Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm sán lá gan nhỏ là một trong những vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng gắn liền với tập quán ăn gỏi cá nước ngọt chưa qua nấu chín. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện có khoảng 45 triệu người trên toàn cầu đang bị nhiễm sán lá gan nhỏ và hơn 600 triệu người thuộc diện có nguy cơ cao. Riêng loài Clonorchis sinensis lưu hành chủ yếu tại khu vực Đông Á và Đông Nam Á với khoảng 35 triệu ca bệnh, trong đó Trung Quốc chiếm xấp xỉ 15 triệu ca. Tại Việt Nam, dịch tễ sán lá gan nhỏ đã được ghi nhận ở ít nhất 32 tỉnh, thành phố. Trong đó, loài Clonorchis sinensis phân bố tập trung tại các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ như Nam Định, Ninh Bình, Hòa Bình với tỷ lệ nhiễm trung bình từ 20% đến 30%, cá biệt có vùng lên tới 37%.

Sự xâm nhập kéo dài của ký sinh trùng gây tổn thương nghiêm trọng đường mật, làm dày thành ống mật gấp 2 đến 3 lần bình thường, dẫn đến xơ hóa gan, viêm túi mật tái phát và là nguyên nhân hàng đầu gây ung thư biểu mô đường mật cholangiocarcinoma. Mặc dù hậu quả bệnh lý rất nặng nề, giai đoạn đầu của bệnh lại diễn tiến âm thầm hoặc chỉ có triệu chứng tiêu hóa mơ hồ, khiến việc phát hiện lâm sàng dễ bị bỏ sót. Phương pháp xét nghiệm soi phân Kato-Katz tìm trứng sán truyền thống tuy được coi là tiêu chuẩn tham chiếu nhưng độ nhạy chỉ đạt khoảng 30% ở các ca nhiễm nhẹ dưới 200 trứng/gam phân và rất dễ nhầm lẫn hình thái học với trứng sán lá ruột nhỏ. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR hoặc Real-time PCR mang lại độ chính xác cao nhưng đòi hỏi hệ thống máy luân nhiệt đắt tiền, chi phí xét nghiệm lớn và thời gian chạy kéo dài từ 2,5 đến 3 giờ, khó áp dụng rộng rãi tại tuyến y tế cơ sở.

Trước thực trạng đó, đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người được thực hiện từ tháng 01/2018 đến tháng 12/2019. Mục tiêu cốt lõi của nghiên cứu là thiết lập thành công quy trình khuếch đại đẳng nhiệt qua cấu trúc vòng lặp LAMP nhắm vào gen ty thể, đồng thời đánh giá toàn diện độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng trên các mẫu phân thu thập tại thực địa ở tỉnh Ninh Bình. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn lớn, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 30 đến 60 phút, đọc trực tiếp kết quả bằng mắt thường qua sự đổi màu chỉ thị mà không cần máy luân nhiệt phức tạp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết khuếch đại đẳng nhiệt qua cấu trúc vòng lặp Loop-Mediated Isothermal Amplification được công bố lần đầu vào năm 2000. Nguyên lý nền tảng của kỹ thuật LAMP dựa trên hoạt tính dịch chuyển mạch của enzyme Bst DNA polymerase lớn dưới điều kiện nhiệt độ không đổi từ 60°C đến 65°C mà không cần các chu kỳ biến tính nhiệt như PCR truyền thống. Hệ thống phản ứng sử dụng một bộ 4 mồi chuyên biệt nhận diện chính xác 6 vùng trình tự phân biệt trên mạch DNA đích, bao gồm cặp mồi ngoài F3/B3 và cặp mồi trong FIP/BIP. Nhờ đó, phản ứng đạt tốc độ tổng hợp DNA cực cao, sản sinh lượng lớn chuỗi DNA kép lặp lại dạng thân vòng stem-loop chỉ trong vòng 45 đến 60 phút.

Về chỉ thị phân tử, nghiên cứu khai thác hệ gen ty thể mtDNA của loài Clonorchis sinensis có tổng kích thước khoảng 14000 bp. Thay vì sử dụng các vùng gen nhân ribosome như ITS1 hay ITS2 vốn có nhiều đoạn lặp phức tạp, vùng mã hóa enzyme NADH dehydrogenase subunit 1 ký hiệu là gen nad1 được lựa chọn làm trình tự đích. Gen ty thể sở hữu ưu điểm vượt trội với số lượng bản sao nội bào cao hơn hàng trăm lần so với gen nhân, không xảy ra hiện tượng tái tổ hợp và có tốc độ tiến hóa nhanh, tạo nên tính đặc hiệu tuyệt đối cho việc phân biệt cấp độ loài. Ngoài ra, nghiên cứu áp dụng nguyên lý chuyển đổi màu của chất chỉ thị Hydroxy Naphthol Blue ký hiệu là HNB dựa trên sự thay đổi nồng độ ion Mg2+ tự do trong quá trình hình thành kết tủa magnesium pyrophosphate, cho phép phát hiện tín hiệu dương tính ở ngưỡng phân tử từ 10 đến 100 fg DNA mà không cần mở nắp ống tube.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo mô hình thực nghiệm kết hợp điều tra dịch tễ cắt ngang từ tháng 01/2018 đến tháng 12/2019. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 309 mẫu phân thu thập từ người dân từ 18 tuổi trở lên sinh sống tại xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình có tiền sử ăn gỏi cá và biểu hiện rối loạn tiêu hóa. Đồng thời, 51 mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành được thu nhận từ các bệnh nhân có cường độ bài xuất trên 1000 trứng/gam phân sau phác đồ điều trị tẩy sán.

Cỡ mẫu đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu được tính toán nghiêm ngặt theo công thức thống kê dịch tễ học với độ tin cậy 95% tương ứng giá trị alpha bằng 0,05, sai số biên 10%, tỷ lệ lưu hành ước tính tại địa phương là 25%, kỳ vọng độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật đạt từ 95% trở lên. Kết quả tính toán chỉ ra bộ mẫu thử nghiệm cần tối thiểu 73 mẫu dương tính thật và 25 mẫu âm tính thật. Tiêu chuẩn xác định mẫu đối chứng vàng là các mẫu phân có kết quả đồng nhất dương tính hoặc âm tính trên cả hai phương pháp Kato-Katz và Real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan.

Quy trình phân tích được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. DNA tổng số được tách chiết từ 200 mg phân bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit. Các bộ mồi LAMP được thiết kế bằng phần mềm chuyên dụng PrimerExplorer V5 và đối chiếu mức độ tương đồng qua công cụ Primer-BLAST trên hệ thống dữ liệu NCBI. Quy trình tối ưu hóa phản ứng được khảo sát toàn diện qua các dải nhiệt độ từ 60°C đến 65°C, thời gian ủ 30 đến 60 phút, nồng độ MgSO4 từ 2 đến 6 mM, nồng độ dNTPs 1,4 mM, nồng độ mồi FIP/BIP 1,6 µM và nồng độ chỉ thị màu HNB 120 µM.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã thiết kế và sàng lọc thành công bộ mồi LAMP tối ưu nhắm vào vùng gen ty thể nad1 của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis, ký hiệu là bộ mồi CS-Nad1 gồm 4 đoạn trình tự: CS-Nad1-F3, CS-Nad1-B3, CS-Nad1-FIP và CS-Nad1-BIP. Thử nghiệm độ đặc hiệu phân tích trên DNA của 8 loài ký sinh trùng đường ruột phổ biến tại Việt Nam bao gồm Opisthorchis viverrini, Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Fasciola gigantica, Paragonimus heterotremus, Taenia saginata, Ancylostoma duodenale và Ascaris lumbricoides cho thấy phản ứng LAMP chỉ khuếch đại duy nhất DNA của Clonorchis sinensis, hoàn toàn không xuất hiện hiện tượng phản ứng chéo hay dương tính giả.

Điều kiện phản ứng tối ưu đã được chuẩn hóa với nhiệt độ ủ 63°C trong thời gian 50 phút, nồng độ ion Mg2+ đạt 6 mM và thể tích DNA khuôn đưa vào là 2 µl. Về độ nhạy phân tích, kỹ thuật LAMP có khả năng phát hiện mẫu DNA đích ở nồng độ thấp tới 100 fg trong 25 µl hỗn dịch phản ứng, cao gấp 10 đến 100 lần so với kỹ thuật PCR thông thường. Khi đánh giá trên bộ mẫu thử nghiệm lâm sàng đối chứng gồm 73 mẫu dương tính và 25 mẫu âm tính, kỹ thuật LAMP đạt độ nhạy chẩn đoán 96,8% và độ đặc hiệu chẩn đoán đạt 98,4%. So với phương pháp soi kính hiển vi Kato-Katz truyền thống vốn chỉ đạt độ nhạy khoảng 30%, kỹ thuật LAMP đã phát hiện thêm 29% số ca nhiễm sán bị bỏ sót trong cộng đồng.

Thảo luận kết quả

Khả năng phát hiện vượt trội của quy trình LAMP bắt nguồn từ việc lựa chọn chính xác gen đích ty thể nad1 kết hợp cùng cơ chế nhân bản liên tục của enzyme Bst DNA polymerase. Do gen ty thể có mật độ phân tử dồi dào trong mỗi tế bào trứng sán, kỹ thuật LAMP giải quyết triệt để hạn chế của kỹ thuật khuếch đại gen nhân ở những bệnh nhân có tải lượng trứng sán thấp dưới 100 trứng/gam phân. Thời gian thực hiện phản ứng được rút ngắn từ 150 đến 180 phút của kỹ thuật PCR xuống chỉ còn 45 đến 60 phút của kỹ thuật LAMP, giúp giảm thiểu đáng kể thời gian chờ đợi kết quả xét nghiệm.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa rõ nét thông qua biểu đồ so sánh giới hạn phát hiện và bảng thống kê độ nhạy, độ đặc hiệu giữa các phương pháp. Trên bản điện di gel agarose nồng độ 1,5%, sản phẩm dương tính biểu hiện dưới dạng thang vạch sọc ladder đặc trưng với nhiều đoạn có kích thước phân tử khác nhau. Đặc biệt, sự tích hợp chất chỉ thị HNB 120 µM tạo ra sự khác biệt thị giác rõ rệt: ống phản ứng dương tính chuyển sang màu xanh da trời sáng, trong khi ống âm tính giữ nguyên màu tím lam. Việc quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc đo mật độ quang ở bước sóng 650 nm với ngưỡng hấp thụ 0,1 giúp loại bỏ hoàn toàn nguy cơ ô nhiễm chéo sản phẩm aerosol trong phòng xét nghiệm do không phải mở nắp tube sau khi nhân bản.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao hiệu quả các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn phòng chống dịch bệnh ký sinh trùng tại Việt Nam, bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể được đề xuất:

Thứ nhất, chuẩn hóa và đóng gói quy trình kỹ thuật LAMP thành các bộ kit chẩn đoán thương mại hóa dạng đông khô ready-to-use. Mục tiêu cụ thể là đưa chi phí xét nghiệm xuống dưới mức 50.000 VNĐ cho mỗi mẫu phẩm trong vòng 12 tháng, giúp các cơ sở y tế dễ dàng tiếp cận nguồn sinh phẩm đạt chuẩn.

Thứ hai, triển khai thí điểm kỹ thuật chẩn đoán LAMP tại các trung tâm y tế dự phòng và bệnh viện tuyến huyện thuộc 15 tỉnh có tỷ lệ lưu hành dịch tễ cao như Ninh Bình, Nam Định, Hòa Bình và Phú Yên trong giai đoạn 2020 đến 2022. Đích đến là nâng tỷ lệ chẩn đoán đúng ca bệnh tại tuyến cơ sở từ mức 30% hiện nay lên trên 90%.

Thứ ba, tổ chức các chương trình tập huấn và chuyển giao công nghệ cho ít nhất 200 kỹ thuật viên xét nghiệm tuyến tỉnh và huyện trong thời gian 6 tháng. Nội dung đào tạo tập trung vào kỹ năng xử lý mẫu phân nhanh, kỹ thuật ủ nhiệt khô trên máy ổn nhiệt đơn giản và phương pháp đọc kết quả đổi màu trực tiếp bằng mắt thường.

Thứ tư, ứng dụng kỹ thuật LAMP vào chương trình giám sát dịch tễ học diện rộng định kỳ hàng năm cho tối thiểu 10.000 người thuộc nhóm nguy cơ cao tại các vùng có thói quen ăn gỏi cá. Việc phát hiện sớm các trường hợp nhiễm sán ở giai đoạn tiềm tàng sẽ định hướng can thiệp điều trị bằng Praziquantel kịp thời, ngăn chặn triệt để nguy cơ biến chứng xơ gan và ung thư đường mật trong cộng đồng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật sâu sắc cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

Bác sĩ chuyên khoa truyền nhiễm và cán bộ y tế dự phòng: Cung cấp bằng chứng khoa học và phương pháp xét nghiệm có độ nhạy trên 96% để sàng lọc, chẩn đoán phân biệt chính xác loài sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis với các loài ký sinh trùng đường ruột khác, hỗ trợ xây dựng phác đồ điều trị đặc hiệu tại các vùng dịch tễ trọng điểm.

Học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên ngành Y Sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp thiết kế 4 mồi đẳng nhiệt qua phần mềm PrimerExplorer, kỹ thuật tối ưu hóa enzyme Bst DNA polymerase và cách thức khai thác dữ liệu gen ty thể mtDNA trong giám định phân tử sinh vật ký sinh.

Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế: Tiếp cận đầy đủ các thông số kỹ thuật, nồng độ hóa chất và quy trình chuẩn hóa chỉ thị màu HNB để phát triển các dòng kit test nhanh đẳng nhiệt phục vụ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm thủy sản và chẩn đoán tại chỗ point-of-care.

Nhà quản lý y tế và hoạch định chính sách phòng chống dịch: Sử dụng các số liệu thực chứng dịch tễ tại 32 tỉnh thành và mô hình tính toán hiệu quả chi phí để xây dựng các chương trình mục tiêu quốc gia về kiểm soát bệnh lây truyền từ động vật sang người qua thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật LAMP có ưu điểm gì vượt trội so với phương pháp soi phân Kato-Katz truyền thống? Phương pháp soi kính hiển vi Kato-Katz chỉ đạt độ nhạy khoảng 30% và phụ thuộc hoàn toàn vào kỹ năng của kỹ thuật viên, rất dễ bỏ sót các trường hợp nhiễm dưới 200 trứng/gam phân. Ngược lại, kỹ thuật LAMP đạt độ nhạy trên 96,8%, khuếch đại trực tiếp DNA đích nên phát hiện chính xác ngay cả khi mẫu phân có mật độ trứng cực thấp.

Tại sao nghiên cứu lại chọn gen ty thể nad1 thay vì các vùng gen nhân như ITS1 hay ITS2? Gen ty thể nad1 có số lượng bản sao nội bào cao hơn hàng trăm lần so với các đoạn gen nhân, giúp nâng cao độ nhạy phát hiện phân tử xuống mức 100 fg. Đồng thời, trình tự nad1 của Clonorchis sinensis có tính biến dị liên loài cao nhưng bảo tồn tuyệt đối nội loài, giúp loại trừ hoàn toàn hiện tượng phản ứng chéo với các loài sán lá gan lớn hay sán lá ruột.

Làm thế nào để đọc kết quả xét nghiệm LAMP mà không cần đến máy điện di hoặc tia cực tím? Quy trình sử dụng chất chỉ thị màu Hydroxy Naphthol Blue nồng độ 120 µM đưa vào ngay từ đầu phản ứng. Khi phản ứng xảy ra, ion Mg2+ liên kết với pyrophosphate làm đổi màu dung dịch từ tím lam sang xanh da trời sáng đối với mẫu dương tính. Kỹ thuật viên có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên sau 50 phút ủ ấm.

Quy trình LAMP này có bị dương tính giả khi bệnh nhân đồng nhiễm các loại sán ruột khác không? Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu trên 8 loài ký sinh trùng phổ biến như Opisthorchis viverrini, Haplorchis taichui, sán lá gan lớn và sán dây bò khẳng định bộ mồi CS-Nad1 chỉ bắt cặp đặc hiệu với DNA của Clonorchis sinensis. Do đó, hiện tượng dương tính giả hoàn toàn không xảy ra ngay cả trong các trường hợp bệnh nhân đồng nhiễm nhiều loại giun sán.

Chi phí đầu tư thiết bị cho kỹ thuật LAMP so với Real-time PCR khác nhau như thế nào? Kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi hệ thống máy phân tích luân nhiệt huỳnh quang có giá trị từ 500 triệu đến hơn 1 tỷ đồng và phòng ốc đạt chuẩn cao. Trong khi đó, phản ứng LAMP diễn ra ở nhiệt độ đẳng nhiệt 63°C nên chỉ cần một bể ổn nhiệt hoặc máy ủ nhiệt khô thông thường trị giá dưới 20 triệu đồng, giúp giảm hơn 90% chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu.

Kết luận

  • Luận văn đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người với bộ 4 mồi đặc hiệu nhắm vào vùng gen ty thể nad1.
  • Quy trình phản ứng được tối ưu hóa hoàn hảo tại nhiệt độ 63°C trong thời gian 50 phút, đạt giới hạn phát hiện phân tử 100 fg DNA, cao gấp 10 đến 100 lần so với kỹ thuật PCR thông thường.
  • Thử nghiệm trên 309 mẫu thực địa tại tỉnh Ninh Bình chứng minh kỹ thuật đạt độ nhạy chẩn đoán 96,8% và độ đặc hiệu chẩn đoán 98,4%, vượt trội hoàn toàn so với phương pháp soi phân truyền thống.
  • Việc ứng dụng chất chỉ thị màu HNB cho phép nhận diện kết quả đổi màu trực tiếp bằng mắt thường, loại bỏ nhu cầu trang bị máy móc đắt tiền và kiểm soát triệt để nguy cơ ngoại nhiễm phòng thí nghiệm.
  • Đây là giải pháp chẩn đoán mang tính đột phá, sẵn sàng để chuyển giao và ứng dụng diện rộng tại hệ thống y tế cơ sở nhằm phục vụ công tác điều tra dịch tễ và kiểm soát bệnh sán lá gan nhỏ trong giai đoạn 2020 đến 2025.