Khóa luận Dược sĩ: Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.225

Nghiên cứu tiềm năng kháng sinh từ chủng Streptomyces 184.225, phân lập hoạt chất sinh học và đánh giá khả năng ứng dụng trong y học hiện đại.

• Tác giả: Nguyễn Kim Oanh
• Người hướng dẫn: PGS. Cao Văn Thu
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.225
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Streptomyces 184

Streptomyces 184.225 là một chủng xạ khuẩn có khả năng sản xuất kháng sinh cao, được xem là một trong những chủng vi sinh vật quan trọng trong lĩnh vực dược phẩm. Chủng này thuộc chi Streptomyces, được biết đến là nguồn tạo ra nhiều hợp chất kháng sinh có giá trị y tế. Nghiên cứu về kháng sinh từ Streptomyces 184.225 được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nộidưới sự hướng dẫn của PGS. Cao Văn Thu, nhằm khám phá tiềm năng tạo ra các chất kháng sinh mới. Chủng xạ khuẩn Streptomyces 184 sở hữu đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng đặc biệt, cho phép nó phát triển tối ưu trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau, từ đó tăng năng suất sản xuất kháng sinh. Việc nghiên cứu sâu về chủng này không chỉ góp phần nâng cao kiến thức về vi sinh vật mà còn mở ra cơ hội phát triển các thuốc kháng sinh mới để đối phó với vấn đề đề kháng kháng sinh ngày càng trầm trọng.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của xạ khuẩn Streptomyces

Streptomyces là một chi xạ khuẩn có đặc điểm hình thái độc đáo với sự hình thành hyphae và mầm bào. Tế bào xạ khuẩn này là gram dương, có thành tế bào chứa peptidoglycan và axit mycolic đặc trưng. Cấu tạo tế bào của Streptomyces bao gồm sợi hyphae phân nhánh, giúp nó thích nghi với môi trường đất và các điều kiện khác nhau. Khả năng sản xuất các chất chuyên biệt là kết quả của cấu trúc sinh học phức tạp này.

1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng 184.225

Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 184.225 được xác định thông qua hoạt tính kháng sinh cao. Chủng này có thể sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, từ các hợp chất họ actinomycin đến các loại thuốc kháng khuẩn khác. Quá trình lên men sinh tổng hợp được tối ưu hóa bằng cách chọn lọc các yếu tố dinh dưỡng phù hợp, đặc biệt là hydrat carbon, giúp tăng năng suất sản xuất đáng kể.

II. Phương pháp cải tạo giống và tuyển chọn chủng

Cải tạo giống Streptomyces 184.225 là bước quan trọng để nâng cao khả năng sản xuất kháng sinh. Quá trình này bao gồm sàng lọc ngẫu nhiên để chọn các chủng có hoạt tính kháng sinh (HTKS) cao nhất. Phương pháp đột biến được áp dụng, bao gồm đột biến hóa học (ĐBHH) và đột biến UV (ĐBUV), nhằm tạo ra các biến chủng với năng suất kháng sinh được cải thiện. Bảo quản giống xạ khuẩn là bước thiết yếu để duy trì tính ổn định và khả năng sản xuất của chủng. Việc sử dụng giống cải tạo không chỉ tăng hiệu suất mà còn đảm bảo chất lượng của các kháng sinh thu được. Các nghiên cứu chứng minh rằng chủng đã được cải tạo có thể sản xuất kháng sinh với hàm lượng cao hơn đáng kể so với chủng ban đầu.

2.1. Sàng lọc chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao

Sàng lọc ngẫu nhiên là phương pháp hiệu quả để tìm kiếm các chủng với hoạt tính kháng sinh vượt trội. Quá trình này sử dụng phương pháp khuếch tán để đánh giá khả năng chống lại các chủng vi khuẩn kiểm tra. Các chủng được chọn dựa trên đường kính trung bình (D̅) của vòng ức chế, những chủng có hoạt tính cao nhất được giữ lại cho bước cải tạo tiếp theo.

2.2. Đột biến và nâng cao năng suất sản xuất

Đột biến hóa học và đột biến UV được sử dụng để tạo ra các biến chủng cải thiện. Sau khi đột biến, các chủng được sàng lọc lại để xác định những chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt hơn. Kết quả cho thấy các chủng đã qua cải tạo giống có năng suất kháng sinh cao hơn chủng ban đầu, đóng góp quan trọng cho việc sản xuất kháng sinh hiệu quả.

III. Quá trình lên men và chiết tách kháng sinh

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh là giai đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất kháng sinh từ Streptomyces 184.225. Lên men chìm được thực hiện trong điều kiện kiểm soát để tối ưu hóa điều kiện phát triển của xạ khuẩn và tổng hợp kháng sinh. Việc chọn lựa môi trường lên men phù hợp, đặc biệt là nguồn hydrat carbon chính xác, là chìa khóa để đạt năng suất cao. Sau khi lên men, dịch thường chứa kháng sinh thô cần được chiết tách bằng dung môi hữu cơ (DMHC). Cô quay chân không được sử dụng để thu kháng sinh thô, sau đó tiếp tục tinh chế bằng sắc ký để loại bỏ các chất tạp. Phương pháp kết tinh cuối cùng giúp thu được kháng sinh tinh khiết với độ thuần khiết cao.

3.1. Chọn lựa điều kiện lên men tối ưu

Môi trường lên men được lựa chọn dựa trên khả năng phát triển xạ khuẩn và sản xuất kháng sinh. Hydrat carbon là yếu tố quyết định, các loại khác nhau cho kết quả năng suất khác nhau. Lên men chìm cho phép kiểm soát tốt hơn các yếu tố như pH, nhiệt độ và độ aeration so với lên men trên bề mặt, từ đó tăng hiệu suất tổng hợp kháng sinh.

3.2. Chiết tách tinh chế và kết tinh kháng sinh

Chiết kháng sinh từ dịch lên men sử dụng dung môi hữu cơ để tách kháng sinh từ các thành phần khác. Cô quay chân không loại bỏ dung môi và tạo ra kháng sinh thô. Sắc ký được sử dụng để tinh chế và tách các thành phần khác nhau. Phương pháp kết tinh cuối cùng đảm bảo thu được kháng sinh tinh khiết với độ purity cao, sẵn sàng cho các nghiên cứu cấu trúc.

IV. Xác định cấu trúc và ứng dụng kháng sinh

Xác định cấu trúc kháng sinh thu được từ Streptomyces 184.225 sử dụng các phương pháp phổ học hiện đại. Phổ UV-VIS cung cấp thông tin về nhóm chức hấp thụ ánh sáng, giúp xác định các hợp chất thơm. Phổ hồng ngoại (IR) tiết lộ các liên kết hóa học và nhóm chức đặc trưng như C=O, C-H, N-H. Phổ khối lượng (MS) xác định khối lượng phân tử và cấu trúc phân tử. Phổ cộng hưởng từ hạn nhân (NMR), bao gồm COSY, DEPT, HMBC, cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử và vị trí các nguyên tử. Các kháng sinh được phát hiện từ chủng Streptomyces 184.225 thuộc các họ khác nhau như actinomycin, với hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là chống lại các chủng gram dương và gram âm. Phát triển thuốc kháng sinh mới từ chủng này là giải pháp quan trọng cho vấn đề đề kháng kháng sinh.

4.1. Phương pháp phổ học xác định cấu trúc

Phổ UV-VIS giúp phát hiện các hệ thống liên hợp trong kháng sinh. Phổ hồng ngoại cho biết sự hiện diện của các nhóm chức quan trọng. Phổ khối lượng xác định khối lượng phân tử chính xác, trong khi NMR cung cấp bản đồ cấu trúc chi tiết, cho phép các nhà nghiên cứu xác định công thức phân tử và cấu trúc không gian của kháng sinh thu được.

4.2. Hoạt tính kháng sinh và tiềm năng ứng dụng

Hoạt tính kháng sinh của các hợp chất từ Streptomyces 184.225 được kiểm tra chống lại vi khuẩn kiểm tra gram dương và gram âm. Nhiều kháng sinh được phát hiện có hoạt tính cao, tương tự hoặc vượt trội so với kháng sinh tiêu chuẩn. Các hợp chất kháng sinh mới từ chủng này có tiềm năng phát triển thành thuốc kháng sinh hiệu quả, giải quyết vấn đề đề kháng ngày càng trầm trọng trong y học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đại cương về kháng sinh 1. Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những chất chuyển hóa vi sinh vật hay chất tương đồng bán tổng hợp, tổng hợp; hoặc chất tổng hợp không liên quan đến những chất thiên nhiên, ở liều nhỏ các chất này ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc sự phát triển và sống sót của vi sinh vật mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật. Phân loại Các kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học, từ đó chúng có chung một cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự.

Một số họ (hoặc nhóm) kháng sinh chính: - Nhóm  lactam (các penicillin và các cephalosporin) - Nhóm aminosid hay aminoglycoside: Streptomycin, gentamicin,… - Nhóm phenicol: chloramphenicol - Nhóm tetracyclin: Tetracyclin, doxycyclin - Nhóm macrolid và lincosamid: Erythromycin, clarithromycin,… - Nhóm quinolone: Ciprofloxacin, ofloxacin,… - Nhóm 5 – nitro – imidazol: Metronidazol,… - Nhóm sulfonamid - Nhóm peptid: Vancomycin, polymycin,…[2, 16, 19] 1. Cơ chế tác dụng của kháng sinh Có 5 cơ chế chính: [3, 16, 19] (Hình PH.1) - Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: -lactam, vancomycin,. - Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: polyen, amphotericin,… - Ức chế tổng hợp ADN của vi khuẩn: actinomycin, antracyclin,… - Ức chế chuyển hóa: Trimethoprim, Sulfonamid,… - Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: macrolid,… 1. Vấn đề đề kháng kháng sinh Có 2 kiểu kháng thuốc của vi sinh vật: kháng thuốc tự nhiên và kháng mắc phải.[3, 24] 2 - Vi khuẩn đã có tính kháng từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh, như sản xuất  lactamase, cấu trúc của thành vi khuẩn không thấm với kháng sinh, dạng này gọi là kháng thuốc tự nhiên.

- Kháng mắc phải: vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh, sau một thời gian tiếp xúc, trở thành không nhạy cảm nữa, do đột biến nhiễm sắc thể hoặc kháng qua plasmid. Loại kháng mắc phải thường là do dùng kháng sinh không đúng liều hoặc lạm dụng thuốc, đang gây một trở ngại rất lớn cho việc điều trị.[16] Theo WHO, trong năm 2016, có 490.000 người đã phát triển bệnh lao kháng đa thuốc trên toàn cầu và kháng thuốc đang bắt đầu làm phức tạp cuộc chiến chống HIV và sốt rét. Kháng kháng sinh là một vấn đề phức tạp ảnh hưởng đến tất cả xã hội và được thúc đẩy bởi nhiều yếu tố kết nối. Chính vì vậy, cần có sự đổi mới và đầu tư lớn hơn trong nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng khuẩn mới, vắc-xin và các công cụ chẩn đoán.

Đại cương về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn G (+), có tỷ lệ G + C > 55%. Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 66% là do xạ khuẩn tạo ra. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn.

Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt, không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyển được khuẩn lạc. Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,2 – 1,0µm đến 2 – 3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: màu da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng, xám,… Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh.

3 Đối với xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu – đơn hoặc kép, và xoắn lò xo. Bào tử trần (conidiospore) của họ xạ khuẩn này có các hình dạng: hình cầu, hình ellipsoid – bầu dục, hình que, hình trụ,… là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn này. Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông, … [1, 3, 5, 8, 13, 15] 1.

Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn Cấu tạo tế bào xạ khuẩn chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia làm 4 nhóm, trong đó xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa L–DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin. Một số khóa phân loại của xạ khuẩn Có khá nhiều khóa phân loại được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển như: khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Krassilnhikov (Nga), khóa phân loại của Gauze,… Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) đã được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử và khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon.

Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, chúng có thể khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích 22 – 32°C, pH tối thích 6,8 – 7,5.

Streptomyces có khả năng sinh nhiều loại sắc tố khác nhau: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 184.225 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. 4 Chủng xạ khuẩn phát triển tốt trên môi trường MT2. Trong khóa luận của Ngô Thanh Huyền thực hiện năm 2015, tác giả tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn trên MT ISP2 sau 14 ngày cho kết quả hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử xạ khuẩn Streptomyces 184.225: khuẩn ty khí sinh có màu vàng, có sắc tố hòa tan, chuỗi bào tử thẳng hơi cong, bề mặt bào tử nhẵn.[11] Trong khóa luận của Trần Thị Huế thực hiện năm 2016, tác giả lựa chọn dung môi chiết xuất là Ethylacetat tại pH = 7.

Sau quá trình tinh chế, kết tinh thu được 3 kháng sinh tinh khiết, trong đó KS1 là chất chính. Bước đầu sơ bộ xác định cấu trúc các kháng sinh: KS1 dự kiến là actinomycin X2, KS2 dự kiến là actinomycin D. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1. Mục đích Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm: [4, 12] - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.

- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn. - Chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn. - Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20 – 30% những cá thể khác.

Cần chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Đột biến cải tạo giống Cho các VSV chịu tác động của các tác nhân gây đột biến mạnh như tác nhân hóa học: dimethylsulphat, ethylenimin, HNO2, … tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X,… phần lớn các VSV bị giết chết. Trong số các cá thể sống sót xuất hiện nhiều dạng đột biến do thay đổi nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng dẫn đến làm mất (giảm) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh (đột biến dương tính). 5 Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính và dung hợp tế bào trần.

Bảo quản giống xạ khuẩn Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị nhiễm tạp bởi các VSV lạ. Các phương pháp bảo quản chủng VSV: bảo quản trong tủ lạnh 2 – 4°C (định kỳ cấy truyền trong môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Trong phòng thí nghiệm để giữ giống xạ khuẩn thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2°C và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.

Khái niệm lên men Lên men là sự chuyển hóa carbonhydrat và một vài hợp chất hữu cơ khác thành những chất mới dưới tác dụng của enzym do VSV gây ra, mục đích chính là chuyển hóa cơ chất trong môi trường dinh dưỡng thành các sản phẩm cần thiết nhờ VSV. Phương pháp lên men Có 2 phương pháp lên men nuôi cấy vi sinh vật:  Phương pháp lên men bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt dựa trên cơ sở nuôi cấy mốc trên các lớp môi trường mỏng tiếp xúc tốt với không khí. - Ưu điểm: tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối môi trường, tốn ít điện năng, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, điều kiện vô trùng không cần tuyệt đối. - Nhược điểm: khó cơ giới hóa, tự động hóa do đó năng suất thấp, tốn nhiều lao động thủ công, cần diện tích nuôi lớn.[2, 15, 17]  Phương pháp lên men chìm Vi sinh vật được nuôi cấy trong các bình lên men với môi trường lỏng vô khuẩn, khuấy cùng cấp khí vô trùng liên tục.