bệnh lở cỗ rễ 1.1 Đặc điểm của nắm Rhizoctonia bicornis Theo Đỗ Tan Dũng (2013), nam R.

bicornis có đặc điểm chung là: tản nắm phát triển ban đầu có màu vàng nâu, nâu vàng nhạt, về sau chuyển sang nâu sam. bicornis có 3 loại sợi nam: sợi nam bò (runner hyphae), sợi nam phân nhánh (lobate hyphae) va các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells). Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển của nam, nhiệt độ tối thích với sự phát triển của nắm là 28 — 31°C. Trong phòng thí nghiệm, nam R.

bicornis có thé mọc tốt trên môi trường PDA. Ở môi trường PDA nam sinh trưởng rất nhanh, sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nam lên đến 8,12 cm (Võ Thị Dung và ctv, 2017).2 Điều kiện phát triển và gây hại Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nắm có thể xảy ra là 23°C — 25°C, nhưng tối hảo nhất là 30°C — 32°C, âm độ từ 96 — 97%. Ở 32°C nắm xâm nhiễm trong vòng 18 giờ (Võ Thanh Hoàng, 1993). Ở nhiệt độ thấp dưới 10°C và cao hơn 38°C sợi nam ngừng phát triển.

Hach nam có thé chịu ngập trong 96 giờ mà không giảm sức sống nếu như giữ khô từ 24 — 168 giờ sau khi ngập (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tè, 1998). Nhiệt độ và độ âm là điều kiện cho bệnh phát triển và lây lan, biên độ nhiệt ngày đêm lên cao cũng có lợi cho bệnh phát triển. Theo Võ Thanh Hoàng (1993), bệnh xảy ra nặng ở ruộng bón nhiều phân đạm. Bón phân lân cao cũng làm tăng bệnh, trong khi bón nhiều kali sẽ giảm bệnh.

Natri có đặc tính ức chế sự phát triển của nắm. Do đó, vùng bị nhiễm mặn có hàm lượng natri trong dat cao, ít bị bệnh hơn so với vùng nước ngọt. Xr x A eX 2 AK + ° ° ° 1.3 Sự lan truyền va xâm nhiễm của nam Rhizoctonia bicornis =, Branchiny 9 = > ` ^”“—za = hos ——— Myce%al growth on surface othose Monitioia ceils v ariations of LQ PD sasiciospores We The ng 3N Wy Bastion Hình 1.1 Chu ki của nam Rhizoctonia sp. (Nguồn: APS, 2001) Nam được lan truyền chủ yếu thông qua hạch nắm, vét bệnh thực vật hoặc trong đất.

Nó được lây lan bởi gió, nước hoặc thông qua các hoạt động nông nghiệp như làm đất và vận chuyên hạt giống (Kareem và Hassan, 2018). Nắm có khả năng lan truyền theo 2 chiều: đứng hoặc ngang. Lan truyền theo chiều đứng chủ yếu là sợi nam, vết bệnh phát triển dần lên lá, chồi và các bộ phận khác. Bệnh lan truyền theo chiều ngang từ nơi này sang nơi khác bằng hạch nam va sợi nam, sự lan truyền chủ yếu nhờ dòng nước, hạch nắm bị nước cuốn đi gặp kí chủ thích hợp sẽ bám vào hay do nước mưa (Tô Thị Thùy Hương, 1993).4 Fusarium oxysporum gây bệnh lở cỗ rễ Ẩ 1.1 Đặc điểm của nam Fusarium oxysporum F.

oxysporum thuộc lớp nam bat toàn (Deuteromycetes), có khả năng gây nhiều loại bệnh trên những cây trồng khác nhau. Chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau, là nguyên nhân chính làm héo rũ. Hệ sợi nam lan tỏa khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ, sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình vận chuyên nước làm héo cây. Hệ sợi nắm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nam thường không mau, chuyền mau nâu khi già.

Hệ sợi nam sản sinh độc tố tiết vào hệ mach gây héo cây chủ. Cơ thé dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa. Trong một tê bao có một nhân hoặc nhiêu nhân, vách tê bao bang chitin, glucan. oxysporum có thê tồn tại trong đất dưới dang bào tử áo qua thời gian dài, bào tử áo có thé lưu ton trong đất từ 15 — 20 ngày.

Nhiệt độ thích hợp cho nam phát triển là 25°C — 30°C. Bệnh lây lan qua thân rễ, đất bị nhiễm bệnh và truyền qua giống, ngoài bệnh có thé lây lan qua nguồn nước và cơ giới F oxysporum thường tan công cây trồng dễ dàng khi bị thiếu ánh sáng. oxysporum phát trién nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25°C và hình thành tản nấm có hình thé tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nam có thé có màu trắng, kem, vàng, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím.

Mặt dưới nó có thé không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sam, hay mau nau (Seifert, 1996).2 Điều kiện phát triển và gây hại Phân bố khắp nơi trên thế giới, nhiệt độ tối ưu cho F. oxysporum phát triển là 27°C — 30°C, tối đa là 36°C — 40°C và tối thiểu là 7°C — 8°C, nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35°C (Ou, 1985). oxysporum sông phô bién trong đất, lưu tồn dưới dang bao tử áo hoặc khuẩn ty sông trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ. Một số loài tạo bào tử đính bay trong không khí, đây là nguyên nhân gây ra những bệnh trên thân, lá và bông (Burgess va ctv, 1994).

Các tác nhân gây bệnh héo F. oxysporum cũng có thé có mặt ở vỏ rễ một số cây không phải là ký chủ, kể cả cỏ dai va cây trồng. Bao tử hậu hình thành trong vỏ rễ khi cây chết. oxysporum tan công chủ yếu vào bộ rễ.

Đặc biệt, bệnh gây hai nặng nề trong điều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị ton thương.3 Sự lan truyền và xâm nhiễm của nam Fusarium oxysporum Sợi nắm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non và lan dan vào các mach xylem. Nam bệnh sau đó sẽ phát triển trong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thé san có màu nâu. Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dau hiéu dé nhan thay cua bénh héo khi cat ngang than.

Hién tuong tac mach xylem làm giảm lượng nước di chuyền lên cây, khiến cho cây bệnh bị héo rồi chết (Burgess và ctv, 2009).5 Pythium vexans gây bệnh lở cỗ rễ 1.1 Đặc điểm của nắm Pythium vexans Pythium vexans thuộc lớp Oomycetes, lớp nam này có những đặc trưng về hình thái và chu kỳ sống gần giống nắm thực. Tuy nhiên chúng được phân biệt rõ ràng với nam thực bởi di truyền học và cơ chế sinh sản của chúng (Erwin và ctv, 1996). Chúng sinh sản ra các sợi nam không vách ngăn, một đặc điểm chính dé phân biệt chúng với các nam chỉ khác. Đặc điểm của lớp nắm Oomycetes là sinh các du động bao tử qua sinh sản vô tính và sinh bào tử noãn thông qua sinh sản hữu tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007).