Nghiên Cứu Kháng Thể Đối Với Bệnh Virus Đốm Thuốc Lá Trên Cà Chua Bằng Dấu Ấn DNA

Nghiên cứu kháng bệnh virus khảm thuốc lá trên cà chua bằng dấu hiệu DNA, cung cấp giải pháp cho nông nghiệp bền vững và hiệu quả.

• Tác giả: Nguyen Thi Hong Hai
• Người hướng dẫn: Pham Thi Dung, Ph.D
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Nghiên Cứu Kháng Thể Đối Với Bệnh Virus Đốm Thuốc Lá Trên Cà Chua Bằng Dấu Ấn DNA
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• GUARANTEE
• ACKNOWLEDGMENTS
• TABLE OF CONTENT
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Rationale
• 1.2. Aims and requirements of study
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. The origin of tomato
• 2.2. Nutritional values
• 2.3. Characteristics of tomato plants
• 2.4. The situation of tomato production in the world and in the country
• 2.4.1. The situation of tomato production in the world
• 2.4.2. The situation of tomato production in Vietnam
• 2.5. Tobacco mosaic virus disease on tomato
• 3. CHAPTER 3: RESEARCH MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Place and time of study
• 3.2. Methods for assessing important agronomic traits
• 3.3. Evaluation of resistance to tomato mosaic virus disease of selected tomato varieties by using molecular markers
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Survey on genetic diversity of researched tomato varieties
• 4.2. Growth stages of tomato plants
• 4.3. Results on some structural features
• 4.4. Investigate the characteristics of inflorescence structure, bloom characteristics, yield, and yield factors
• 4.5. Results of the PCR method to detect the Tm-2 gene in the studied tomato group
• 4.5.1. Test of DNA total
• 4.5.2. Determination of DNA content by OD spectroscopy of total DNA
• 4.5.3. Results of PCR products detecting Tm-2 gene
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kháng Thể Virus Đốm Thuốc Lá Cà Chua

Nghiên cứu về kháng thể đối với bệnh virus đốm thuốc lá trên cà chua là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Bệnh virus này gây ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng cà chua, một loại cây trồng quan trọng trên toàn thế giới. Việc tìm kiếm và phát triển các phương pháp phòng bệnh virus hiệu quả là vô cùng cần thiết để đảm bảo nguồn cung cà chua ổn định và an toàn. Các nhà nghiên cứu khoa học đã và đang nỗ lực tìm kiếm các giống cà chua kháng bệnh thông qua nhiều phương pháp, trong đó có việc sử dụng dấu ấn DNA. Phương pháp này hứa hẹn mang lại những giải pháp bền vững và thân thiện với môi trường trong việc bảo vệ thực vật.

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu kháng bệnh virus

Việc nghiên cứu kháng bệnh virus trên cà chua có ý nghĩa to lớn trong việc giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh hại cà chua gây ra. Bệnh virus đốm thuốc lá có thể làm giảm năng suất cà chua đáng kể, ảnh hưởng đến thu nhập của người nông dân và nguồn cung cho thị trường. Nghiên cứu này cũng góp phần vào việc phát triển nền nông nghiệp bền vững, giảm sự phụ thuộc vào các loại thuốc trừ sâu hóa học, đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Hơn nữa, việc hiểu rõ hơn về cơ chế kháng bệnh ở cà chua sẽ mở ra những hướng đi mới trong công tác cải thiện giống và phát triển giống mới.

1.2. Ứng dụng dấu ấn DNA trong chọn tạo giống cà chua

Dấu ấn DNA là một công cụ mạnh mẽ trong sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc giống và chọn tạo giống cà chua. Kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học xác định các gen kháng bệnh tiềm năng trong các giống cà chua khác nhau. Bằng cách phân tích vật liệu di truyền của cà chua, các marker DNA có thể được sử dụng để xác định các cá thể mang gen kháng bệnh, giúp rút ngắn thời gian và chi phí trong quá trình phát triển giống mới. Ứng dụng công nghệ sinh học này mang lại hiệu quả cao trong việc tạo ra các giống cà chua kháng bệnh với năng suất và chất lượng tốt.

II. Thách Thức Bệnh Virus Đốm Thuốc Lá Trên Cà Chua Hiện Nay

Bệnh virus đốm thuốc lá (TMV) là một trong những bệnh virus gây hại nghiêm trọng nhất trên cà chua. Virus gây hại này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra những thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng quả. Các triệu chứng của bệnh bao gồm đốm vàng trên lá, quả bị biến dạng và giảm kích thước. Việc phòng trừ bệnh hại này gặp nhiều khó khăn do virus có khả năng tồn tại lâu trong môi trường và dễ dàng lây lan qua các dụng cụ nông nghiệp, hạt giống và thậm chí là qua tay người. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ bệnh virus hiệu quả và bền vững là một thách thức lớn đối với sản xuất cà chua.

2.1. Tác động của bệnh virus đến năng suất và chất lượng cà chua

Bệnh virus đốm thuốc lá gây ra những tác động tiêu cực đến năng suất cà chua và chất lượng cà chua. Cây bị nhiễm bệnh thường phát triển kém, lá bị biến dạng, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp. Quả cà chua có thể bị nhỏ, méo mó, màu sắc không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Trong trường hợp nhiễm bệnh nặng, toàn bộ vụ mùa có thể bị thất thu. Điều này gây ra những thiệt hại kinh tế lớn cho người nông dân và ảnh hưởng đến nguồn cung cà chua cho thị trường. Do đó, việc kiểm soát bệnh virus là yếu tố then chốt để đảm bảo sản xuất nông nghiệp hiệu quả.

2.2. Các phương pháp phòng trừ bệnh virus truyền thống và hạn chế

Các phương pháp phòng trừ bệnh virus truyền thống thường bao gồm việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, vệ sinh đồng ruộng và luân canh cây trồng. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu có thể gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Virus cũng có thể phát triển khả năng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các biện pháp phòng trừ. Vệ sinh đồng ruộng và luân canh cây trồng có thể giúp giảm thiểu sự lây lan của virus, nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm bệnh. Do đó, cần có những giải pháp phòng trừ bệnh hại mới, hiệu quả và bền vững hơn.

III. Phương Pháp Phát Hiện Gen Kháng Bệnh Virus Đốm Lá Cà Chua

Để giải quyết thách thức từ bệnh virus đốm thuốc lá, việc phát hiện virus và xác định các gen kháng bệnh trong cà chua là vô cùng quan trọng. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau để phân tích DNA và xác định các marker DNA liên kết với gen kháng bệnh. Các phương pháp này bao gồm kỹ thuật PCR, giải trình tự gen và phân tích dấu ấn DNA. Việc xác định được các gen kháng bệnh sẽ giúp các nhà cải thiện giống tạo ra các giống cà chua kháng bệnh một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.1. Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phát hiện gen kháng bệnh

Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là một công cụ mạnh mẽ trong sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể. Trong nghiên cứu về kháng bệnh thực vật, kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện virus và xác định sự hiện diện của các gen kháng bệnh trong vật liệu di truyền của cà chua. Bằng cách thiết kế các mồi đặc hiệu cho các gen kháng bệnh, các nhà nghiên cứu có thể xác định các cá thể cà chua mang gen này một cách nhanh chóng và chính xác. Kỹ thuật PCR là một công cụ không thể thiếu trong công tác sàng lọc giống và chọn tạo giống.

3.2. Phân tích dấu ấn DNA và vai trò trong chọn giống cà chua

Phân tích dấu ấn DNA là một phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để xác định sự khác biệt về di truyền giữa các cá thể cà chua. Các marker DNA, như RAPD, SCAR, và SNP, được sử dụng để tạo ra các dấu ấn di truyền đặc trưng cho từng cá thể. Bằng cách so sánh các dấu ấn DNA này, các nhà nghiên cứu có thể xác định các giống cà chua có gen kháng bệnh và các đặc tính nông học mong muốn. Phân tích dấu ấn DNA giúp tăng tốc quá trình chọn giống và cải thiện giống, đồng thời giảm thiểu sự phụ thuộc vào các phương pháp đánh giá kiểu hình truyền thống.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Giống Cà Chua Kháng Bệnh Nhờ Dấu Ấn DNA

Nghiên cứu sử dụng dấu ấn DNA đã mang lại những kết quả quan trọng trong việc xác định các giống cà chua kháng bệnh. Các nhà nghiên cứu đã tiến hành khảo sát trên nhiều giống cà chua khác nhau và xác định được một số giống có khả năng kháng bệnh cao đối với bệnh virus đốm thuốc lá. Các giống cà chua kháng bệnh này có tiềm năng lớn trong việc cải thiện năng suất cà chua và giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu. Kết quả nghiên cứu này mở ra những triển vọng mới trong công tác phát triển nông nghiệp bền vững.

4.1. Xác định các giống cà chua mang gen kháng bệnh Tm 2

Một trong những kết quả quan trọng của nghiên cứu là việc xác định các giống cà chua mang gen kháng bệnh Tm-2. Gen này được biết đến với khả năng kháng bệnh đối với nhiều chủng virus đốm thuốc lá. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR và các marker DNA liên kết với gen Tm-2, các nhà nghiên cứu đã xác định được một số giống cà chua có chứa gen này. Các giống cà chua này có tiềm năng lớn trong việc phòng bệnh virus và cải thiện năng suất.

4.2. Đánh giá đặc tính nông học của các giống cà chua kháng bệnh

Ngoài việc xác định gen kháng bệnh, nghiên cứu cũng tập trung vào việc đánh giá các đặc tính nông học của các giống cà chua kháng bệnh. Các đặc tính như năng suất, chất lượng quả, khả năng thích nghi với điều kiện môi trường khác nhau được đánh giá kỹ lưỡng. Kết quả cho thấy một số giống cà chua kháng bệnh không chỉ có khả năng kháng bệnh tốt mà còn có năng suất và chất lượng quả cao. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của các giống cà chua này trong việc cải thiện sản xuất cà chua.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Triển Vọng Của Nghiên Cứu Này

Nghiên cứu về kháng thể đối với bệnh virus đốm thuốc lá trên cà chua bằng dấu ấn DNA có nhiều ứng dụng thực tiễn và triển vọng trong tương lai. Các kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển giống mới, cải thiện quy trình sản xuất cà chua và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường. Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp sẽ góp phần vào việc xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả.

5.1. Phát triển giống cà chua kháng bệnh và năng suất cao

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của nghiên cứu này là việc phát triển giống mới cà chua kháng bệnh và có năng suất cao. Bằng cách sử dụng các marker DNA để sàng lọc giống và chọn tạo giống, các nhà cải thiện giống có thể tạo ra các giống cà chua có khả năng kháng bệnh tốt và đồng thời có năng suất và chất lượng quả cao. Các giống cà chua này sẽ giúp người nông dân giảm thiểu thiệt hại do bệnh virus gây ra và tăng thu nhập.

5.2. Giải pháp quản lý dịch hại tổng hợp và bền vững

Nghiên cứu này cũng góp phần vào việc xây dựng các giải pháp quản lý dịch hại tổng hợp và bền vững. Bằng cách sử dụng các giống cà chua kháng bệnh, người nông dân có thể giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học và các biện pháp phòng trừ bệnh hại truyền thống. Điều này giúp bảo vệ môi trường và sức khỏe con người, đồng thời đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Quản lý dịch hại tổng hợp là một phương pháp tiếp cận toàn diện, kết hợp nhiều biện pháp khác nhau để kiểm soát dịch hại một cách hiệu quả và bền vững.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Kháng Bệnh Virus Cà Chua Tương Lai

Nghiên cứu về kháng thể đối với bệnh virus đốm thuốc lá trên cà chua bằng dấu ấn DNA đã mở ra những hướng đi mới trong công tác phòng trừ bệnh hại và cải thiện giống. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng bệnh của cà chua và phát triển các marker DNA chính xác hơn. Đồng thời, cần tăng cường hợp tác giữa các nhà khoa học, người nông dân và doanh nghiệp để đưa các kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn, góp phần vào sự phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam.

6.1. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng bệnh ở cà chua

Để phát triển giống mới cà chua kháng bệnh hiệu quả hơn, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng bệnh ở cà chua. Điều này bao gồm việc xác định các gen và protein liên quan đến kháng bệnh, cũng như hiểu rõ hơn về tương tác virus-cây trồng. Nghiên cứu về miễn dịch học thực vật sẽ giúp các nhà khoa học tìm ra những phương pháp mới để tăng cường khả năng kháng bệnh của cà chua.

6.2. Hợp tác nghiên cứu và chuyển giao công nghệ cho nông dân

Để đưa các kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn, cần tăng cường hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học, người nông dân và doanh nghiệp. Các nhà khoa học cần chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm với người nông dân, đồng thời lắng nghe những phản hồi từ thực tế sản xuất. Doanh nghiệp cần đầu tư vào nghiên cứu và phát triển và chuyển giao công nghệ cho người nông dân. Sự hợp tác chặt chẽ giữa các bên sẽ giúp đẩy nhanh quá trình phát triển nông nghiệp bền vững và hiệu quả.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Lycopersicon esculentum) là một trong những loại cây rau ăn quả có giá trị kinh tế và dinh dưỡng hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Quả cà chua là nguồn cung cấp dồi dào các loại vitamin (A, C, E), khoáng chất (canxi) và các hợp chất chống oxy hóa tự nhiên (lycopene, carotene, polyphenol). Trong cơ cấu nông nghiệp hiện đại, diện tích canh tác và sản lượng cà chua không ngừng gia tăng nhằm phục vụ nhu cầu tiêu thụ tươi và công nghiệp chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, quá trình sản xuất cà chua thương phẩm phải đối mặt với nhiều áp lực từ dịch bệnh, trong đó bệnh khảm lá do virus khảm thuốc lá (Tobacco Mosaic Virus - TMV) và virus khảm cà chua (Tomato Mosaic Virus - ToMV) thuộc chi Tobamovirus là những tác nhân gây hại nguy hiểm nhất. Bệnh làm cây còi cọc, biến dạng lá, giảm khả năng quang hợp, làm biến đổi hình dạng và màu sắc quả, dẫn đến sụt giảm năng suất từ 20% đến mất trắng nếu không có biện pháp ngăn chặn kịp thời.

Biện pháp kiểm soát bệnh do virus phổ biến hiện nay vẫn là phun thuốc hóa học phòng trừ vector truyền bệnh kết hợp vệ sinh đồng ruộng. Dù vậy, phương pháp hóa học tiềm ẩn nhiều rủi ro lớn như gây ô nhiễm môi trường, tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong nông sản, làm suy giảm chất lượng đất và gây hại cho sức khỏe con người cũng như vật nuôi. Do đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học để chọn tạo các giống cà chua mang gen kháng tự nhiên đối với virus khảm thuốc lá được xem là giải pháp căn cơ, an toàn sinh học và bền vững nhất. Thay vì thực hiện các phương pháp lây nhiễm nhân tạo tốn kém thời gian và phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh, việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS) cho phép sàng lọc, nhận diện chính xác các nguồn gen kháng (Tm-1, Tm-2, Tm-2^2) ở giai đoạn sớm với độ chính xác cao.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học với đề tài: “Investigation of resistance to tobacco mosaic virus disease on tomato by DNA marker” (Khảo sát tính kháng bệnh virus khảm thuốc lá trên cây cà chua bằng chỉ thị DNA) đã được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện và đánh giá nguồn vật liệu di truyền cà chua có năng suất, phẩm chất tốt, đồng thời mang gen kháng bệnh virus khảm thuốc lá (Tm-2) phục vụ công tác chọn tạo giống.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học quan trọng cấu thành năng suất và chất lượng của tập đoàn các mẫu giống cà chua trong điều kiện đồng ruộng.
  2. Sử dụng các chỉ thị phân tử DNA chuyên biệt để nhận diện gen kháng bệnh virus khảm thuốc lá (Tm-2) trong tập đoàn giống nghiên cứu thông qua kỹ thuật PCR.
  3. Tuyển chọn các mẫu giống triển vọng kết hợp hài hòa giữa đặc tính nông học vượt trội và khả năng kháng bệnh phục vụ chương trình chọn giống tiếp theo.
• Đối tượng nghiên cứu: 20 mẫu giống cà chua được thu thập và lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng.
• Phạm vi nghiên cứu: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022 tại Bộ môn Sinh học phân tử & Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; thí nghiệm đồng ruộng và vườn ươm được bố trí tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng (Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và khung phân loại dịch hại

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử của chi Tobamovirus, đại diện là TMV và ToMV. Virion của TMV có cấu trúc hình que đặc trưng với kích thước khoảng 300 nm × 15 nm, cấu tạo gồm một phân tử ARN mạch đơn dương (+ssRNA) dài khoảng 6.400 nucleotide được bao bọc bởi 2.130 đến 2.140 tiểu đơn vị protein vỏ (Coat Protein - CP). Hệ gen của virus mã hóa 4 loại protein chức năng: hai protein liên quan đến phức hệ sao chép (126 kDa và 183 kDa RdRP), protein vận chuyển (Movement Protein - MP 30 kDa) giúp phức hệ virus di chuyển qua cầu sinh chất (plasmodesmata), và protein vỏ (CP 17,5 kDa) tham gia bao gói và vận chuyển đường dài qua mạch rây. Virus lây lan mạnh mẽ qua tiếp xúc cơ giới, vết thương hở và tồn tại bền vững trong tàn dư thực vật hoặc vỏ hạt.

Về di truyền tính kháng, ba gen kháng chính đã được xác định ở các loài cà chua hoang dại gồm: Tm-1 (nguồn gốc từ Solanum habrochaites, định vị trên nhiễm sắc thể số 5), Tm-2 và alen Tm-2^2 (nguồn gốc từ Solanum peruvianum, nằm gần tâm động trên nhiễm sắc thể số 9). Gen Tm-2 quy định tính kháng đối với các chủng TMV/ToMV chủng 0 và 1, trong khi Tm-2^2 kháng được các chủng 0, 1 và 2.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu kết hợp hai nhóm phương pháp chính: đánh giá hình thái nông học ngoài đồng ruộng và phân tích sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        QUY TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI                                |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  1. Bố trí đồng ruộng:                                                           |
|     - 20 giống cà chua (QCVN 01-63/2011/BNNPTNT)                                  |
|     - Mật độ 3,3 vạn cây/ha; Phân bón: 20 tấn chuồng + 600kg Lân + 300kg Urê...   |
|  2. Theo dõi Nông sinh học:                                                       |
|     - Thời gian sinh trưởng (ngày ra hoa, ngày chín quả)                          |
|     - Hình thái cây, thân, lá, chùm hoa, tỷ lệ đậu quả, khối lượng quả, năng suất|
|  3. Phân tích Sinh học phân tử:                                                   |
|     - Thu mẫu lá non sáng sớm -> Tách DNA tổng số bằng CTAB cải tiến              |
|     - Đo OD NanoDrop (A260/A280, A260/A230) & Điện di kiểm tra DNA                |
|     - Phản ứng PCR với 4 cặp mồi chuyên biệt (Tm2RS-2, Tm2RS-3, Tm2S-1, Tm2S-2)   |
|     - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm RedSafe, soi UV             |
|  4. Tổng hợp & Tuyển chọn:                                                        |
|     - Phân tích thống kê bằng Excel -> Chọn mẫu giống ưu tú mang gen Tm-2         |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Phương pháp đánh giá nông sinh học: Thực hiện theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-63/2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống cà chua. Thí nghiệm bố trí hàng cách hàng 60 cm, cây cách cây 40 cm (mật độ tương đương 3,3 vạn cây/ha). Nền phân bón tính trên 1 ha gồm: 20 tấn phân chuồng, 600 kg super lân, 300 kg urê, 280 kg kali clorua. Các chỉ tiêu theo dõi gồm thời gian sinh trưởng (ngày gieo hạt: 09/08/2022, ngày trồng: 13/09/2022; ngày ra hoa đầu; ngày quả chín đợt đầu), đặc điểm thân, lá (màu sắc, hình dạng lá), kiểu hình sinh trưởng (hữu hạn, bán hữu hạn, vô hạn), cấu trúc phát hoa, tỷ lệ đậu quả (%), khối lượng quả trung bình và năng suất cá thể.
• Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Thu mẫu lá non vào sáng sớm, nghiền 0,1 g mô lá trong 800 µl đệm tách chiết CTAB (gồm 0,5 g CTAB, 1 g EDTA, 2,5 g Tris base, 5 g NaCl trong 100 ml nước cất khử trùng, bổ sung 10 µl 2-mercaptoethanol/1 ml đệm trước khi dùng). Quy trình tinh sạch sử dụng hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) và Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), kết tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối lạnh và rửa tủa bằng ethanol 70%, hòa tan tủa trong 100 µl đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).
• Phương pháp kiểm tra chất lượng DNA và kỹ thuật PCR: Nồng độ và độ sạch của DNA được đánh giá qua đo quang phổ NanoDrop (tỷ lệ hấp thụ A260/A280 và A260/A230) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Phản ứng PCR sử dụng 4 cặp mồi chuyên biệt định danh gen Tm-2 được thiết kế dựa trên các công bố của Shi et al. (2011).

Tên cặp mồi	Gen đích	Trình tự mồi (5' - 3')	Kích thước phân đoạn (bp)	Chu trình nhiệt PCR
Tm2RS-f2 Tm2RS-r2	Tm-2	TGCCAAACAAATTGGACTGA AAGCACGAATTTCATGGTCC	750	94°C (30s) / 58°C (30s) / 72°C (75s) – 38 chu kỳ
Tm2RS-f3 Tm2RS-r3	Tm-2	TGGAGGGGAATATTTGTGGA ACTTCAGACAACCCATTCGG	750	94°C (30s) / 57°C (30s) / 72°C (75s) – 38 chu kỳ
Tm2S-f1 Tm2S-r1	Tm-2	CAGTGATCCGAGTGAGCAAA TTCCGATAAACTGATTCCG	300	94°C (30s) / 56°C (30s) / 72°C (75s) – 36 chu kỳ
Tm2S-f2 Tm2S-r2	Tm-2	CTTCCTTCTGGTGTTTTGGG CAGAACCTTTAGCGCCTTTG	300	94°C (30s) / 58°C (30s) / 72°C (75s) – 36 chu kỳ

---

Nội dung chính theo từng chương

CHAPTER I: INTRODUCTION

Chương mở đầu trình bày vị trí kinh tế, giá trị dinh dưỡng của cây cà chua trên quy mô toàn cầu và tại Việt Nam. Tác giả chỉ ra trở ngại lớn trong sản xuất do virus khảm thuốc lá (TMV/ToMV) gây suy giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng thương phẩm. Chương này nhấn mạnh tính cấp thiết của việc áp dụng chỉ thị phân tử DNA trong công tác sàng lọc gen kháng Tm-2, đồng thời xác định rõ ràng mục đích, đối tượng và các nội dung nghiên cứu trọng tâm của khóa luận.

CHAPTER II: LITERATURE REVIEW

Chương tổng quan tài liệu hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

• Nguồn gốc, giá trị dinh dưỡng và đặc điểm thực vật học của cây cà chua: Phân tích nguồn gốc xuất xứ từ dãy Andes và khu vực Mexico; cấu trúc hình thái rễ chùm ăn sâu, thân thảo hóa gỗ, lá kép lông chim, hoa lưỡng tính tự thụ phấn và quả mọng nhiều ngăn.
• Tình hình sản xuất cà chua thế giới và Việt Nam: Dẫn liệu thống kê từ FAO (2020) cho thấy sản lượng cà chua toàn cầu đạt 186,82 triệu tấn trên diện tích 5,05 triệu ha (Trung Quốc dẫn đầu với 64,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ 20,5 triệu tấn, Hoa Kỳ 12,2 triệu tấn). Tại Việt Nam, diện tích duy trì từ 23.000 - 25.000 ha với sản lượng đạt trên 660.000 tấn, tập trung nhiều nhất ở Lâm Đồng (~7.000 ha).
• Bệnh khảm thuốc lá (TMV/ToMV) trên cà chua: Cơ chế truyền bệnh, chu trình nhân lên của hạt virus trong tế bào chất, sự tích lũy protein vỏ và di chuyển hệ thống qua mạch rây.
• Tình hình nghiên cứu tính kháng và chỉ thị phân tử: Lịch sử phát hiện nguồn gen kháng từ loài hoang dại (S. hirsutum, S. peruvianum, S. habrochaites), quá trình phát triển các chỉ thị RAPD, SCAR, CAPS và Tetra-primer ARMS-PCR gắn với các alen Tm-1, Tm-2, Tm-2^2.

CHAPTER III: RESEARCH MATERIALS AND METHODS

Chương này mô tả chi tiết vật liệu gồm 20 mẫu giống cà chua mang mã số từ 1 đến 20 (gồm các giống: 3-2, 11-3, 5-8, 10-10(2), 5-10×2-4, 2-5, 3-1, 13-7, 6-6(2), 11-9, 9-4, 14-3(1), 7-9, 10-4(2), 6-9(1), 14-5(1), 6-6, 5-9, 12-2, 14-12) do Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng cung cấp. Chương này trình bày chi tiết kỹ thuật canh tác đồng ruộng, phương pháp đo đếm các chỉ tiêu hình thái - nông học theo QCVN 01-63/2011/BNNPTNT, quy trình tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến, thành phần phản ứng PCR (Master mix 2X, Primer 0,5 µl, DNA mẫu 1 µl, nước khử nuclease 3 µl), chương trình nhiệt PCR tối ưu cho từng cặp mồi và phương pháp phân tích điện di gel agarose 1%.

CHAPTER IV: RESULTS AND DISCUSSION

Chương kết quả và thảo luận trình bày toàn bộ các dẫn liệu thực nghiệm thu được:

• Đặc điểm nông sinh học và giai đoạn sinh trưởng: Thời gian từ trồng đến ra hoa đầu dao động từ 39 đến 54 ngày (sớm nhất là mẫu 10-10(2) với 39 ngày; muộn nhất là mẫu 6-6(2) với 54 ngày). Thời gian quả chín đợt đầu dao động từ 92 đến 116 ngày (sớm nhất là mẫu 10-10(2) với 92 ngày; muộn nhất là mẫu 12-2 với 116 ngày).
• Đặc điểm hình thái và cấu trúc thân lá: Toàn bộ 20 mẫu giống đều có dạng lá kép (pinna). Về màu sắc lá, có 2 nhóm: xanh (G) và xanh đậm (DG). Dạng tán cây thuộc nhóm 1 (cao, tán rộng) và nhóm 2 (cao, tán hẹp). Đa số các mẫu thuộc kiểu hình sinh trưởng bán hữu hạn (semi-finite), riêng 2 mẫu số 8 (13-7) và 13 (7-9) thuộc kiểu hình sinh trưởng vô hạn.
• Đặc điểm cấu trúc phát hoa, tỷ lệ đậu quả và năng suất: 100% mẫu giống có dạng chùm hoa đơn (simple) và đặc tính nở hoa tập trung (focus). Tỷ lệ đậu quả dao động từ 56,88% đến trên 80%. Số quả trên cây biến động từ 10 đến 30 quả. Khối lượng quả và năng suất cá thể cho phép phân nhóm các giống có tiềm năng năng suất cao (>1.500 g/cây) như các giống số 5, 6, 8, 16.
• Kết quả tách chiết DNA và kiểm tra độ sạch: Điện di kiểm tra DNA tổng số cho thấy các băng DNA sắc nét, không bị đứt gãy. Kết quả đo quang phổ NanoDrop cho nồng độ DNA cao (ví dụ mẫu 3-2 đạt 702 ng/µl) cùng tỷ lệ A260/A280 đạt chuẩn độ sạch phục vụ PCR.
• Kết quả khuếch đại gen kháng Tm-2 bằng PCR:
  • Mồi Tm2RS-2 (750 bp): phát hiện 2 mẫu dương tính (mẫu 10: 11-9 và mẫu 14: 10-4(2)).
  • Mồi Tm2RS-3 (750 bp): phát hiện 1 mẫu dương tính (mẫu 10: 11-9).
  • Mồi Tm2S-1 (300 bp): phát hiện 12 mẫu dương tính (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19).
  • Mồi Tm2S-2 (300 bp): phát hiện 10 mẫu dương tính (mẫu 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16).
• Tuyển chọn giống triển vọng: Kết hợp giữa phân tích kiểu gen kháng và các chỉ tiêu nông học ưu tú (dạng hình bán hữu hạn, tỷ lệ đậu quả cao, năng suất ổn định), hai giống 11-9 (tỷ lệ đậu quả 58,85%) và 10-4 (2) (tỷ lệ đậu quả 58,13%) đã được chọn lọc là nguồn vật liệu khởi đầu triển vọng nhất.

CHAPTER V: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

Tác giả tóm tắt hai kết luận chính: (1) Sàng lọc PCR đã xác định được 12 mẫu giống mang các phân đoạn gen kháng virus khảm thuốc lá; (2) Tuyển chọn được 2 giống ưu tú nhất là 11-9 và 10-4 (2). Đồng thời, tác giả đưa ra 3 kiến nghị: mở rộng khảo nghiệm đánh giá năng suất và chất lượng các giống triển vọng trên diện rộng; sử dụng các dòng mang gen kháng làm nguồn vật liệu lai tạo; tiếp tục nghiên cứu phát triển thêm các chỉ thị phân tử để phát hiện toàn diện các nguồn gen kháng khác.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chi tiết từ thực nghiệm

Kết quả phân tích phân tử bằng 4 cặp mồi chuyên biệt để nhận diện sự có mặt của gen kháng Tm-2 trên 20 mẫu giống cà chua được tổng hợp chi tiết trong bảng dưới đây:

STT	Tên mẫu giống	Mồi Tm2RS-2 (750 bp)	Mồi Tm2RS-3 (750 bp)	Mồi Tm2S-1 (300 bp)	Mồi Tm2S-2 (300 bp)	Đánh giá mang gen kháng Tm-2
1	3-2	-	-	-	-	Không
2	11-3	-	-	-	-	Không
3	5-8	-	-	+	+	Có
4	10-10 (2)	-	-	+	+	Có
5	5-10 x 2-4	-	-	+	+	Có
6	2-5	-	-	+	+	Có
7	3-1	-	-	+	+	Có
8	13-7	-	-	+	+	Có
9	6-6(2)	-	-	-	-	Không
10	11-9	+	+	+	+	Có (Đặc biệt)
11	9-4	-	-	-	-	Không
12	14-3 (1)	-	-	+	+	Có
13	7-9	-	-	-	-	Không
14	10-4 (2)	+	-	+	+	Có (Đặc biệt)
15	6-9 (1)	-	-	-	-	Không
16	14-5 (1)	-	-	+	+	Có
17	6-6	-	-	-	-	Không
18	5-9	-	-	+	-	Có
19	12-2	-	-	+	-	Có
20	14-12	-	-	-	-	Không

Ghi chú: (+) Cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu; (-) Không xuất hiện băng sản phẩm.

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Đóng góp học thuật: Nghiên cứu đã chuẩn hóa quy trình phân tích kiểu gen kháng bệnh TMV/ToMV trên cây cà chua bằng kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi chuyên biệt gắn với locus Tm-2, chứng minh tính hiệu quả của phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) so với các phương pháp đánh giá bệnh truyền thống.
• Đóng góp thực tiễn: Khóa luận đã sàng lọc trong tập đoàn 20 mẫu giống lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, xác định chính xác 12 mẫu giống có chứa chỉ thị phân tử kháng bệnh và tuyển chọn được 2 mẫu giống ưu tú nhất là 11-9 và 10-4 (2). Đây là nguồn vật liệu di truyền quý giá, có thể trực tiếp đưa vào các chương trình lai tạo giống cà chua kháng virus năng suất cao tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của đề tài: Nghiên cứu chỉ được thực hiện trong phạm vi một vụ thu đông (từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2022) tại một địa điểm duy nhất. Do thời gian gieo trồng có phần muộn, một số chỉ tiêu về tổng năng suất thu hoạch cuối vụ và số quả trên cây chưa phản ánh hết tiềm năng tối đa của các giống sinh trưởng vô hạn kéo dài. Ngoài ra, nghiên cứu mới chỉ tập trung sàng lọc sự hiện diện của locus gen Tm-2 mà chưa mở rộng sang các gen kháng bổ trợ khác như Tm-1 hay Tm-2^2.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  1. Tiến hành khảo nghiệm diện rộng hai dòng triển vọng (11-9 và 10-4 (2)) qua nhiều mùa vụ và tại các vùng sinh thái sinh trưởng khác nhau để đánh giá tính ổn định di truyền và khả năng thích ứng.
  2. Sử dụng hai dòng triển vọng này làm bố mẹ trong các tổ hợp lai hữu tính nhằm chuyển gen kháng Tm-2 vào các giống cà chua thương phẩm có chất lượng cao nhưng mẫn cảm với virus.
  3. Mở rộng thiết kế các bộ mồi phân tử (như CAPS, SCAR, SNP) để định danh đồng thời các gen và alen kháng khác (Tm-1, Tm-2^2), xây dựng bản đồ di truyền phục vụ chọn giống đa kháng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền & Chọn giống cây trồng, Nông học, Khoa học cây trồng và Bảo vệ thực vật.
• Phần nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình tách chiết DNA tổng số cải tiến từ mô lá cây họ Cà (Solanaceae) bằng phương pháp CTAB cho độ tinh sạch cao, loại bỏ hiệu quả polyphenol và polysaccharide.
  • Bộ thông số chu trình nhiệt PCR và nồng độ hóa chất tối ưu cho 4 cặp mồi chuyên biệt nhận diện gen Tm-2 (Tm2RS-2, Tm2RS-3, Tm2S-1, Tm2S-2).
  • Hệ thống tiêu chí đánh giá nông sinh học đồng ruộng chuẩn hóa theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-63/2011/BNNPTNT.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mục tiêu trọng tâm của khóa luận này là gì?

Khóa luận tập trung đánh giá đặc tính nông sinh học của 20 mẫu giống cà chua lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, đồng thời ứng dụng kỹ thuật PCR với các chỉ thị DNA chuyên biệt để sàng lọc và xác định các giống mang gen kháng Tm-2 chống bệnh virus khảm thuốc lá, từ đó tuyển chọn nguồn vật liệu phục vụ công tác lai tạo giống.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử nào đã được sử dụng để phát hiện gen kháng Tm-2 và kích thước sản phẩm khuếch đại là bao nhiêu?

Tác giả sử dụng kỹ thuật PCR với 4 cặp mồi chuyên biệt: Tm2RS-f2/r2 và Tm2RS-f3/r3 (cho sản phẩm khuếch đại kích thước 750 bp), cùng Tm2S-f1/r1 và Tm2S-f2/r2 (cho sản phẩm khuếch đại kích thước 300 bp). Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% pha đệm 0,5X TAE và nhuộm thuốc nhuộm huỳnh quang RedSafe.

3. Kết quả sàng lọc PCR đã ghi nhận bao nhiêu mẫu giống mang gen kháng?

Trong tổng số 20 mẫu giống khảo sát, phản ứng PCR đã xác định được 12 mẫu giống cho kết quả dương tính với các chỉ thị phân tử kháng bệnh khảm thuốc lá, bao gồm các mẫu: 5-8, 10-10(2), 5-10×2-4, 2-5, 3-1, 13-7, 11-9, 14-3(1), 10-4(2), 14-5(1), 5-9 và 12-2.

4. Hai giống cà chua nào được tác giả tuyển chọn là triển vọng nhất và dựa trên các căn cứ nào?

Hai giống được tuyển chọn là 11-9 (mẫu số 10) và 10-4 (2) (mẫu số 14). Căn cứ tuyển chọn dựa trên sự kết hợp giữa: (1) Kết quả phân tích phân tử dương tính mạnh với các mồi nhận diện gen kháng Tm-2; (2) Đặc tính nông học ưu tú gồm kiểu hình sinh trưởng bán hữu hạn, tỷ lệ đậu quả cao (giống 11-9 đạt 58,85% và giống 10-4(2) đạt 58,13%), cùng khả năng sinh trưởng thân lá khỏe và thích ứng tốt với điều kiện đồng ruộng.

5. Phương pháp tách chiết DNA nào được áp dụng và làm thế nào để kiểm soát độ sạch mẫu lá?

Nghiên cứu áp dụng quy trình tách chiết bằng đệm CTAB cải tiến của Farhad Masoomi-Aladizgeh et al. (2016). Mẫu lá non được thu hái vào sáng sớm trước khi cây bắt đầu quang hợp mạnh nhằm hạn chế tối đa sự tích lũy các sản phẩm quang hợp, đường và tinh bột. Độ sạch và nồng độ của dịch chiết DNA được kiểm định thông qua đo mật độ quang phổ NanoDrop (tỷ lệ A260/A280 đạt từ 1,8 - 2,0) và điện di kiểm tra độ nguyên vẹn trên gel agarose 1%.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Hồng Hải đã thực hiện thành công việc đánh giá toàn diện các chỉ tiêu nông sinh học kết hợp với sàng lọc kiểu gen kháng bệnh virus khảm thuốc lá (Tm-2) trên 20 mẫu giống cà chua bằng chỉ thị DNA. Nghiên cứu đã xác định được 12 mẫu giống mang phân đoạn gen kháng và tuyển chọn thành công 2 giống triển vọng là 11-9 và 10-4 (2) có tỷ lệ đậu quả cao và mang gen kháng đặc hiệu. Kết quả của khóa luận cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác và nguồn vật liệu khởi đầu có giá trị thực tiễn cao cho các chương trình chọn tạo giống cà chua chất lượng và kháng bệnh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------- GRADUATION THESIS TITLE: “INVESTIGATION OF RESISTANCE TO TOBACCO MOSAIC VIRUS DISEASE ON TOMATO BY DNA MARKER” Hanoi - 2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------- GRADUATION THESIS TITLE: “INVESTIGATION OF RESISTANCE TO TOBACCO MOSAIC VIRUS DISEASE ON TOMATO BY DNA MARKER” Student : Nguyen Thi Hong Hai Student’s code : 637410 Class : K63CNSHE Major : Biotechnology Supervisor : Pham Thi Dung, Ph.D Hanoi - 2022 GUARANTEE I hereby declare that this thesis is completely done by my scientific research under the guidance of Mrs. Pham Thi Dung Ph. Faculty of Biotechnology - Vietnam National University of Agriculture. All figures in this thesis are true and do not duplicate the results of any previous graduate report.

The graduation thesis has references to documents, citation information is recorded in the references section. I take responsibility for my promises to the faculty and the university. Hanoi, December 2022 Student Nguyen Thi Hong Hai i Acknowledgments First, in completing this research paper, I received plenty of help, guidance, and encouragement from teachers and friends. First of all, I would like to express my deepest thanks to my supervisor, Mrs.

Pham Thi Dung who has given me suggestions on how to shape the study and has always been most willing and ready to give my valuable advice, helpful comments as well as correction of my research paper. Next, I would like to express my gratitude to all teachers in the Biotechnology faculty- at the Vietnam National University of Agriculture for their lectures for 4,5 years that help me in completing this paper. Besides that, I’m so thankful for all the support and encouragement of Mr. Phan Huu Ton and your employees at the Center for Conservation and Development of Plant Genetic Resources who helped and created the most favorable conditions for me during my thesis.

Last but not least, I would like to thank my family and my friends who have always encouraged, supported, and helped me to complete this paper Hanoi, December 2022 Student Nguyen Thi Hong Hai ii TABLE OF CONTENT GUARANTEE. ii LIST OF TABLES. v LIST OF FIGURES. viii CHAPTER I: INTRODUCTION.

Lỗi! Thẻ đánh dấu không được xác định. Aims and requirements of study. 3 CHAPTER II: LITERATURE REVIEW. Characteristics of tomato plants.

The situation of tomato production in the world and in the country. The situation of tomato production in the world. The situation of tomato production in Vietnam. Tobacco mosaic virus disease on tomato.

Symptoms and signs of disease. The cause to the tobacco mosaic virus disease. Disease Cycle and Epidemiology. Status of research on resistance to tomato mosaic virus disease in tomatoes.

15 CHAPTER III: RESEARCH MATERIALS AND METHODS. Place and time of study. Methods for assessing important agronomic traits. Evaluation of resistance to tomato mosaic virus disease of selected tomato varieties by using molecular markers.

22 CHAPTER IV: RESULTS AND DISCUSSION. Survey on genetic diversity of researched tomato varieties. Growth stages of tomato plants. Results on some structural features.

Investigate the characteristics of inflorescence structure, bloom characteristics, yield, and yield factors. Results of the PCR method to detect the Tm-2 gene in the studied tomato group 4. Test of DNA total. Determination of DNA content by OD spectroscopy of total DNA.

Results of PCR products detecting Tm-2 gene. 35 CHAPTER V: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS. 40 iv LIST OF TABLES Table 2.1 Composition of Dry Matter Content of Tomato5 Table 2. Area harvested, yield, and production over the world of tomatoes .1 Name of tomato varieties stored at the Center for Conservation and Development of Plant Genetic Resources.

PCR reaction components. PCR conditions for different primer pairs. The stages of growth and development of tomatoes. Some growth characteristics, morphological characteristics, and tree structure of the studied varieties.

Some characteristics of inflorescence structure, bloom characteristics, yield and yield factor. Determination of DNA content by OD spectroscopy of total DNA. Selection of promising varieties. 38 v LIST OF FIGURES Figure 2.

Anatomical morphology of tomato stem, flower, fruit. Tomato production of countries in the world in 2020. Tobacco mosaic virus disease on tomato leaf. Signs of tobacco mosaic virus disease on tomato leaf and fruit.

The rod-shaped virus particles of TMV. A single TMV particle. Transcriptional process of TMV. Test of DNA total .2 Results of PCR products detecting Tm-2 gene by primer Tm2RS-2 35 Figure 4.3 Results of PCR products detecting Tm-2 gene by primer Tm2RS-3 36 Figure 4.4 Results of PCR products detecting Tm-2 gene by primer Tm2S-1 .5 Results of PCR products detecting Tm-2 gene by primer Tm2S-2.

37 vi ABBREVIATIONS ToMV Tomato mosaic virus TMV Tobacco virus MAS Marker-assisted selection CAPS Cleaved amplified polymorphic sequence SNP Single nucleotide polymorphism RdRP RNA-dependent RNA polymerase MP The movement protein FAO The Food and Agriculture Organization of the United Nations CP Coat protein RAPD Random amplified polymorphic DNA SCAR Sequence characterized amplified region vii ABSTRACT Tomato mosaic virus (ToMV) is one of the most serious virus diseases not only in tomatoes, but also in many plants, such as cucumber. Infecting ToMV disease, plants always reduce growth, development, and yield. Using pesticide, one of the methods, can control the development of this disease. However, this way can affect tohuman, environmental condition, etc, due to the pesticitide may resist in product and soil.

Finding the resistant genes to ToMV disease from wild tomato type using DNA markers are optimal method. By the way, can reduce time and cost for creating new tomato varieties. From the survey of 20 tomato varieties, some tomato varieties have been drawn with many good agro-biological characteristics, high yield is 5-8, 10-10(2), 5-10 x 2-4, 2-5, 3-1, 13-7, 11-9, 10-4(2), 14-5(1), 5-9, and 12-2. By using DNA markers for research and analysis, two varieties with outstanding agro-biological characteristics and containing genes for resistance to tobacco mosaic virus disease were found such as 11- 9 and 10-4(2).

These two tomato varieties will be used as a prerequisite for the selection process of breeding resistant to tobacco mosaic disease on tomato. viii CHAPTER I: INTRODUCTION 1. Rationale On a worldwide scale, the tomato (Lycopersicon esculentum) continues to increase in importance for consumption as a fresh crop, for inclusion as a major constituent in many prepared foods, and also for research into the fundamental principles of growth and development in plants. Members of the Lycopersicon are tolerant of a wide range of environmental and nutritional conditions.

A few of the species have been crossed to provide a large number of varieties directed towards either the production of a single-harvest field crop or, particularly under protection, a succession of fruit for the fresh market over quite a long timespan. Field tomatoes are amenable to mechanical harvesting through the combined efforts of plant breeders and agricultural engineers, thus allowing vast tonnages to be grown and processed economically. The products are incorporated into a wide range of canned, frozen, preserved, or dried foods. Given their economic importance, and because they are amenable to molecular biology and genetic engineering techniques, tomato fruit has been selected for intense study at the molecular level over the last decade.

However, the tomato production process is still facing many difficulties, one of the causes limiting product development and reducing tomato yield is tobacco mosaic virus disease. Tobacco mosaic virus disease has been studied for a long time, but so far, the disease is still a common pest and greatly affects tomato yield and quality. Many vegetable and ornamental crops can be infected by tobamoviruses. Infections usually give rise to characteristic mosaic symptoms and lead to considerable cosmetic damage and yield losses.

Tobamoviruses, including tobacco and tomato mosaic virus (TMV and ToMV, respectively) belong to the α-like supergroup of viruses. They consist of a characteristic proteinaceous rod comprising 2140 coat protein (CP) copies, which envelop the positive-stranded linear RNA genome. After infection of the plant cell the RNA genome is uncoated and the viral gene products, the RNA-dependent RNA polymerase 1 (RdRP), the movement protein (MP), and the coat protein (CP), are produced. Infection of neighboring cells commences with the movement of RNA-MP complexes through plasmodesmata with MP-induced altered size exclusion limits.

Long-distance transport of the virus proceeds through the vascular tissue and depends both on MP and CP. Tobamoviruses, especially TMV, are the classical model system for the study of virus infection in plants (Mamidala & Nanna, 2009). Currently, disease control is still mainly by chemical methods. However, the abuse of chemical drugs has caused consequences such as environmental pollution, creating resistance to pests and diseases, and affecting human and livestock health.

Therefore, finding effective safety measures to prevent tobacco mosaic virus disease is one of the urgent issues today. Breeding new varieties with genetic resistance to tobacco mosaic virus disease is the most effective way to minimize the damage. Therefore, the efficient use of new resistance genes by breeders is essential. Researchers have identified tobacco mosaic virus disease resistance genes for decades, including Tm-1, Tm-2, Tm-22 in wild tomato species (Pelham, 1965).

Today, in plant breeding, the selection method thanks to molecular markers linked to the target genes have become an effective tool that can quickly, early, and accurately select traits regardless of the environment. Although some tomato lines resistant to late blight have been selected, the results are still very limited and need to be further researched. Starting from the above basis, to serve the selection and breeding of tomato varieties carrying tobacco mosaic virus disease resistance genes, we conducted the project: " Investigation of resistance to tobacco mosaic virus disease on tomato by DNA marker. Aims and requirements of the study 1.1 Aims Detecting genetic resources to identify tomato varieties with good yield and quality, containing genes for resistance to tobacco mosaic virus disease for breeding program.

Requirements - Evaluation of some important agrobiological traits in tomato corporations. - Using molecular markers to identify tobacco mosaic virus disease resistance genes in tomato consortium. 3 CHAPTER II: LITERATURE REVIEW 2.1 The origin of tomato Almost all tomato cultivars are members of the Lycopersicon esculentum species. The beginnings and the early events of domestication are mostly unknown, much like with domesticated plants in general.

Three things are certain enough to be fairly assumed. First off, all related wild tomato species are endemic to the Andean area, which today includes parts of Chile, Colombia, Ecuador, Bolivia, and Peru. This means that the cultivated tomato is a New World invention. Second, before being brought to Europe, the tomato was domesticated to a very advanced state.

Early herbals' woodcut illustrations show that the first varieties grown in Europe produced big fruit. The fruit (in all wild species) is tiny. The descriptions indicated that a good number of sizes, forms, and colors were known. Third, the most likely ancestor, the wild cherry tomato (L.

esculentum variety cerasiforme), is spontaneous throughout tropical and subtropical America and has spread throughout the Tropics of the Old World(Pelham, 1965). The time, place, and other aspects of domestication are far less certain. Mexico is likely the region of domestication, even though concrete evidence is absent. This is supported by the weight of data from a variety of fields.

Hereditary enzyme comparisons show much greater similarity between older European cultivars and the indigenous cherry tomatoes of Mexico and Central America than between European cultivars and the indigenous plants of the Andes, which is unquestionably the genus Lycopersicon's distribution center and the other potential domestication region. Portions of the tomato plant have not been discovered in the archaeological remains of the Andean region, but parts of the majority of the locally cultivated plants have. Neither have representations of the tomato been discovered in ancient pottery or other artifacts from the region.