Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần nấm bệnh và vi khuẩn Pantoea stewartii gây héo rũ cây ngô

Bài viết phân tích thành phần nấm bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ trên cây ngô từ hạt giống nhập khẩu Thái Lan.

• Tác giả: Dương Thị Thủy Tiên
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Thu Hương
• Trường học: Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xác định thành phần nấm bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan
• Loại tài liệu: đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. Đồ án tốt nghiệp
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích và yêu cầu
• 1.2.1. Mục đích
• 1.2.2. Yêu cầu
• 2. NỘI DUNG
• 3. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NGÔ VÀ BỆNH CÂY NGÔ
• 3.1. Giới thiệu về cây ngô
• 3.1.1. Nguồn gốc và phân loại
• 3.1.2. Đặc điểm thực vật
• 3.1.3. Kỹ thuật canh tác
• 3.1.3.1. Giống
• 3.1.3.2. Thời vụ
• 3.1.3.3. Đất
• 3.1.3.4. Khoảng cách và mật độ trồng
• 3.1.3.5. Chăm sóc ngô
• 3.1.3.6. Tưới nước
• 3.1.3.7. Phòng trừ sâu bệnh
• 3.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về ngô và bệnh cây ngô

Phần này cung cấp cái nhìn tổng quan về cây ngô, bao gồm nguồn gốc, phân loại, và các đặc điểm thực vật. Nấm bệnh và vi khuẩn Pantoea stewartii được đề cập như những tác nhân gây bệnh chính trên cây ngô. Tài liệu cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc nghiên cứu các bệnh này để đảm bảo an ninh lương thực.

1.1. Giới thiệu về cây ngô

Cây ngô có nguồn gốc từ Trung Mỹ và đã được thuần dưỡng từ hàng nghìn năm trước. Hạt giống ngô là một trong những yếu tố quan trọng quyết định năng suất và chất lượng cây trồng. Tài liệu cũng đề cập đến các bệnh thường gặp trên cây ngô, bao gồm bệnh nấm và bệnh do vi khuẩn Pantoea stewartii.

1.2. Bệnh thường gặp trên cây ngô

Các bệnh phổ biến trên cây ngô bao gồm bệnh nấm như khô vằn, rỉ sắt, và bệnh héo rũ do vi khuẩn Pantoea stewartii. Những bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn gây thiệt hại kinh tế lớn cho người trồng ngô.

II. Nghiên cứu nấm bệnh và vi khuẩn Pantoea stewartii

Phần này tập trung vào việc nghiên cứu nấm và nghiên cứu vi khuẩn trên hạt giống ngô Thái Lan. Mục tiêu chính là xác định thành phần bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR để giám định vi khuẩn Pantoea stewartii và phân lập các loại nấm bệnh trên hạt giống ngô. Các mẫu hạt giống được thu thập và phân tích trong phòng thí nghiệm để xác định các tác nhân gây bệnh.

2.2. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều loại nấm bệnh trên hạt giống ngô Thái Lan, bao gồm Aspergillus spp. và Fusarium sp. Vi khuẩn Pantoea stewartii cũng được phát hiện với tỷ lệ cao, gây ra bệnh héo rũ trên cây ngô.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát và phòng ngừa các bệnh trên cây ngô. Việc xác định sớm các tác nhân gây bệnh như nấm bệnh và vi khuẩn Pantoea stewartii giúp giảm thiểu thiệt hại và nâng cao năng suất ngô.

3.1. Ứng dụng trong nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để cải thiện quy trình xử lý hạt giống ngô, đặc biệt là các giống nhập khẩu từ Thái Lan. Điều này giúp ngăn chặn sự lây lan của bệnh nấm và bệnh do vi khuẩn trong quá trình canh tác.

3.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp giám định nhanh và hiệu quả hơn đối với nấm bệnh và vi khuẩn Pantoea stewartii. Điều này sẽ góp phần đảm bảo an ninh lương thực và phát triển bền vững ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp toàn cầu, cây ngô (Zea mays L.) giữ vị trí là một trong năm cây lương thực chính bên cạnh lúa nước, lúa mì, sắn và khoai tây. Cây ngô đóng vai trò chủ lực trong việc bảo đảm an ninh lương thực và tạo nguồn thu nhập cho nông dân tại nhiều quốc gia đang phát triển thuộc khu vực Châu Phi và Mỹ Latin. Tuy nhiên, song song với quá trình thâm canh tăng năng suất, sự lây lan của các loài sâu bệnh hại nguy hiểm qua đường hạt giống thương phẩm đang tạo ra những rủi ro lớn cho nền nông nghiệp. Việc phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong hạt giống trước khi gieo trồng là biện pháp then chốt để ngăn chặn dịch bệnh bùng phát trên diện rộng.

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa nước. Dù diện tích gieo trồng ngô lai chiếm trên 90% cơ cấu sản xuất và đạt sản lượng đáng kể, ngành nông nghiệp trong nước vẫn phải nhập khẩu một lượng lớn hạt giống và ngô thương phẩm từ các thị trường quốc tế. Thống kê của Tổng cục Hải quan trong ba tháng đầu năm 2013 cho thấy Việt Nam đã nhập khẩu 410,2 nghìn tấn ngô (trị giá 142,1 triệu USD), trong đó thị trường Thái Lan có tốc độ tăng trưởng mạnh nhất (tăng 128,24% về lượng so với cùng kỳ năm 2012). Đi liền với khối lượng nhập khẩu gia tăng là nguy cơ xâm nhiễm của các loài nấm bệnh hoại sinh, nấm ký sinh và đặc biệt là vi khuẩn ngoại lai gây bệnh héo rũ Pantoea stewartii – đối tượng kiểm dịch thực vật nguy hiểm chưa phổ biến tại Việt Nam.

Đồ án tốt nghiệp thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể sau:

• Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Xác định thành phần nấm bệnh hại hiện diện trên các lô hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan.
  2. Nghiên cứu, áp dụng quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR.

• Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu:

  1. Phân lập và mô tả các đặc điểm hình thái vi học của các tác nhân nấm gây bệnh trên hạt giống ngô nhập khẩu.
  2. Định danh đến cấp chi các chủng nấm đã phân lập được dựa trên các khóa phân loại chuẩn.
  3. Khảo sát và thực hiện đầy đủ các bước trong quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii từ khâu xử lý mẫu hạt, nuôi cấy chọn lọc, tách chiết DNA đến phản ứng khuếch đại gen PCR và điện di kiểm tra.

• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 20 mẫu hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan trong 6 tháng đầu năm 2013 bởi các công ty giống cây trồng (Việt Thái, Syngenta, Dekalb, CP, East-West Seed, Vương Nông) và chủng vi khuẩn chuẩn Pantoea stewartii do Viện Nghiên cứu Landcare Research Manaaki Whenua (New Zealand) cung cấp.
  • Phạm vi không gian: Thực hiện tại Phòng Điều Tra Giám Sát thuộc Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành từ ngày 24/06/2013 đến ngày 15/09/2013.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và đối tượng vi sinh vật

Cây ngô (Zea mays L.) thuộc phân họ Hòa thảo (Poaceae), là cây trồng dễ bị tổn thương bởi nhiều nhóm dịch hại truyền qua hạt và đất:

• Nhóm nấm gây bệnh và hoại sinh: Bao gồm nấm gây bệnh khô vằn (Rhizoctonia spp.), bệnh rỉ sắt (Puccinia sorghi Schw.), bệnh phấn đen (Ustilago maydis), bệnh thối thân mốc hồng (Fusarium moniliforme, Fusarium graminearum Schw.) và nấm mốc sinh độc tố (Aspergillus spp. như A. niger, A. flavus, A. parasiticus). Bào tử và sợi nấm tiềm sinh trong phôi hoặc vỏ hạt là nguồn lây nhiễm trực tiếp cho cây con khi nảy mầm.
• Tác nhân vi khuẩn Pantoea stewartii: Là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, hình que, không di động, không sinh bào tử, thuộc họ Enterobacteriaceae. Vi khuẩn gây tắc nghẽn hệ thống mạch dẫn của cây ngô, gây ra hai hội chứng điển hình: héo rũ cây con và tàn rụi sọc lá ở cây trưởng thành. Tác nhân này truyền lan tự nhiên qua vector bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria hoặc qua phôi của hạt giống mang mầm bệnh.

Phương pháp giám định thành phần nấm

• Phương pháp ủ ẩm (Blotter test): Hạt giống được đặt trong đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, ủ ở nhiệt độ 22°C – 25°C trong 7 ngày với chu kỳ theo dõi định kỳ. Thí nghiệm được bố trí trên 5 mẫu giống đại diện (M1, M2, M3, M4, M5) theo 2 nghiệm thức:
  • Nghiệm thức 1 (NT1): Hạt giống giữ nguyên trạng (mang lớp thuốc bảo vệ thực vật xử lý hạt của nhà sản xuất).
  • Nghiệm thức 2 (NT2): Hạt giống được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng nhằm loại bỏ lớp thuốc bảo vệ thực vật bề mặt.
  • Mỗi mẫu khảo sát 10 đĩa, mỗi đĩa 10 hạt (tổng số 100 hạt/mẫu/nghiệm thức).
• Phân lập thuần: Sử dụng que cấy vô trùng khều sợi nấm phát triển trên hạt cấy chuyền sang môi trường thạch nước (WA - Water Agar: 15 g agar/1000 ml nước cất). Sau 2 - 3 ngày ở nhiệt độ 25°C – 27°C, tiếp tục cấy chuyền đỉnh sợi nấm sang môi trường thạch bột bắp (CMA - Corn Meal Agar: 30 g bột bắp, 15 g agar/1000 ml nước cất) để tạo khuẩn lạc thuần khiết.
• Định danh hình thái hiển vi: Làm tiêu bản vi thể sợi nấm và cơ quan sinh sản trong dung dịch KOH 3%, quan sát cấu trúc cuống bào tử, bọng bào tử, thể bình và hình thái bào tử dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10x và 40x. Tra cứu định danh đến cấp chi dựa theo khóa phân loại của P. Hunter (1998) và Tsuneo Watanabe (2002).

Phương pháp giám định vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR

Quy trình thực hiện theo tiêu chuẩn chẩn đoán kiểm dịch thực vật EPPO (2006):

• Thu dịch và nuôi cấy vi khuẩn: Nghiền 100 hạt ngô trong 50 ml nước cất vô trùng, lắc đều 200 vòng/phút trong 10 phút, để lắng và lọc lấy dịch chứa vi khuẩn. Chang 100 µl dịch mẫu lên đĩa môi trường chọn lọc King’s B (Proteose peptone 20 g, K₂HPO₄ 1,5 g, MgSO₄.7H₂O 1,5 g, glycerol 15 ml, agar 15 g/1000 ml nước cất, pH 7,2 – 7,4), ủ ở 25°C – 28°C trong 2 – 3 ngày. Chọn lọc các khuẩn lạc tròn lồi, mép rõ, màu vàng nhạt đến vàng cam đặc trưng của Pantoea stewartii để cấy ria làm thuần và kiểm tra phản ứng nhuộm Gram.
• Nhân sinh khối và bảo quản: Khuẩn lạc đơn dòng được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g/1000 ml nước cất), lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Mẫu lưu trữ dài hạn ở -80°C trong dung dịch glycerol 15%.
• Ly trích DNA tổng số: Phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bằng SDS 10% kết hợp Proteinase K (20 mg/ml) ở 37°C trong 1 giờ. Loại bỏ protein và polysaccharide bằng dung dịch NaCl 5M và CTAB/NaCl ở 65°C trong 10 phút. Tinh sạch dịch chiết qua hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) và Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1). Kết tủa DNA bằng Isopropanol lạnh ở -20°C, rửa tủa bằng Ethanol 70%, làm khô và hòa tan lại trong 30 µl dung dịch đệm TE.
• Phản ứng PCR khuếch đại: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu theo Coplin & Majerczak:
  • Mồi xuôi ES16: 5’-GCG AAC TTG GCA GAG AT-3’
  • Mồi ngược ESIIG2C: 5’-GCG CTT GCG TGT TAT GAG-3’
  • Kích thước đoạn khuếch đại mục tiêu: 920 bp.
  • Thành phần phản ứng (25 µl/mẫu): Nước cất PCR 17,5 µl; Đệm PCR 10X; MgCl₂; dNTPs 10 mM; Primer ES16 (10 µM) 0,16 µM; Primer ESIIG2C (10 µM) 0,16 µM; Platinum Taq DNA Polymerase (5 U/µl) 0,04 U; DNA mẫu (20 ng/µl) 3 µl.
  • Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 94°C trong 4 phút; 29 chu kỳ lặp lại (94°C trong 45 giây, bắt cặp 55°C trong 45 giây, kéo dài 72°C trong 1 phút); kéo dài chuỗi kết thúc ở 72°C trong 10 phút.
• Điện di kiểm tra:
  • Kiểm tra độ nguyên vẹn DNA tổng số trên gel agarose 1% (chạy trong đệm TAE 0.5X ở 100 V, 250 mA trong 35 phút).
  • Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (chạy trong đệm TAE 0.5X ở 70 V, 250 mA trong 50 phút).
  • Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (10 mg/ml) trong 20 phút và quan sát vạch DNA dưới đèn soi tia cực tím UV bước sóng 302 nm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan về ngô và bệnh cây ngô

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học về nguồn gốc, phân loại thực vật học, sinh lý cấu tạo và kỹ thuật canh tác cây ngô (Zea mays L.). Tác giả phân tích số liệu thống kê sản xuất nông nghiệp quốc tế (theo USDA và FAOSTAT) giai đoạn 2010 - 2014, làm rõ vị thế của các cường quốc sản xuất ngô (Mỹ, Trung Quốc, Brazil) và bức tranh sản xuất ngô tại Việt Nam qua các giai đoạn phát triển giống ngô lai do Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo.

Chương 1 cũng tổng quan chi tiết các đối tượng dịch hại nguy hiểm trên cây ngô:

• Côn trùng hại chính: Sâu xám (Agrotis ipsilon), sâu đục thân (Ostrinia nubilalis), rệp cờ (Rhopalosiphum maydis).
• Các bệnh nấm phổ biến: Bệnh khô vằn do Rhizoctonia spp., bệnh rỉ sắt do Puccinia sorghi, bệnh phấn đen do Ustilago maydis, bệnh thối thân bắp do Fusarium moniliforme và Fusarium graminearum, bệnh mốc hạt do Aspergillus spp. (nhấn mạnh độc tố aflatoxin gây hại sức khỏe người và vật nuôi).
• Bệnh héo rũ vi khuẩn do Pantoea stewartii: Lịch sử phát hiện, đặc điểm vi sinh vật học, triệu chứng héo mạch dẫn và vai trò của vector bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria.

Chương 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả toàn bộ hệ thống nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị máy móc và quy trình thực nghiệm được triển khai tại Trung tâm Kiểm dịch Thực vật Sau Nhập khẩu II. Nội dung trình bày danh mục 20 mẫu hạt giống ngô nhập khẩu thu thập từ 6 công ty kinh doanh giống cây trồng lớn tại Thái Lan.

Ký hiệu mẫu	Tên giống bắp	Doanh nghiệp nhập khẩu
M1	AT 0970	Việt Thái
M2	NK 67	Syngenta
M3	DK 8868	Dekalb
M4	WAX 44	Syngenta
M5	Mẹ 3Q	CP
M6	Mẹ 888	CP
M7	NK 7328	Syngenta
M8	Mẹ 3Q Super	CP
M9	CP 999	CP
M10	099	East-West Seed
119	WXW6TH2672	Dekalb
122a	SG 22	Syngenta
122b	WAX 48	Syngenta
129d	PAC 293	Vương Nông
129j	PAC 1290022	Vương Nông
129g	PAC 1290043	Vương Nông
129h	PAC 1290393	Vương Nông
129k	PAC 1290033	Vương Nông
129l	PAC 1290004	Vương Nông
129m	PAC 1290032	Vương Nông

Chương 2 thuyết minh chi tiết 4 bước thực nghiệm giám định nấm (ủ ẩm Blotter, cấy thuần WA/CMA, quan sát tiêu bản vi thể KOH 3%) và 4 bước thực nghiệm giám định vi khuẩn Pantoea stewartii (chiết dịch hạt, phân lập trên môi trường chọn lọc King's B, tách chiết DNA bằng CTAB/Phenol-Chloroform, thực hiện PCR với mồi ES16/ESIIG2C và điện di gel agarose).

Chương 3. Kết quả và nhận xét

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình kiểm tra nấm và vi khuẩn trên các mẫu hạt giống ngô nhập khẩu:

• Tỷ lệ nhiễm nấm trên hạt giống: Đánh giá hiệu lực ức chế nấm của lớp thuốc bảo vệ thực vật phủ ngoài hạt giống thương phẩm thông qua việc so sánh đối chứng giữa nghiệm thức không rửa thuốc (NT1) và nghiệm thức rửa sạch thuốc (NT2) trên quy mô 100 hạt/mẫu.
• Xác định các chi nấm: Thông qua nuôi cấy thuần trên đĩa thạch CMA và quan sát hình thái sợi nấm, cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi, xác định sự xuất hiện của 3 chi nấm chính gồm Fusarium sp., Aspergillus spp. (quan sát thấy A. niger với khuẩn lạc đen, bọng hình cầu mang thể bình hai tầng và A. flavus/A. parasiticus có khuẩn lạc xanh lá/nâu vàng) và Rhizopus sp. (sợi nấm phát triển nhanh, cuống bào tử mang túi bào tử hình cầu).
• Giám định vi khuẩn Pantoea stewartii: Đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường King’s B, kết quả nhuộm Gram vi khuẩn, kiểm tra chất lượng dịch chiết DNA tổng số qua điện di gel agarose 1% và kiểm tra sự xuất hiện vạch khuếch đại đặc hiệu kích thước 920 bp qua điện di gel agarose 2%.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phát hiện chính

Khảo sát tỷ lệ xuất hiện nấm trên 5 mẫu giống ngô nhập khẩu (100 hạt/mẫu) giữa hai nghiệm thức cho ra kết quả cụ thể:

Mẫu giống khảo sát	Tên giống	Số hạt nhiễm nấm (NT1 - Giữ nguyên thuốc BVTV)	Số hạt nhiễm nấm (NT2 - Rửa sạch thuốc BVTV)	Tỷ lệ hạt sạch nấm ở NT1	Tỷ lệ hạt sạch nấm ở NT2
M1	AT 0970	30 / 100	72 / 100	70%	28%
M2	NK 67	21 / 100	19 / 100	79%	81%
M3	DK 8868	71 / 100	85 / 100	29%	15%
M4	WAX 44	15 / 100	67 / 100	85%	33%
M5	Mẹ 3Q	0 / 100	0 / 100	100%	100%

• Đánh giá hiệu lực xử lý thuốc bảo vệ thực vật trên hạt: Ở các mẫu M1, M3 và M4, tỷ lệ hạt nhiễm nấm ở nghiệm thức rửa thuốc (NT2) tăng vọt so với nghiệm thức giữ nguyên thuốc (NT1) (ví dụ mẫu M4 tăng từ 15% lên 67%, mẫu M1 tăng từ 30% lên 72%). Điều này chứng minh lớp thuốc bảo vệ thực vật được nhà sản xuất xử lý ngoài vỏ hạt có hiệu quả ức chế mạnh sự phát triển của bào tử nấm bên ngoài. Riêng mẫu M2 có tỷ lệ nhiễm nấm không đổi giữa hai nghiệm thức (~20%), cho thấy thuốc xử lý hạt không có tác dụng với nấm nội sinh hoặc nấm kháng thuốc trên mẫu này. Mẫu M5 hoàn toàn không xuất hiện nấm ở cả 2 nghiệm thức (100% hạt sạch).
• Thành phần nấm định danh: Xác định 3 chi nấm chính bám nhiễm trên hạt giống bắp nhập khẩu gồm: Fusarium sp., Aspergillus spp. và Rhizopus sp.
• Giám định vi khuẩn phân tử: Thực hiện thành công quy trình ly trích DNA vi khuẩn từ dịch nghiền hạt giống bắp bằng phương pháp CTAB kết hợp Phenol:Chloroform và thiết lập phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ES16/ESIIG2C cho phép khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 920 bp để chẩn đoán vi khuẩn Pantoea stewartii.

Giải pháp và khuyến nghị của tác giả

• Tiếp tục duy trì và tăng cường kiểm tra nghiêm ngặt lớp thuốc xử lý bảo vệ thực vật trên các lô hạt giống ngô nhập khẩu trước khi thông quan nhằm hạn chế nấm bệnh lây lan vào đồng ruộng.
• Ứng dụng tích hợp quy trình PCR với cặp primer đặc hiệu ES16/ESIIG2C vào công tác kiểm dịch thực vật thường quy tại các cửa khẩu để phát hiện nhanh, chính xác vi khuẩn Pantoea stewartii ở trạng thái tiềm sinh trong hạt mà không cần chờ biểu hiện triệu chứng trên đồng ruộng.
• Khuyến cáo người nông dân áp dụng các biện pháp canh tác tổng hợp: xử lý bổ sung hạt giống trước khi gieo bằng các thuốc bảo vệ thực vật đặc trị (Rovral, Thiram 85WP), luân canh ngô với lúa nước hoặc cây họ đậu, sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma để phòng ngừa nấm bệnh lưu tồn trong đất.

Đóng góp của đề tài

Đồ án đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm cụ thể về thực trạng nhiễm nấm trên các dòng ngô lai thương phẩm nhập khẩu từ Thái Lan vào năm 2013; đồng thời chuẩn hóa quy trình thực nghiệm chẩn đoán nhanh đối tượng kiểm dịch vi khuẩn Pantoea stewartii bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Trung tâm Kiểm dịch Thực vật Sau Nhập khẩu II.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Quy mô thực nghiệm giám định nấm chi tiết mới tập trung thực hiện trên 5 mẫu đại diện (M1 đến M5) trong tổng số 20 mẫu hạt giống thu thập được.
  • Việc định danh nấm mới dừng lại ở cấp độ chi (Genus) dựa trên khóa phân loại hình thái hiển vi (Hunter, 1998; Watanabe, 2002), chưa tiến hành giải trình tự vùng gen ITS (Internal Transcribed Spacer) để xác định chính xác đến cấp loài cho các chủng Fusarium sp. và Rhizopus sp.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng phạm vi giám định nấm và vi khuẩn trên toàn bộ 20 mẫu giống bắp đã thu thập và các nguồn hạt giống nhập khẩu từ các thị trường khác như Ấn Độ, Mỹ.
  • Kết hợp giải trình tự gen (DNA sequencing) các sản phẩm PCR để khẳng định độ tương đồng di truyền của các chủng vi khuẩn phân lập được so với chủng chuẩn quốc tế Pantoea stewartii.

Giá trị tham khảo

Đồ án tốt nghiệp là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật và Nông học: Tham khảo chi tiết phương pháp bố trí thí nghiệm ủ ẩm Blotter, kỹ thuật cấy chuyển làm thuần nấm trên môi trường WA/CMA và kỹ thuật soi tiêu bản định loại nấm học.
• Cán bộ kỹ thuật và kiểm dịch viên thực vật: Ứng dụng quy trình chiết tách DNA bằng CTAB/SDS và thiết lập phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 920 bp của cặp mồi ES16/ESIIG2C trong công tác giám định nhanh vi khuẩn kiểm dịch Pantoea stewartii.
• Người nghiên cứu về bệnh học cây trồng: Tham khảo hệ thống tổng quan bệnh cây ngô, đặc điểm hình thái của các loài nấm gây hại (Fusarium, Aspergillus, Rhizoctonia) và vi khuẩn gây bệnh héo mạch dẫn.

Câu hỏi thường gặp

1. Phản ứng PCR trong đề tài sử dụng cặp primer nào và kích thước đoạn khuếch đại mục tiêu là bao nhiêu?

Phản ứng PCR sử dụng cặp primer đặc hiệu theo công bố của Coplin & Majerczak gồm mồi xuôi ES16 (5’-GCG AAC TTG GCA GAG AT-3’) và mồi ngược ESIIG2C (5’-GCG CTT GCG TGT TAT GAG-3’). Kích thước đoạn DNA khuếch đại đặc hiệu cho vi khuẩn Pantoea stewartii là 920 bp.

2. Sự khác biệt giữa hai nghiệm thức NT1 và NT2 trong thí nghiệm ủ ẩm hạt ngô là gì và cho thấy điều gì?

Nghiệm thức 1 (NT1) là hạt giống giữ nguyên trạng (còn lớp thuốc bảo vệ thực vật do công ty xử lý), còn Nghiệm thức 2 (NT2) là hạt giống đã được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ lớp thuốc ngoài vỏ. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các mẫu M1, M3, M4, tỷ lệ hạt mọc nấm ở NT2 cao hơn rõ rệt so với NT1, chứng minh lớp thuốc bảo vệ thực vật phủ ngoài vỏ hạt có hiệu lực ức chế nấm phát triển rất tốt.

3. Những chi nấm nào đã được phân lập và định danh hình thái trên các mẫu hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan?

Dựa vào phương pháp khóa định loại hình thái hiển vi của P. Hunter (1998) và Tsuneo Watanabe (2002), đề tài đã phân lập và định danh được 3 chi nấm gồm: chi Fusarium sp., chi Aspergillus spp. (bao gồm các loài đặc trưng như A. niger, A. flavus, A. parasiticus) và chi Rhizopus sp.

4. Vector truyền bệnh chính trong tự nhiên của vi khuẩn Pantoea stewartii là loài côn trùng nào?

Theo các tài liệu tổng quan được trích dẫn trong đề tài (nghiên cứu của Charlotte Elliot và F. Poos), vector truyền bệnh quan trọng nhất của vi khuẩn Pantoea stewartii trên đồng ruộng là loài bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria thuộc họ Ánh kim (Chrysomelidae). Vi khuẩn tồn tại trong ruột của loài bọ này và xâm nhập vào cây qua các vết cắn khi côn trùng gây hại.

5. Thành phần các loại môi trường dinh dưỡng chính được pha chế trong đồ án gồm những gì?

Đề tài sử dụng 4 loại môi trường:

• Môi trường WA (thạch nước): 15 g agar/1000 ml nước cất (dùng cấy chuyền ban đầu).
• Môi trường CMA (thạch bột bắp): 30 g bột bắp đun chiết, 15 g agar/1000 ml nước cất (dùng làm thuần và quan sát sợi nấm).
• Môi trường King’s B: 20 g Proteose peptone, 1,5 g K₂HPO₄, 1,5 g MgSO₄.7H₂O, 15 ml glycerol, 15 g agar/1000 ml nước cất, pH 7,2 – 7,4 (môi trường chọn lọc vi khuẩn).
• Môi trường LB lỏng: 10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-yeast extract, 10 g NaCl/1000 ml nước cất (dùng nhân sinh khối vi khuẩn phục vụ ly trích DNA).

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp đã tiến hành khảo sát thực nghiệm thành phần nấm bệnh trên các mẫu hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan và thiết lập thành công quy trình sinh học phân tử giám định vi khuẩn Pantoea stewartii tại Trung tâm Kiểm dịch Thực vật Sau Nhập khẩu II. Kết quả phân lập hình thái đã định danh được 3 chi nấm phổ biến bám nhiễm trên hạt gồm Fusarium sp., Aspergillus spp., Rhizopus sp., đồng thời chứng minh hiệu quả ức chế nấm rõ rệt của lớp thuốc bảo vệ thực vật xử lý ngoài hạt giống thương phẩm. Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi ES16/ESIIG2C với kích thước đoạn khuếch đại 920 bp đã cung cấp công cụ chẩn đoán phân tử có độ tin cậy cao phục vụ công tác kiểm dịch sau nhập khẩu. Các số liệu và quy trình trong đồ án đóng góp nguồn tài liệu kỹ thuật thiết thực cho công tác nghiên cứu bệnh học thực vật và bảo vệ an toàn sản xuất nông nghiệp trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ NGÔ VÀ BỆNH CÂY NGÔ 1. Giới thiệu về cây ngô 1. Nguồn gốc và phân loại 1.

Nguồn gốc Ngô có nguồn gốc đầu tiên từ cỏ ngô và được thuần dưỡng tại Trung Mỹ, sau đó lan ra toàn Châu Mỹ và khắp thế giới. Quá trình thuần dưỡng ngô được một số người cho là đã bắt đầu vào khoảng năm 5. Chứng cứ di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần dưỡng ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico. Có rất ít thay đổi diễn ra đối với hình dạng bắp ngô cho tới khoảng 1100 TCN khi các thay đổi lớn diễn ra trên các bắp ngô trong các hang động tại Mexico: sự đa dạng của ngô tăng lên nhanh chóng.

Có lẽ sớm nhất là vào khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh. Khi nó được du nhập vào các nền văn hóa mới. Các nền văn minh Trung Mỹ đã được tăng cường sức mạnh nhờ vào ngô. Trong thiên niên kỷ I, việc gieo trồng ngô đã lan rộng từ Mexico vào Tây Nam Hoa Kỳ và khoảng một thiên niên kỷ sau vào Đông Bắc nước này cũng như Đông Nam Canada.

Ngày nay, nhờ sự phát triển khoa học kỹ thuật nên ngày càng có nhiều giống ngô lai mới được sản xuất và đưa vào sử dụng khắp nơi trên thế giới. Vị trí Phân loại Tên khoa học: Zea mays L. Giới: Plantea (thực vật) Ngành: Angiospermae (thực vật có hoa) Lớp: Monocots (một lá mầm) Bộ: Poales (hòa thảo) Họ: Poaceae (hòa thảo) Chi: Zea (cỏ ngô) Loài: mays (ngô) 5 Đồ án tốt nghiệp 1. Đặc điểm thực vật Cũng như các cây họ hòa thảo, cây ngô có các bộ phận: rễ, thân, lá, hoa (cờ ngô), quả (bắp ngô) và hạt.

 Rễ ngô: Rễ ngô chia làm 3 loại: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. - Rễ mầm phát triển từ rễ sơ sinh của phôi, tồn tại từ khi nảy mầm đến khi cây ngô có 4 - 5 lá. Rễ mầm có 2 loại: rễ chính (xuất hiện sau khi hạt ngô nảy mầm) và rễ phụ (xuất hiện sau rễ chính). - Rễ đốt phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng quanh các đốt dưới mặt đất, bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá.

Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây ngô. - Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt sát mặt đất. Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt đất. Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nước và thức ăn.

 Thân ngô Thân ngô đặc, đường kính khoảng 2 - 4 cm tùy thuộc vào giống, thân có thể cao từ 1,5 - 4 m. Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm, từ các đốt của thân chính có thể phát sinh ra 1-10 nhánh có hình dáng tương tự như thân chính (thân phụ). Thân ngô trưởng thành gồm nhiều lóng được ngăn cách bởi các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Số lượng và chiều dài của các lóng được xem như một đặc điểm có giá trị trong việc phân loại các giống ngô.

Thường các giống ngắn ngày có 14 - 15 lóng, các giống trung ngày có 18 - 20 lóng, còn các giống dài ngày có khoảng 20 - 22 lóng.  Lá ngô Căn cứ vào hình thái và vị trí trên thân có thể chia làm 4 loại lá: - Lá mầm: là lá đầu tiên khi cây còn nhỏ, chưa phân biệt được phiến lá với vỏ bọc lá. - Lá thân: là những lá có mầm nách ở kẽ chân lá hay những lá mọc trên những đốt thân. - Lá ngọn: là những lá ở phần trên của bắp trên cùng hay những lá mọc ở trên các đốt ngọn, không có mầm nách ở kẽ lá.

6 Đồ án tốt nghiệp - Lá bi: là những lá bao bắp. Số lượng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau. Số lá là đặc điểm khá ổn định ở ngô, có quan hệ chặt với số đốt và thời gian sinh trưởng. Những giống ngô ngắn ngày thường có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình: 18 - 20 lá, giống ngô dài ngày thường có trên 20 lá.

 Bông cờ Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh. Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié. Các gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh. Mỗi bông nhỏ có cuống ngắn và hai vỏ nâu hình bầu dục, trên vỏ trấu (mày ngoài và mày trong) có gân và lông tơ.

Trong mỗi bông nhỏ có hai hoa: một hoa cuống dài và một hoa cuống ngắn. Một bông nhỏ có thể có một hoặc ba hoa. Ở mỗi hoa có thể thấy dấu vết thoái hoá và vết tích của nhụy hoa cái, quanh đó có ba chỉ đực mang ba nhị đực và hai mày cực nhỏ gọi là vẩy tương ứng với tràng hoa. Bao quanh các bộ phận của một hoa có hai mày nhỏ, mày ngoài ứng với lá bắc hoa và mày trong ứng với lá đài hoa.

 Bắp ngô Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp. Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn, mỗi đốt trên cuống có một lá bi bao bọc. Trên trục đính hoa cái (cùi, lõi ngô), hoa mọc từng đôi bông nhỏ. Mỗi bông có hai hoa, nhưng chỉ có một hoa tạo thành hạt, còn một hoa thoái hóa.

Phía ngoài hoa có hai mày (mày ngoài và mày trong). Ngay sau mày ngoài là dấu vết của nhị đực và hoa cái thứ hai thoái hoá, chính giữa là bầu hoa, trên bầu hoa có núm và vòi nhụy vươn dài thành râu. Râu ngô thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Trên râu có nhiều lông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nảy mầm.

 Hạt ngô Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dưới vỏ 7 Đồ án tốt nghiệp hạt và bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng.

Nội nhũ có 2 phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Các hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm, chứa khoảng 200 - 400 hạt.

Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Kỹ thuật canh tác Để có được một vụ ngô đạt năng suất và chất lượng thì cần rất nhiều yếu tố kết hợp: giống, thời vụ gieo trồng, điều kiện đất đai, khí hậu kết hợp với các kỹ thuật canh tác, quản lý dịch bệnh đúng phương pháp và đúng lúc.  Giống Trong thực tế sản xuất, sử dụng hạt giống có chất lượng tốt có thể làm tăng năng suất ngô từ 10% - 15%. Giống tốt lại mang thêm các đặc tính khác như có khả năng chống chịu sâu bệnh thì sẽ giảm được chi phí đầu tư về bảo vệ thực vật, sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao.

Do vậy, để có vụ sản xuất ngô bội thu thì việc chuẩn bị hạt giống là yếu tố rất quan trọng trong quy trình kỹ thuật trồng ngô. Ở Việt Nam, cây ngô lai mới được đưa vào cơ cấu sản xuất trong thời gian gần đây nhưng do khả năng vượt trội của các giống này về năng suất nên hiện nay, diện tích trồng ngô lai của cả nước chiếm trên 90%. Các giống ngô lai có mặt tích cực về khả năng cho năng suất cao hơn các giống ngô thuần nhưng người trồng ngô phải mua hạt giống từ các nhà cung cấp. Hiện nay, hạt giống ngô đều được các nhà cung cấp xử lý thuốc phòng trừ sâu bệnh trước khi đóng gói, khi mua về phải quan sát màu hạt giống xem đã xử lý hay chưa xử lý.

Với các giống ngô thuần tự để giống có thể dùng các loại thuốc xử lý hạt như Rovral, lượng 2g/ 10kg hạt, Thiram 85 WP, lượng 2-3 g/kg hạt giống hoặc TMD85 BTN, lượng 2-3 g/kg hạt giống. Xử lý bằng cách trộn thuốc với hạt giống trước khi gieo. 8 Đồ án tốt nghiệp  Thời vụ Nước ta có diện tích trải dài, đặc điểm khí hậu và đất đai rất khác nhau giữa các vùng. Do đó, thời vụ gieo trồng tại mỗi vùng cũng không giống nhau.

- Miền Bắc: vụ xuân, vụ hè, vụ thu đông, vụ đông xuân. - Miền Trung: vụ xuân, vụ đông, vụ hè thu, vụ đông xuân - Miền Nam và Tây Nguyên: vụ hè thu, vụ thu đông, vụ đông xuân.  Đất Cây ngô có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất phù sa được bồi đắp hàng năm, đất đỏ, đất bạc màu. Nhưng thích hợp nhất là đất phù sa được bồi đắp hàng năm, kế đến là đất đỏ.

Không nên trồng ngô lai trên vùng đất nhiễm phèn nặng, vùng quá khô hạn hay vùng thường bị ngập úng. Đất trồng ngô cần đựợc cầy sâu, bừa kĩ, sạch cỏ dại. Ở những bãi dốc có thể không cần làm đất, chỉ làm sạch cỏ dại, chờ có mưa, ẩm đất tiến hành chọc lỗ gieo hạt.  Khoảng cách và mật độ trồng Mật độ trồng ngô phụ thuộc vào vùng sinh thái, mùa vụ, thời gian sinh trưởng của giống và điều kiện thâm canh.

Nguyên tắc chung là càng đi xa theo hướng từ Bắc vào Nam thì mật độ trồng tăng dần. Có điều kiện thâm canh tốt thì tăng mật độ để đảm bảo năng suất ngô cao và ổn định. Theo Viện nghiên cứu ngô khuyến cáo nên áp dụng những công thức mật độ trồng ngô sau: - Đối với giống dài ngày trồng với khoảng cách 75 cm x 25 cm (1 cây/1 hốc), tương ứng với mật độ 53. - Đối với giống ngắn ngày, thấp cây nên trồng dày với khoảng cách 70 cm x 25 cm (1cây/1hốc) ứng với mật độ 57.

Chú ý: Vụ đông xuân và thu đông nên trồng dày hơn vụ hè thu.