Đặt vấn đề Vi sinh vật (VSV) là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh penicillin giúp chữa được nhiều bệnh gây ra do VSV, mở ra con đường mới cho y học. Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại, tác dụng trực tiếp lên vi khuẩn để tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch của con người chống lại quá trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al. Ngoài ra, kháng sinh còn đóng vai trò rất quan trọng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al.
Tuy nhiên, có một vấn đề ngày càng phổ biến, đó là sự xuất hiện của các VSV kháng kháng sinh. Chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm khuẩn: thương hàn, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết mổ. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt cá c kháng sinh mới làm cho con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh”. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: cải tiến các kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu để tìm r a các kháng sinh mới (Alanis, 2005).
Trong số các VSV có khả năng sinh kháng sinh thì VKS (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ VKS, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Aslan, 1999). Tuy nhiên, việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loài VKS từ các nguồn đặc biệt khác để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al. Trong xu hướng này, các loài VKS hiếm phân lập từ biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, thuốc bảo vệ thực vật …Trong đó, nhóm VKS cộng sinh với hải miên được nhiều nhà khoa học quan tâm (Asha Devi et al. Trong các nhóm vi khuẩn sống cùng với hải miên, nhóm vi khuẩn Lam (cyanobacteria) làm nhiệm vụ quang tổng hợp để cung cấp năng lượng cho hải miên còn có những nhóm vi khuẩn khác phân hủy chất thải (Beer & Ilan, 1998), ổn định bộ khung của hải miên và sản xuất sản phẩm thứ cấp.
Chính các sản phẩm thứ cấp chính là những chất kháng vi khuẩn (antibacterial), kháng nấm (antifungal) và những hoạt động khác để giúp cho hải miên tự bảo vệ mình , vì hải miên có cấu trúc tương tự động vật bậc cao và chỉ thiếu hệ thống miễn dịch. Vi khuẩn cộng sinh với hải miên tạo ra nhiều sản phẩm thứ cấp hay còn gọi là sản phẩm thiên nhiên giữ vai trò quan trọng 1 trong việc phát triển dược phẩm góp phần để trị bệnh cho con người (Schmit t et al. Ở Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu về VKS cộng sinh với hải miên được công bố chỉ có công trình của Phạm Việt Cường et al., (2014) đã tuyển chọn được 11 chủng xạ khuẩn từ hải miên ở vùng biển Hải Vân – Sơn Chà, có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh. Vùng biển Hà Tiên là vùng biển bao gồm nhiều đảo lớn nhỏ, tiếp cận vịnh Thái Lan, nơi có nguồn nước biển sạch, trong, nông và ấm nên có nhiều loài sinh vật sống rất phong phú trong đó có nhiều loài hải miên.
Nhóm sinh vật này sẽ là nguồn lợi không những về tài nguyên biển mà còn là nguồn sinh vật biển chứa nhiều VSV cộng sinh sản xuất chất có hoạt tính sinh học, trong đó có nhóm VKS, góp phần mang lại lợi ích về những kháng sinh mới phục vụ cho y học, nuôi trồng thuỷ sản, chăn nuôi gia súc, gia cầm, tuy nhiên công trình nghiên cứu về nhóm VKS này hiện còn khá hạn chế. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” được tiến hành nhằm góp phần làm phong phú các sản phẩm có giá trị cao khai thác từ nguồn tài nguyên biển phục vụ cho cuộc sống và có thể ứng dụng trong y học.2 Mục tiêu đề tà i 1.1 Mục tiêu tổng quát Phân lập và tuyển chọn được những dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập được các dòng VKS từ hải miên tại vùng biển Hà Tiên, đồng thời đánh giá khả năng kháng của các dòng VKS này đối với các VSV thử nghiệm. Tuyển chọn và định danh được các dòng VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Tuyển chọn từ một đến hai dòng VKS có tiềm năng nhất, có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng được nhiều loại VSV với mức độ kháng cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ VKS tuyển chọn.3 Đối tượng nghiên cứu Các dòng VKS phân lập được từ hải miên thu thập tại các địa điểm thuộc vùng biển Hà Tiên.4 Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu về khả năng kháng một số VSV gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và Candida albicans của các dòng VKS phân lập từ hải miên.
Tuyển chọn và định danh các VKS có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời đánh giá mối liên hệ di truyền và khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất bởi dòng VKS tiềm năng nhất.5 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập VKS từ hải miên ở vùng biể n Hà Tiên. Nội dung 2: Đánh giá và tuyển chọn các dòng VKS có khả năng kháng với VSV gây bệnh thử nghiệm gồm B. albicans, và có khả năng sản xuất hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao.
Nội dung 3: Nhận diện và khảo sát mối liên hệ di truyền các dòng VKS tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Nội dung 4: Khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng VKS tuyển chọn. Nội d ung 5: Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học của dòng VKS tiềm năng nhất.6 Đóng góp mới của luận án Đã phân lập được 198 dòng VKS từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, trong đó 130/198 dòng có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài VSV được thử nghiệm gồm B. Đã tuyển chọn và định danh được 23 dòng VKS có khả năng kháng ít nhất hai dòng VSV chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kh áng mạnh.
Các dòng VKS tuyển chọn thuộc bốn họ bao gồm họ Actinomycetaceae (với chi Streptomyces có 15 loài), họ Microbacteriaceae (với hai loài Microbacterium tumbae), họ Nocardiaceae (với chi Rhodococcus có năm loài) và họ Gordoniaceae (với một loài là Gordonia bronchialis). Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm PKS-I là 69,6%, PKS-II là 60,9% và NRPS là 47,8%. 3 Đã nhận diện được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ S.7a được xác định, gồm có: thymine; 2- Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxy-phenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy- 1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12- dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’-heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)- 2,4,4,6,6,8,8,10.10-nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester.
Kết quả của đề tài về các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các VSV cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. Đây cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên về VKS trong hải miên ở vùng biển Hà Tiên.7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 1.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học về các nhóm VKS sống cộng sinh với hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của luận án có thể được sử dụng như là nguồn tài liệu tham khảo trong giảng dạy cũng như cho sinh viên bậc đại học và sau đại họ c tại cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này.2 Ý nghĩa thực tiễn Các dòng VKS có hoạt tính kháng khuẩn cao được phân lập từ hải miên là nguồn vật liệu có thể sử dụng phục vụ cho nghiên cứu tinh sạch, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ứng dụng trong việc điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe cho con người. 4 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại khoa học và phân bố Hải miên (bọt biển, sponges) có khoảng 8.000 loài, chiếm cứ hầu hết các vùng nước trên trái đất, từ những hồ nước ngọt tới các vùng biển nhiệt đới, không trừ cả những vùng lạnh giá ở bắc cực, chia thành bốn lớp Hexactinellida, Calcarea, Demospongiae và Homoscleromorpha.
Một vài loài hải miên thường gặp như Petromica citrina, Amphimedon viridis, Desmapsamma anchorata, Polymastia janeirensis, Aplysina fulva, Mycale angulosa, Hymeniacidon heliophila, Dysidea etheria, Tethya rubra và Tethya maza, Aplysina fulva, Chondrosia collectrix, Petromica citrina, Polymastia janeirensis, Tedania ignis, Hyrtioserecta, Amphimedonchloros,… Cơ thể hải miên có kích thước biến động rất lớn từ 3 - 10 mm đến 1,5 – 2 m (Ereskovsky, 2010). Nhưng Hooper & van Soest (2002) cho rằng hải miên chỉ là ngành sinh vật biển gồm khoảng hơn 15.000 loài chia thành ba lớp là Hexactinellida, Calcarea và Demospongiae.