Đặt vấn đề Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế các tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng các giống lúa biến đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm. Một số các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi gen như: Daisuke Tokuhara và cộng sự đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [7]; nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]; Phan Tố Phượng và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A. Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc khả năng xâm nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ khoảng 11%). Ngoài ra, các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt được không thực sự cao.
Hơn thế nữa, giống lúa Việt Nam còn có những hạn chế như: chịu hạn kém, hạt ngắn đem lại năng suất và chất lượng kém. Sử dụng một số phương pháp tạo giống mới như: Chỉnh sửa vector, dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến, lai tạo chọn giống truyền thống,… còn tồn đọng một số hạn chế nhất định. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến. tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế.
Thách thức đặt ra không riêng gì Việt Nam mà là vấn đề chung của các quốc gia trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp là phải tạo ra nguồn lương thực lớn mà chỉ sản xuất và canh tác trên một diện tích không thay đổi và có nguy cơ bị thu hẹp. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm m 2 tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người. Vì vậy phương pháp chuẩn gen bằng vi khuẩn Agrobacterium bằng nuôi cấy phôi non biến nạp gen vào lúa đang được nghiên cứu giải pháp mới trong chọn tạo các giống lúa.
Giải pháp sử dụng các kĩ thuật chuyển gen để cải tạo giống lúa mới có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao hơn, hạt dài hơn, năng suất và hiệu quả cao. Hơn thế nữa, quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium có những ưu điểm như: gen ít bị đào thải; số lượng bản sao ít hơn do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau; tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó. Tuy nhiên vẫn còn một số những hạn chế như: có phổ tấn công giới hạn; gây khối u cho cây hai lá mầm ( do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hóa nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm…) [10]. Do vậy, tôi tiếp tục nghiên cứu về quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Với mục tiêu góp phần trong nghiên cứu tạo giống lúa có kích thước hạt dài, đáp ứng nhu cầu thị trường gạo thế giới, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7”.2 Mục tiêu của đề tài 1.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen - Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen. - Xây dựng quy trình chuyển gene tối ưu cho giống lúa Việt Nam.3 Ý nghĩa khoa học - Xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của hai giống lúa Việt Nam là J02 và Bắc Thơm số 7. - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm.
- Đề tài hoàn thiện quy trình chuyển gene trên hai giống lúa J02 và Bắc thơm số 7 góp phần tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chuyển gene vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 Việt Nam, phục vụ công tác cải tạo năng xuất, chất lượng giống lúa Việt Nam. m 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây lúa 2.1 Vai trò của lúa gạo Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn là năng lượng.
Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính.
Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi [6].
Như vậy bên cạnh sự thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, hơn hẳn Việt Nam (thứ 2) cả về số lượng và giá trị, do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa Giá trị kinh tế Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%.
Sản lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong những năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng lên [7]. Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày.
Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nước 11%. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu như: lizin, triptophan, threonin. chất lượng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống.
Do thành phần các chất dinh dưỡng tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chất lượng dinh dưỡng của lúa Theo Yoshida (1981) [12], tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80% trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin. Hàm lượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng. Hàm lượng amylose càng thấp thì cơm càng mềm.
Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tương quan nghịch với hàm lượng đạm. Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường giảm. Liều lượng phân bón thích hợp không những làm giảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột. Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượng này càng thấp thì cơm càng mềm dẻo.
Các giống lúa nếp thường có hàm lượng m 6 amylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn. Các giống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộc nhóm Indica. Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo. Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ có màu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo.
Vì vậy, hướng nghiên cứu trong thời gian tới là phải dung hòa được cả hai yếu tố tỷ lệ trắng trong và độ dẻo [4].