Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Từ Hải Miên Vùng Biển Hà Tiên

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1. Mục tiêu đề tài

1.1.1. Mục tiêu tổng quát

1.1.2. Mục tiêu cụ thể

1.2. Đối tượng nghiên cứu

1.3. Phạm vi nghiên cứu

1.4. Nội dung nghiên cứu

1.5. Đóng góp mới của luận án

1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

1.6.1. Ý nghĩa khoa học

1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn

2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Phân loại khoa học và phân bố

2.2. Đặc điểm cấu tạo

2.3. Đặc điểm sinh sản, sinh trưởng và phát triển của hải miên

2.3.1. Sự sinh sản vô tính

2.3.2. Sự sinh sản hữu tính

2.4. Đa dạng VSV sống cùng với hải miên

2.4.1. Vi khuẩn liên kết với hải miên

2.4.2. Nấm và tảo liên kết với hải miên

2.4.3. VKS liên kết với hải miên

2.4.4. Cổ vi khuẩn (Archaea) liên kết với hải miên

2.5. Vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) (Actinobacteria)

2.5.1. Phân bố của VKS trong tự nhiên

2.5.2. Đặc điểm sinh học của VKS

2.5.3. Sự hình thành của bào tử VKS

2.5.4. Các phương pháp nuôi cấy để thu nhận kháng sinh ở VKS

2.6. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ VKS

2.6.1. Khái quát về các con đường sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học

2.6.2. Phân loại các kháng sinh từ VKS

2.6.3. Những hợp chất có hoạt tính sinh học hình thành từ VKS

2.6.4. Một số nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn tiêu biểu từ VKS Streptomyces sp. có nguồn gốc từ biển

2.7. Một số VSV gây bệnh

2.7.1. Vi khuẩn Bacillus cereus

2.7.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.7.3. Vi khuẩn Escherichia coli

2.7.4. Vi khuẩn Salmonella

2.7.5. Nấm Candida albicans

2.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2. Phương tiện nghiên cứu

3.2.1. Nguyên vật liệu

3.2.2. Thiết bị - dụng cụ

3.2.3. Hóa chất - môi trường

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Thu thập và xử lý mẫu

3.3.2. Phân lập và nuôi cấy VKS

3.3.2.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.3.2.2. Sơ đồ quy trình phân lập VKS từ hải miên

3.3.2.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.4. Các chỉ tiêu theo dõi

3.5. Đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.5.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.5.2. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn

3.5.3. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.5.4. Chỉ tiêu theo dõi

3.6. Phân tích kết quả

3.7. Nhận diện VKS bằng phương pháp sinh học phân tử

3.7.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.7.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.7.3. Phân tích kết quả

3.8. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS

3.8.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.8.2. Các bước tiến hành thí nghiệm

3.8.3. Phân tích kết quả

3.9. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tiềm năng được tuyển chọn

3.9.1. Mục tiêu thí nghiệm

3.9.2. Chuẩn bị dịch nuôi cấy VKS

3.9.3. Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy VKS với ethyl acetate

3.9.4. Phương pháp sắc ký cột

3.9.5. Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

3.9.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC -MS)

4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Các dòng VKS phân lập được từ hải miên

4.1.1. Số lượng, nguồn gốc các dòng VKS phân lập được

4.1.2. Đặc điểm các dòng VKS phân lập được

4.1.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng VKS phân lập được

4.1.2.2. Đặc điểm tế bào của các dòng VKS phân lập được

4.2. Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS phân lập được

4.3. Tuyển chọn và định danh các dòng VKS phân lập được

4.4. Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng VKS

4.5. Chất kháng khuẩn được sinh ra từ VKS

4.5.1. Chất kháng khuẩn từ S

4.5.1.1. Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

4.5.1.2. Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)

4.5.2. Chất kháng khuẩn từ M

5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1: Một số hình của thí nghiệm

1. Hình ảnh thu mẫu hải miên

2. Hình một số mẫu hải miên thu tại các địa điểm

Phụ lục 2: Ký hiệu, nguồn gốc các dòng VKS phân lập

Phụ lục 3: Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của các dòng VKS

Phụ lục 4: Kết quả đo vòng kháng khuẩn của các dòng VKS đối với các VSV thử nghiệm (mm)

Phụ lục 5: Kết quả định danh 23 VKS tuyển chọn

5.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp ix mồi SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19 của 23 dòng VKS tuyển chọn

5.2. Trình tự đoạn gen và kết quả so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của 23 dòng VKS được tuyển chọn

5.3. Kết quả định danh của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 6: Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở 23 dòng VKS tuyển chọn

6.1. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A3F/A7R nhân bản cho gen NRPS (700–800 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.2. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi K1F/M6R nhân bản cho gen PKS-I (1.400 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

6.3. Phổ điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR nhân bản cho gen PKS-II (600 bp) của 23 dòng VKS tuyển chọn

Phụ lục 7: Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của chất được tinh sạnh từ S

7.1. Phổ MS của hợp chất ND1.7a

7.2. Phổ proton của hợp chất ND1.7a

7.3. Phổ carbon 13 của hợp chất ND1.7a

7.4. Phổ DEPT của hợp chất ND1.7a

7.5. Phổ HSQC của hợp chất ND1.7a

7.6. Phổ HMBC của hợp chất ND1.7a

Phụ lục 8 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS S

8.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn hexane -acetone

8.2. Phổ MS hợp chất 2 -Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl ở phút 4,64

8.3. Phổ MS hợp chất cyclohexasiloxane, dodecamethyl ở phút 13,15

8.4. Phổ MS hợp chất cycloheptasiloxane, tetradecamethyl ở phút

8.5. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS S.7a phân đoạn acetone -methanol

8.6. Phổ MS hợp chất oxime-, methoxy-phenyl ở phút 5,09

8.7. Phổ MS hợp chất hexanedioic acid, bis(2-ethylhexyl) ester ở phút 30,82

8.8. Phổ MS hợp chất diisooctyl phthalate ở phút 33,07

Phụ lục 9 : Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC -MS) các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.1. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.2. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.3. Phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

9.4. Phổ GC-MS của dung môi acetone

9.5. Bảng tổng hợp kết quả giải phổ GC-MS các chất chiết xuất từ dòng VKS M

Phụ lục 10: Kết quả phân tích thống kê

10.1. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của các dòng VKS phân lập với các VSV thử nghiệm

10.2. Kết quả phân tích thống kê khả năng kháng của 23 dòng VKS được tuyển chọn với các VSV thử nghiệm

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Từ Hải Miên

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Hải miên không chỉ là một phần của hệ sinh thái biển mà còn là nguồn tài nguyên quý giá cho việc tìm kiếm các hợp chất sinh học mới. Vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất kháng vi sinh vật, mở ra cơ hội cho việc phát triển dược phẩm mới.

1.1. Đặc Điểm Sinh Thái Của Hải Miên Tại Vùng Biển Hà Tiên

Hải miên tại vùng biển Hà Tiên có sự đa dạng sinh học phong phú. Môi trường biển nơi đây cung cấp điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của vi khuẩn sợi. Các yếu tố như nhiệt độ, độ mặn và ánh sáng ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài vi khuẩn này.

1.2. Vai Trò Của Vi Khuẩn Sợi Trong Hệ Sinh Thái Biển

Vi khuẩn sợi đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ và tái chế dinh dưỡng trong hệ sinh thái biển. Chúng cũng có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn, giúp bảo vệ hải miên khỏi các tác nhân gây bệnh.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi

Mặc dù nghiên cứu phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên mang lại nhiều tiềm năng, nhưng cũng gặp phải nhiều thách thức. Việc xác định và phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi sinh vật là một nhiệm vụ không dễ dàng.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Các Dòng Vi Khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên thường gặp khó khăn do sự đa dạng và sự cạnh tranh giữa các loài vi khuẩn. Việc sử dụng các phương pháp nuôi cấy phù hợp là rất cần thiết để thu được các dòng vi khuẩn mong muốn.

2.2. Vấn Đề Về Đánh Giá Khả Năng Kháng Vi Sinh Vật

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các dòng vi khuẩn sợi là một thách thức lớn. Cần có các phương pháp thử nghiệm chính xác để xác định mức độ kháng của từng dòng vi khuẩn đối với các vi sinh vật gây bệnh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Phân Lập Vi Khuẩn Sợi Từ Hải Miên

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả. Các phương pháp này bao gồm thu thập mẫu, nuôi cấy và phân tích gen.

3.1. Quy Trình Thu Thập Mẫu Hải Miên

Quy trình thu thập mẫu hải miên được thực hiện tại các địa điểm khác nhau trong vùng biển Hà Tiên. Mẫu được bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn.

3.2. Phương Pháp Nuôi Cấy Vi Khuẩn Sợi

Các mẫu hải miên được nuôi cấy trên môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn sợi. Sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc biệt giúp tối ưu hóa sự phát triển của các dòng vi khuẩn mong muốn.

3.3. Phân Tích Gen Để Định Danh Vi Khuẩn

Phân tích gen là bước quan trọng trong việc định danh các dòng vi khuẩn sợi. Phương pháp giải trình tự gen giúp xác định các loài vi khuẩn và khả năng sản xuất hợp chất sinh học của chúng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được nhiều dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi sinh vật. Những dòng vi khuẩn này có tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghiệp dược phẩm.

4.1. Các Dòng Vi Khuẩn Sợi Được Phân Lập

Nghiên cứu đã phân lập được 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên, trong đó có 130 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật được thử nghiệm.

4.2. Hợp Chất Sinh Học Kháng Vi Sinh Vật

Các dòng vi khuẩn sợi được phân lập đã sản xuất nhiều hợp chất sinh học có hoạt tính kháng vi sinh vật. Những hợp chất này có thể được phát triển thành các loại thuốc mới.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Khuẩn Sợi

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học mới. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và bảo vệ sức khỏe con người.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Vi Khuẩn Sợi

Nghiên cứu vi khuẩn sợi từ hải miên không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái biển mà còn cung cấp nguồn tài nguyên quý giá cho ngành dược phẩm.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khai thác và phát triển các hợp chất sinh học từ vi khuẩn sợi, nhằm tìm ra các loại thuốc mới có hiệu quả cao trong điều trị bệnh.

Phân Lập, Tuyển Chọn Vi Khuẩn Sợi (Actinobacteria) Từ Hải Miên Vùng Biển Hà Tiên