Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long bằng vi khuẩn bacillus licheniformis d7.

• Tác giả: Hồ Nguyễn Hoàng Yến
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Ẩn
• Trường học: Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây thanh long bằng Bacillus licheniformis D7
• Loại tài liệu: báo cáo tổng kết đề tài khoa học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: THÔNG TIN CHUNG
• 1.1. Thông tin tổng quát
• 1.2. Kết quả nghiên cứu
• 1.2.1. Đặt vấn đề
• 1.2.2. Khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
• 1.2.3. Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 1.2.4. Tác động của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự sinh trưởng của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 1.2.5. Tác động của chủng Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum
• 1.2.6. Hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do Neoscytalidium dimidiatum gây ra của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7
• 1.3. Đánh giá các kết quả đạt được và kết luận
• 1.4. Tóm tắt kết quả

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum

Nấm Neoscytalidium dimidiatum là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cây thanh long, dẫn đến thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng. Việc nghiên cứu khả năng ức chế của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với nấm này là rất cần thiết. Bacillus licheniformis D7 được biết đến với khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh tự nhiên, có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây hại. Nghiên cứu này không chỉ giúp bảo vệ cây thanh long mà còn hướng tới một nền nông nghiệp bền vững.

1.1. Đặc điểm của nấm Neoscytalidium dimidiatum

Nấm Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long. Nấm này có khả năng xâm nhập và gây hại cho nhiều loại cây trồng khác nhau, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.2. Tầm quan trọng của Bacillus licheniformis D7

Bacillus licheniformis D7 là một vi khuẩn Gram dương, có khả năng sản sinh nhiều enzyme và chất kháng sinh tự nhiên. Vi khuẩn này có thể ức chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn gây bệnh, góp phần bảo vệ cây trồng một cách hiệu quả và thân thiện với môi trường.

II. Vấn đề bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra là một trong những thách thức lớn nhất đối với ngành trồng thanh long. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm giá trị thương phẩm của sản phẩm. Việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học không chỉ tốn kém mà còn gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp sinh học hiệu quả để kiểm soát bệnh này.

2.1. Tác động của bệnh đốm nâu đến năng suất

Bệnh đốm nâu làm giảm năng suất cây thanh long, gây thiệt hại lớn cho nông dân. Sự xuất hiện của bệnh này có thể dẫn đến mất mùa và ảnh hưởng đến thu nhập của người trồng.

2.2. Nguyên nhân gây ra bệnh đốm nâu

Nguyên nhân chính gây ra bệnh đốm nâu là do điều kiện khí hậu ẩm ướt, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum. Việc thâm canh cao và mở rộng diện tích trồng cũng làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế nấm

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp khoa học hiện đại nhằm đánh giá khả năng ức chế của Bacillus licheniformis D7 đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum. Các thí nghiệm được thiết kế để kiểm tra sự phát triển của nấm trong điều kiện khác nhau khi có sự hiện diện của vi khuẩn này.

3.1. Phương pháp khuếch tán giếng thạch

Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng mốc của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7. Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum.

3.2. Khảo sát sự nảy mầm của bào tử nấm

Nghiên cứu cũng tiến hành khảo sát sự nảy mầm của bào tử nấm khi có sự hiện diện của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7. Kết quả cho thấy sự ức chế rõ rệt ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế nấm

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum. Các thí nghiệm cho thấy sự giảm thiểu đáng kể mức độ bệnh đốm nâu trên cây thanh long khi sử dụng dịch nuôi cấy này.

4.1. Hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm

Dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 đã chứng minh khả năng ức chế sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum, với đường kính vòng kháng lên đến 28 mm.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng Bacillus licheniformis D7 trong sản xuất chế phẩm sinh học, giúp kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long một cách hiệu quả và bền vững.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Bacillus licheniformis D7 có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum, mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm sinh học trong nông nghiệp. Việc áp dụng các biện pháp sinh học sẽ giúp bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã xác định được khả năng ức chế của Bacillus licheniformis D7 đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum, góp phần bảo vệ cây thanh long và nâng cao năng suất.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học từ Bacillus licheniformis D7 để ứng dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp, nhằm kiểm soát hiệu quả các bệnh do nấm gây ra.

Nội dung chính

Đánh Giá Tiềm Năng Ức Chế Nấm Đốm Nâu (Neoscytalidium dimidiatum) Trên Cây Thanh Long Của Chủng Vi Khuẩn Bacillus licheniformis D7

---

Tóm tắt nghiên cứu (200-250 từ)

Bệnh đốm nâu (hay còn gọi là bệnh đốm trắng, tắc kè) do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra là một trong những dịch hại nguy hiểm nhất, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả thanh long tại Việt Nam. Nghiên cứu tập trung giải quyết câu hỏi: Liệu dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng, ức chế sự sinh trưởng của nấm mốc N. dimidiatum và ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long hay không?

Nghiên cứu được triển khai thông qua quy trình thực nghiệm đa tầng: từ đánh giá hoạt tính in vitro bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, phân tích động học nảy mầm của bào tử và hình thái hệ sợi tơ nấm dưới kính hiển vi quang học, đến thử nghiệm hiệu lực sinh học in vivo trên mô hình cành và quả thanh long lây nhiễm nhân tạo.

Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 thể hiện hoạt tính kháng nấm vượt trội với đường kính vòng ức chế đạt 28,9 mm. Dịch vi khuẩn gây ức chế và làm biến dạng hoàn toàn bào tử nấm mốc sau 4–8 giờ, làm đứt gãy và phân hủy hệ sợi tơ nấm sau 12–24 giờ phối trộn. Trên mô hình thực tế, dịch nuôi cấy vi khuẩn D7 đã bảo vệ hoàn toàn thân cây thanh long khỏi sự xâm nhiễm của nấm mốc trong suốt 21 ngày theo dõi và làm chậm triệu chứng thối nhũn trên quả thanh long đến 2 ngày. Đây là minh chứng khoa học quan trọng cho thấy B. licheniformis D7 là ứng viên tiềm năng hàng đầu để phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật bền vững.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (300-350 từ)

Thanh long (Hylocereus spp.) là cây ăn quả nhiệt đới có giá trị kinh tế và kim ngạch xuất khẩu hàng đầu của ngành nông nghiệp Việt Nam, với diện tích canh tác hàng chục nghìn hecta và sản lượng vượt mốc 1,2 triệu tấn/năm. Tuy nhiên, điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tại các vùng chuyên canh trọng điểm như Bình Thuận, Long An, Tiền Giang đã tạo môi trường lý tưởng cho các loại nấm bệnh bùng phát. Trong đó, bệnh đốm nâu do nấm túi Neoscytalidium dimidiatum gây ra từ năm 2008 đến nay đã trở thành mối đe dọa nghiêm trọng nhất, gây tổn thương loét mục thân cành, thối nhũn vỏ và ruột quả, dẫn đến thiệt hại kinh tế nặng nề cho nhà vườn.

Trước tình hình dịch bệnh lây lan phức tạp, tập quán thâm canh hiện nay vẫn phụ thuộc nặng nề vào các loại thuốc trừ nấm hóa học tổng hợp. Việc lạm dụng hóa chất không chỉ làm gia tăng nguy cơ kháng thuốc ở nấm bệnh mà còn để lại tồn dư độc hại trong nông sản, làm suy thoái hệ vi sinh vật đất, ô nhiễm nguồn nước và cản trở thanh long Việt Nam vượt qua các rào cản kỹ thuật khắt khe (tiêu chuẩn VietGAP, GlobalGAP, MRLs) khi xuất khẩu sang các thị trường khó tính như Hoa Kỳ, EU, Nhật Bản.

Xu hướng nông nghiệp hiện đại đòi hỏi các giải pháp phòng trừ sinh học (Biocontrol) thân thiện với môi trường, an toàn cho sức khỏe con người. Trong các nhóm vi sinh vật đối kháng, Bacillus licheniformis nổi bật với khả năng sinh nội bào tử bền nhiệt, thích nghi tốt với điều kiện môi trường khắc nghiệt và có hoạt tính sinh học phong phú (tiết enzyme phá vách tế bào như chitinase, glucanase, protease và các hợp chất peptide/lipopeptide kháng nấm). Việc phân lập và kiểm chứng thực nghiệm chủng B. licheniformis D7 đáp ứng trực tiếp khoảng trống nghiên cứu về giải pháp sinh học đặc trị nấm N. dimidiatum tại Việt Nam.

---

Methodology và approach (350-400 từ)

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm kiểm chứng từ ống nghiệm đến mô hình mô thực vật sống, bảo đảm tính logic khoa học và độ tin cậy thực nghiệm cao:

[Phân lập & Định danh Phân tử 16S/18S rRNA]
[Khảo sát In Vitro: Vòng vô khuẩn khuếch tán giếng thạch]
[Động học Bào tử & Sợi tơ: Soi kính hiển vi 4h, 8h, 12h, 24h & Cấy trải PGA]
[Thực nghiệm In Vivo: Tiêm nhiễm 200µL trên thân cành và quả thanh long (21 ngày)]

1. Phân lập và định danh phân tử

• Chủng nấm mốc HY phân lập từ cành thanh long nhiễm bệnh tại Bình Thuận được định danh bằng hình thái và giải trình tự gen 18S-rRNA (tương đồng 100% với Neoscytalidium dimidiatum CBS 251.49, bootstrap 98%).
• Chủng vi khuẩn D7 phân lập từ đất tại TP.HCM được định danh qua thử nghiệm sinh hóa (Gram (+), hình thành nội bào tử, catalase (+)) và giải trình tự gen 16S-rRNA (tương đồng cao với Bacillus licheniformis RT8, bootstrap 100%).

2. Khảo sát hoạt tính đối kháng In Vitro

• Phương pháp khuếch tán giếng thạch: Dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 sau khi ly tâm kép (13.000 rpm, 4°C, 15 phút) loại bỏ sinh khối được đưa vào các giếng thạch trên đĩa môi trường PGA có cấy trải huyền phù nấm N. dimidiatum. Đo đường kính vòng phân giải vô khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy.

3. Đánh giá tác động lên bào tử và hệ sợi tơ nấm

• Khảo sát nảy mầm và sức sống bào tử: Phối trộn dịch nuôi cấy D7 và dịch bào tử nấm ($10^6$ bào tử/mL) theo 3 tỷ lệ thể tích (0,5:1; 1:1; 2:1). Đánh giá sự nảy mầm qua kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000X) ở các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ; đồng thời cấy trải lên đĩa PGA để kiểm tra khả năng phục hồi khuẩn lạc sau 3 ngày.
• Khảo sát hệ sợi tơ: Bào tử nấm được tiền ủ 4 giờ trong môi trường PGB để phát triển hệ sợi tơ non trước khi phối trộn với dịch vi khuẩn theo các tỷ lệ tương tự, theo dõi biến đổi hình thái sợi nấm theo thời gian.

4. Đánh giá hiệu lực phòng bệnh In Vivo

• Thực hiện tiêm 200 $\mu$L hỗn hợp dịch vi khuẩn và dịch bào tử nấm (ủ trước 24 giờ) vào thân cành và quả thanh long ở độ sâu đồng nhất 0,5 cm. Bố trí đầy đủ các nghiệm thức đối chứng âm (môi trường LB, dịch vi khuẩn đơn lẻ) và đối chứng dương (dịch bào tử nấm thuần). Theo dõi tiến trình khởi phát bệnh, đo đạc đường kính vết loét và thối nhũn liên tục trong 21 ngày ở điều kiện 30–35°C. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập.

---

Phát hiện chính (400-450 từ)

Nghiên cứu đã ghi nhận 5 phát hiện cốt lõi minh chứng hiệu lực sinh học của Bacillus licheniformis D7:

Chỉ số / Thí nghiệm	Đối chứng (N. dimidiatum)	Xử lý Dịch B. licheniformis D7	Ý nghĩa sinh học
Vòng đối kháng giếng thạch	0 mm	28,9 mm	Hoạt tính kháng nấm cao hơn đáng kể so với mức trung bình (21,33 mm)
Tỷ lệ nảy mầm bào tử	Nảy mầm mạnh mẽ sau 4h, tạo sợi phân nhánh ở 24h	Bị ức chế hoàn toàn, bào tử biến dạng nặng ở tỷ lệ 1:1 và 2:1	Ngăn chặn giai đoạn khởi đầu của chu trình xâm nhiễm
Sức sống bào tử (cấy trải)	Khuẩn lạc phát triển kín đĩa sau 3 ngày	Bào tử mất hoàn toàn khả năng mọc khuẩn lạc sau 4–8h tiếp xúc	Khả năng tiêu diệt bào tử triệt để, không đơn thuần là kìm hãm
Cấu trúc hệ sợi tơ nấm	Sợi tơ dài, vách ngăn đều, phân nhánh dày	Tơ nấm bị biến dạng, mỏng vách và đứt gãy hoàn toàn sau 12–24h	Tác động phá hủy cấu trúc màng/thành tế bào nấm
Hiệu lực trên thân cành (21 ngày)	Xuất hiện vết hoại tử, thối thủng sâu tạo hốc	100% không phát bệnh ở cả 3 tỷ lệ phối trộn	Ngăn chặn hoàn toàn sự xâm lấn của nấm trên mô thân
Hiệu lực trên quả thanh long	Vết thối nhũn lan rộng nhanh chóng sau 24–48h	Làm chậm khởi phát bệnh 48h, giảm rõ rệt diện tích và độ sâu vết thối	Giảm thiểu tổn thất chất lượng thương phẩm sau thu hoạch

Phân tích chi tiết:

1. Hoạt tính khuếch tán in vitro cực mạnh: Vòng vô khuẩn 28,9 mm cho thấy dịch nuôi cấy D7 chứa hàm lượng dồi dào các hoạt chất kháng nấm ngoại bào có khả năng khuếch tán tự do trong thạch agar.
2. Biến đổi tế bào học sâu sắc: Dưới kính hiển vi quang học, bào tử nấm tiếp xúc với dịch vi khuẩn bị co rút chất nguyên sinh, vách tế bào biến dạng dị thường. Hệ sợi tơ nấm bị ngừng kéo dài, xuất hiện hiện tượng ly giải và đứt gãy từng đoạn sau 12 giờ, chứng tỏ sự hiện diện của các enzyme phân giải cấu trúc glucan/chitin hoặc các lipopeptide gây rối loạn tính thấm màng sinh chất.
3. Hiệu lực bảo vệ mô thực vật thực tế: Trên cành thanh long, chủng D7 ngăn ngừa triệt để hiện tượng ăn sâu tạo vết loét màng ghẻ. Trên quả thanh long, mức độ giảm thiểu thối nhũn tỷ lệ thuận với nồng độ dịch vi khuẩn, khẳng định tiềm năng ứng dụng linh hoạt trong cả giai đoạn canh tác lẫn xử lý bảo quản nông sản.

---

Đóng góp khoa học (250-300 từ)

• Đóng góp lý thuyết: Bổ sung dẫn liệu khoa học mới về phổ đối kháng của loài Bacillus licheniformis đối với nấm gây bệnh thực vật nhiệt đới; cụ thể hóa cơ chế ức chế đa phương thức (tác động đồng thời lên quá trình nảy mầm của bào tử lẫn sự phát triển của hệ sợi tơ) đối với chi nấm túi khó trị Neoscytalidium.
• Cải tiến phương pháp luận: Xây dựng quy trình sàng lọc và đánh giá tác động kháng nấm chuẩn hóa, tích hợp định danh phân tử đa gen (16S-rRNA và 18S-rRNA) kết hợp mô hình kiểm chứng in vivo trực tiếp trên các bộ phận chuyên biệt của cây thanh long (thân cành và quả).
• Ứng dụng thực tiễn: Cung cấp nguồn giống vi sinh vật bản địa thuần chủng B. licheniformis D7 có hoạt lực mạnh, tạo nền tảng công nghệ để nghiên cứu công thức hóa chế phẩm sinh học (Bio-fungicide) dạng lỏng hoặc dạng bột nội bào tử ứng dụng ngoài đồng ruộng.
• Tác động chính sách & Môi trường: Góp phần hiện thực hóa định hướng chiến lược của ngành nông nghiệp về giảm thiểu thuốc bảo vệ thực vật hóa học, nâng cao giá trị chuỗi cung ứng thanh long Việt Nam đáp ứng tiêu chuẩn nông nghiệp sạch và xuất khẩu bền vững.

---

Đối tượng quan tâm (200-250 từ)

1. Nhà nghiên cứu học thuật (Vi sinh vật học, Bệnh học thực vật, Công nghệ sinh học):

   • Nắm bắt cơ sở thực nghiệm về hoạt tính kháng nấm của nhóm vi khuẩn Bacillus.
   • Khai thác trình tự dữ liệu phân tử và quy trình thử nghiệm lây nhiễm mô hình cây ăn quả.

2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học & Nông dược:

   • Tiếp cận nguồn chủng vi sinh vật tiềm năng để tối ưu hóa quy trình lên men quy mô pilot/công nghiệp.
   • Phát triển dòng sản phẩm thuốc trừ nấm sinh học chuyên biệt cho cây ăn quả nhiệt đới.

3. Hợp tác xã, Trang trại & Người trồng thanh long:

   • Tiếp cận giải pháp sinh học an toàn, giảm chi phí xử lý hóa chất độc hại, hạn chế hiện tượng kháng thuốc của nấm bệnh.
   • Nâng cao tỷ lệ quả đạt chuẩn loại 1, bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm xuất khẩu.

4. Cơ quan quản lý nông nghiệp & Khuyến nông:

   • Tham khảo dữ liệu khoa học để xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây thanh long tại các địa phương chuyên canh.

---

FAQ (Câu hỏi thường gặp) (250-300 từ)

1. Phát hiện quan trọng nhất của đề tài là gì?

Phát hiện then chốt là dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng ức chế 100% bệnh đốm nâu trên mô hình thân cây thanh long suốt 21 ngày và tạo vòng vô khuẩn in vitro lên đến 28,9 mm, vượt trội so với nhiều chủng Bacillus bản địa khác từng được công bố.

2. Phương pháp nghiên cứu của đề tài có điểm gì đặc biệt?

Nghiên cứu không chỉ dừng lại ở thử nghiệm giếng thạch in vitro thông thường mà khảo sát sâu động học vi thể (biến dạng bào tử và đứt gãy sợi tơ theo các mốc 4h, 8h, 12h, 24h) và kiểm chứng trực tiếp in vivo trên cả mô hình cành lẫn quả thanh long tươi.

3. Kết quả này có thể áp dụng mở rộng (generalize) được không?

Có. Do B. licheniformis là loài hình thành nội bào tử có sức sống bền bỉ và cơ chế đối kháng tiết enzyme/lipopeptide phổ rộng, chủng D7 có tiềm năng ứng dụng kiểm soát nhiều loại nấm bệnh thực vật khác như Colletotrichum spp. (thán thư), Fusarium spp., Rhizoctonia spp.

4. Những bước nghiên cứu tiếp theo (Next Steps) là gì?

Cần tinh sạch và phân tích cấu trúc hoạt chất kháng nấm chính (sử dụng HPLC, MS, NMR), tối ưu hóa môi trường lên men thu sinh khối nội bào tử mật độ cao, và tiến hành khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng.

5. Khả năng ứng dụng thực tế thương mại như thế nào?

Chủng D7 có thể được phối chế thành chế phẩm sinh học dạng dung dịch phun phòng trừ nấm ngoài vườn cây hoặc dạng bột hòa nước xử lý rửa quả thanh long sau thu hoạch nhằm kéo dài thời gian bảo quản.

---

Kết luận (150 từ)

Đề tài nghiên cứu đã chứng minh một cách toàn diện và thuyết phục khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis D7 đối với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long. Bằng việc làm biến dạng cấu trúc bào tử, phá hủy hệ sợi tơ nấm và ngăn chặn hoàn toàn triệu chứng bệnh trên thân cành, B. licheniformis D7 khẳng định vị thế là một tác nhân sinh học đầy hứa hẹn.

Để đưa kết quả nghiên cứu từ phòng thí nghiệm vào thực tiễn sản xuất, các định hướng tiếp theo cần tập trung nghiên cứu công nghệ tạo chế phẩm sinh học ổn định và khảo nghiệm thực địa. Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp nông dược và nhà vườn quan tâm được khuyến khích đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ nhằm xây dựng giải pháp bảo vệ cây thanh long bền vững và thân thiện với môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thanh long là một loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới quan trọng. Thanh long thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), xuất hiện ở các vùng nhiệt đới bản địa của châu Mỹ Latinh, bao gồm Mexico, Trung và Nam Mỹ. Hiện nay, nó cũng được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước châu Á, như Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines và Trung Quốc [1, 2]. Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất Châu Á, xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới.

Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng nhanh từ 5.512 2 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614. Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới thanh long gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686. Theo thống kê, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [4]. Do đó, việc xuất khẩu thanh long mang lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta.

Tuy nhiên, việc sản xuất thanh long ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn do tác động của biến đổi khí hậu và dịch bệnh như bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [5]. Do khí hậu nhiệt đới ẩm là môi trường phù hợp cho nhiều loại mốc phát triển. Bên cạnh đó là việc mở rộng diện tích, thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển. Từ năm 2008 đến nay, trên thanh long xuất hiện các loại bệnh mới như bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu, bệnh loét gây hư hại trên thân cây và quả thanh long.

Trong đó, bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất [6, 7]. Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [8]. Nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [9], xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [10], bên cạnh đó, chủng nấm mốc này còn gây bệnh trên nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, cây có múi, thanh long,… [11-13]. Hiện nay, xu hướng phát triển của thế giới là hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững.

Tuy nhiên, nấm bệnh gây ra những hậu quả nghiêm trọng, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh đốm nâu do nấm mốc N. dimidiatum gây ra làm ảnh hưởng nặng nề tới năng suất cũng như chất lượng quả thanh long [12]. Việc này gây khó khăn trong việc tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, cũng như ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người nông dân và ngành trồng trọt thanh long. Thuốc diệt nấm hóa học được sử dụng tràn lan trong nông nghiệp có ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh.

Vấn đề cấp bách hiện nay là tìm ra nguyên nhân gây bệnh, từ đó đưa ra các 3 biện pháp phòng trừ hiệu quả. Do đó, việc sử dụng các biện pháp sinh học như các hợp chất đối kháng từ vi sinh vật là một phương pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường. Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt. Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nó có khả năng hình thành nội bào tử.

Những bào tử này có khả năng chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực khác của môi trường. Bacillus licheniformis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme có hoạt tính mạnh như amylase, protease, cellulase, chitinase…, đồng thời, nó cũng có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương và nấm gây bệnh [14]. Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ cho sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp nói chung và ngành trồng thanh long nói riêng ở nước ta. Mục tiêu tổng quát Đánh giá được khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7.

Mục tiêu cụ thể Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc N. dimidiatum bởi chủng B. Khảo sát sự tác động của B. licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử N.

Khảo sát sự tác động của B. licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ N. 4 Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do N. dimidiatum gây ra của chủng B.

Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Kiểm tra hoạt tính kháng mốc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PGA [15]. Nội dung 2: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]. Kiểm tra sự sinh trưởng của bào tử nấm mốc bằng phương pháp cấy trải trên môi trường PGA. Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB.

Nội dung 3: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc (được nuôi ủ trong môi trường PGB sau 4 giờ) theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]. Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB. Nội dung 4: Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do N. dimidiatum gây ra của B.

licheniformis D7 5 Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành tiêm 200 μL dịch gây bệnh/vết lên thân cây và quả thanh long. Theo dõi thời gian xuất hiện bệnh và mức độ gây bệnh [17]. Với đối chứng (+) là dịch chứa bào tử nấm mốc; đối chứng (-) là môi trường chưa nuôi cấy vi khuẩn và dịch nuôi cấy vi khuẩn; ba tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc (0,5:1, 1:1 và 2:1).

Tổng kết về kết quả nghiên cứu 2. Khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Để chứng minh dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của N. dimidiatum bởi dịch nuôi cấy B. Kết quả được thể hiện như sau (Hình 1): Hình 1.

Khả năng đối kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 6 Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc N. dimidiatum và cho đường kính vòng kháng là 28. Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Sau khi đã chứng minh được dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát đặc điểm kháng mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Đầu tiên, chúng tôi khảo sát tác động của dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc N. Kết quả được thể hiện như sau (Bảng 1 và Hình 2): Nhìn chung, ở đối chứng sau 24 giờ, bào tử nấm mốc nảy mầm tốt, kéo dài, phát triển thành hệ sợi tơ và hình thành vách ngăn. Ở các tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc, bào tử nấm mốc bị ức chế nảy mầm và bị biến dạng nặng sau 24 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 đối với sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau Tỷ lệ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 24 giờ Đối Bào tử bắt đầu Mầm tiếp tục Tơ nấm phát triển Tơ kéo dài, một số chứng nảy mầm, một số kéo dài và hình và kéo dài hình thành vách mầm kéo dài thành tơ ngăn 0,5:1 Bào tử bị ức chế Một số ít bào Mầm kéo dài và Tơ kéo dài, nhưng tử bắt đầu nảy hình thành tơ bị biến dạng, mầm không hình thành vách ngăn 7 1:1 Bào tử bị ức chế Một số ít bào Mầm phát triển Bào tử và mầm bị và biến dạng, tử bắt đầu nảy chậm ức chế và biến một số ít bắt đầu mầm dạng nảy mầm 2:1 Bào tử bị ức chế Bào tử bị biến Bào tử bị biến Bào tử bị biến nảy mầm và bị dạng, một số ít dạng, mầm không dạng nặng biến dạng bắt đầu nảy kéo dài mầm Đối chứng Tỉ lệ 0,5:1 Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 2:1 4 giờ 8 giờ 12 giờ 8 24 giờ Hình 2. Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum Để làm rõ thêm sự tác động của dịch nuôi cấy chủng B. licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử mốc N. dimidiatum, chúng tôi đã cấy trải các hỗn hợp dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc lên đĩa môi trường PGA.

Kết quả thu được như sau (Hình 3): Nhìn chung, ở tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc 0,5:1, bào tử nấm mốc không có khả năng sinh trưởng trên đĩa môi trường sau 8 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn.