MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con ngƣời nhƣ enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhƣng chúng cũng gây ra những thiệt hại khôn lƣờng nhƣ tàn phá cây trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho ngƣời và động vật. Các nghiên cứu trên thế giới về nấm sợi đã bƣớc qua nhiều giai đoạn khác nhau từ những điều tra cơ bản sử dụng các phƣơng pháp truyền thống cho đến các nghiên cứu hiện đại ở mức độ gen và protein. Nhiều loài nấm có lợi đƣợc xếp vào diện an toàn đã đƣợc giải trình tự hệ gen hoàn toàn nhƣ Aspergillus niger và Penicillium chrysogenum.
Bên cạnh đó, hệ gen của nấm bệnh thực vật Penicillium digitatum cũng đã đƣợc giải trình và phân tích. Dữ liệu chi tiết về hệ gen của nấm sẽ giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát về các gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp các chất, cũng nhƣ các gen giữ những vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của nấm bệnh thực vật. niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất về mặt công nghiệp thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại enzym và axit hữu cơ.
Gần 99% lƣợng axit citric đƣợc sản xuất trên thế giới là nhờ A. Trong số những loài nấm đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp, P. chrysogenum nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh đầu tiên thuộc họ β-lactam đƣợc phát hiện bởi Alexander Fleming. chrysogenum tự nhiên đã đƣợc gây đột biến thành công để tạo ra các chủng công nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin rất cao.
Tuy nhiên, năng lực sinh tổng hợp các chất có lợi của các chủng phân lập từ tự nhiên thƣờng tƣơng đối thấp. Để nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên, các kỹ thuật về cải biến chỉnh sửa hệ gen thƣờng đƣợc áp dụng. Bên cạnh những loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, cũng có nhiều loài gây hại đặc biệt nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp. digitatum là tác nhân gây hỏng nhiều loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch.
Loài nấm này tồn 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tại phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Bên cạnh việc tấn công làm hỏng quả, gây tổn thất về kinh tế, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai do nấm sinh ra có thể gây nên những ảnh hƣởng tiêu cực đối với sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các gen liên quan đến gây bệnh ở vi nấm có thể góp phần tạo dựng nền tảng phục vụ phát triển các giải pháp hiệu quả nhằm kiểm soát các vi nấm gây hại. Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đã đƣợc phát triển nhƣ chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen bằng xung điện và chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện có nhiều hạn chế nhƣ kỹ thuật thực hiện phức tạp, chi phí cao và không ổn định. Trong khi đó, phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc chứng minh là hiệu quả và có tính ổn định cao. Nghiên cứu phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen mới với hiệu quả cao, chi phí thấp và có thể sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi là hết sức cần thiết.
Hệ thống chuyển gen là sự kết hợp giữa phƣơng pháp chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và các vector nhị thể mới đƣợc thiết lập sẽ hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền và điều tra vai trò của các gen quan trọng ở vi nấm. Từ những lý do trên, đề tài luận án đƣợc tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi”. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Tạo đƣợc các vector nhị thể mới và thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum.
- Điều tra đƣợc vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu đã thiết lập. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tạo các vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dƣỡng phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A. digitatum) sử dụng vi khuẩn A. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ƣu dựa trên cơ chế kháng kháng sinh và cơ chế trợ dƣỡng.
- Xóa, phục hồi, biểu hiện quá mức gen laeA và điều tra vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình đầu tiên phát triển đƣợc các hệ thống chuyển gen tối ƣu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các vector nhị thể mới để phục vụ cho nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Đề tài luận án cũng đã chứng minh hiệu quả của hệ thống vector nhị thể tạo đƣợc bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở ba loài nấm sợi khác nhau. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng cung cấp thêm các dữ liệu mới về vai trò của gen laeA trong điều hòa biệt hóa tế bào và trao đổi chất ở các loài nấm sợi nghiên cứu.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN * Đã tạo thành công 13 vector nhị thể mới dùng cho biểu hiện gen, xóa gen và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A. * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu. Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập ở nấm sợi A.
Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh ở P. digitatum đƣợc tối ƣu và hiệu quả chuyển gen đạt đƣợc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trƣớc đây. * Xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức thành công gen laeA ở ba loài nấm sợi A. digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trò hoàn toàn mới của gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất và kiểm soát khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum 1. Sơ lƣợc về chi nấm Aspergillus Chi Aspergillus là một trong những nhóm nấm mốc phổ biến và phân bố rộng rãi nhất trên hành tinh và đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp.
Năm 1729, nhà sinh học ngƣời Italia Pier Antonio Micheli đã quan sát cấu tạo cuống sinh bào tử của một số loài nấm và phát hiện chúng có chung đặc điểm hình thái giống nhƣ “bình nƣớc thánh”. Từ đó, ông đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20]. Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171] Về mặt hình thái, khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa dạng, khá đặc trƣng (Hình 1. Hệ sợi nấm có vách ngăn, có thể dài tới vài chục centimet.
Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi và có thể phân nhánh liên tiếp tạo ra hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì nhƣ bông. Trên môi trƣờng đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, có thể quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn lạc đặc trƣng. Khuẩn lạc thƣờng mang màu sắc của bào tử. Việc tạo màu sắc cũng là 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có khi chỉ xuất hiện ở khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nƣớc và khuếch tán ra môi trƣờng xung quanh [1].
Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu bằng phƣơng thức hình thành bào tử vô tính. Trong số 250 loài thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chƣa phát hiện có giai đoạn sinh sản hữu tính. Các loài đƣợc biết có sinh sản hữu tính ít gây bệnh cho con ngƣời hơn những loài chỉ đƣợc phát hiện sinh sản nhờ bào tử vô tính [61]. Chi Aspergillus đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công nghiệp.
Trong công nghệ sinh học, một số loài thuộc chi Aspergillus đã và đang đƣợc sử dụng: A. oryzae trong sản xuất thực phẩm và enzym. Tuy nhiên, bên cạnh đó, các loài thuộc chi này cũng gây một số bệnh nhất định cho vật nuôi và động vật hoang dã. Khả năng phát tán bào tử mạnh mẽ của một vài đại diện trong không khí, nƣớc, hạt sấy khô và nguyên liệu thực vật khiến chúng thƣờng xuyên có cơ hội tiếp xúc với động vật.
Chúng có thể gây nhiễm trùng cũng nhƣ nhiễm độc. Một số độc tố đáng lƣu ý ở Aspergillus là aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin, patulin…[21]. Trong chi Aspergillus, A. niger là loài nấm đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Nấm Aspergillus niger 1. Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm A. niger Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất trong khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus. niger đƣợc mô tả vào năm 1867 trong bản thảo “physiologie des mucédinées” bởi nhà thực vật học ngƣời Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem.
Ông phân lập loài nấm này với mục đích nghiên cứu việc sản xuất axit gallic từ quá trình lên men của nấm. Khi đó, ông phân lập đƣợc Penicillium glaucum và Aspergillus sp. có bào tử tƣơng tự Aspergillus glaucus nhƣng có màu đen trên các môi trƣờng khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên nó là A.
niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nigri, còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen. Trong phân nhóm này còn có 14 loài khác cũng có bào tử màu đen, rất dễ nhầm lẫn với A. Khuẩn lạc của nấm A. niger có màu trắng hoặc vàng, bị che khuất bởi màu đen của bào tử sinh sản vô tính mọc trên bề mặt.
Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn và trong suốt (Hình 1. Bào tử đính thƣờng dài từ 900-1600 µm và chứa các bọng bào tử dài khoảng 40-60 µm [46]. Hình ảnh hiển vi của A. niger có khả năng sinh trƣởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C.
Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C là khoảng mà loài nấm này phát triển mạnh mẽ nhất.