Đặt vấn đề Thanh long là một loại cây ăn quả nhiệt đới và cận nhiệt đới quan trọng. Thanh long thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), xuất hiện ở các vùng nhiệt đới bản địa của châu Mỹ Latinh, bao gồm Mexico, Trung và Nam Mỹ. Hiện nay, nó cũng được trồng rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước châu Á, như Malaysia, Việt Nam, Thái Lan, Philippines và Trung Quốc [1, 2]. Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất Châu Á, xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới.
Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng nhanh từ 5.512 2 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha năm 2014 với tổng sản lượng đạt khoảng 614. Theo số liệu ước tính sơ bộ năm 2015, diện tích trồng mới thanh long gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686. Theo thống kê, sản lượng thanh long ở Việt Nam đạt khoảng 1,2 triệu tấn vào năm 2019 và dự kiến sẽ đạt 1,7 triệu tấn vào năm 2025, dự báo tốc độ tăng trưởng đạt 6,0% [4]. Do đó, việc xuất khẩu thanh long mang lại nguồn thu nhập lớn cho nông dân nước ta.
Tuy nhiên, việc sản xuất thanh long ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn do tác động của biến đổi khí hậu và dịch bệnh như bệnh đốm nâu, bệnh nám cành, bệnh thối nhũn, bệnh thán thư, bệnh nấm bồ hóng,… [5]. Do khí hậu nhiệt đới ẩm là môi trường phù hợp cho nhiều loại mốc phát triển. Bên cạnh đó là việc mở rộng diện tích, thâm canh cao đã tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh gây hại phát triển. Từ năm 2008 đến nay, trên thanh long xuất hiện các loại bệnh mới như bệnh đốm trắng, đốm vàng, đốm nâu, bệnh loét gây hư hại trên thân cây và quả thanh long.
Trong đó, bệnh đốm nâu do nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra hậu quả nghiêm trọng nhất [6, 7]. Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botrysphaeriales, họ Botrysphaeriaceae, chi Neoscytalidium [8]. Nó được xác định là tác nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng giống bệnh nấm da ở người [9], xâm nhập và làm viêm phổi dẫn đến cái chết ở cá heo [10], bên cạnh đó, chủng nấm mốc này còn gây bệnh trên nhiều đối tượng thực vật như: cà chua, cây có múi, thanh long,… [11-13]. Hiện nay, xu hướng phát triển của thế giới là hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững.
Tuy nhiên, nấm bệnh gây ra những hậu quả nghiêm trọng, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh đốm nâu do nấm mốc N. dimidiatum gây ra làm ảnh hưởng nặng nề tới năng suất cũng như chất lượng quả thanh long [12]. Việc này gây khó khăn trong việc tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, cũng như ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người nông dân và ngành trồng trọt thanh long. Thuốc diệt nấm hóa học được sử dụng tràn lan trong nông nghiệp có ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm tăng khả năng kháng thuốc của nấm bệnh.
Vấn đề cấp bách hiện nay là tìm ra nguyên nhân gây bệnh, từ đó đưa ra các 3 biện pháp phòng trừ hiệu quả. Do đó, việc sử dụng các biện pháp sinh học như các hợp chất đối kháng từ vi sinh vật là một phương pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường. Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, hình que, ưa nhiệt. Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nó có khả năng hình thành nội bào tử.
Những bào tử này có khả năng chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực khác của môi trường. Bacillus licheniformis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme có hoạt tính mạnh như amylase, protease, cellulase, chitinase…, đồng thời, nó cũng có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương và nấm gây bệnh [14]. Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây ra bệnh đốm nâu trên cây thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7” với mục đích hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ cho sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp nói chung và ngành trồng thanh long nói riêng ở nước ta. Mục tiêu tổng quát Đánh giá được khả năng ức chế nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của vi khuẩn Bacillus licheniformis D7.
Mục tiêu cụ thể Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc N. dimidiatum bởi chủng B. Khảo sát sự tác động của B. licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử N.
Khảo sát sự tác động của B. licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ N. 4 Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do N. dimidiatum gây ra của chủng B.
Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Kiểm tra hoạt tính kháng mốc bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PGA [15]. Nội dung 2: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]. Kiểm tra sự sinh trưởng của bào tử nấm mốc bằng phương pháp cấy trải trên môi trường PGA. Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB.
Nội dung 3: Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự phát triển của hệ sợi tơ Neoscytalidium dimidiatum Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc (được nuôi ủ trong môi trường PGB sau 4 giờ) theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới kính hiển theo các mốc thời gian 4, 8, 12, 24 giờ [16]. Đối chứng được thực hiện tương tự với dịch bào tử nấm mốc nhưng thay thế dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường LB. Nội dung 4: Kiểm tra hiệu quả ngăn ngừa bệnh đốm nâu trên cây và quả thanh long do N. dimidiatum gây ra của B.
licheniformis D7 5 Phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc theo các tỉ lệ 0,5:1, 1:1, 2:1 và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành tiêm 200 μL dịch gây bệnh/vết lên thân cây và quả thanh long. Theo dõi thời gian xuất hiện bệnh và mức độ gây bệnh [17]. Với đối chứng (+) là dịch chứa bào tử nấm mốc; đối chứng (-) là môi trường chưa nuôi cấy vi khuẩn và dịch nuôi cấy vi khuẩn; ba tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc (0,5:1, 1:1 và 2:1).
Tổng kết về kết quả nghiên cứu 2. Khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của Neoscytalidium dimidiatum bởi dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 Để chứng minh dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của N. dimidiatum bởi dịch nuôi cấy B. Kết quả được thể hiện như sau (Hình 1): Hình 1.
Khả năng đối kháng Neoscytalidium dimidiatum của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 6 Kết quả cho thấy dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc N. dimidiatum và cho đường kính vòng kháng là 28. Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum Sau khi đã chứng minh được dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 có khả năng đối kháng với nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum, chúng tôi đã tiến hành khảo sát đặc điểm kháng mốc của dịch nuôi cấy vi khuẩn.
Đầu tiên, chúng tôi khảo sát tác động của dịch nuôi cấy B. licheniformis D7 lên sự nảy mầm của bào tử nấm mốc N. Kết quả được thể hiện như sau (Bảng 1 và Hình 2): Nhìn chung, ở đối chứng sau 24 giờ, bào tử nấm mốc nảy mầm tốt, kéo dài, phát triển thành hệ sợi tơ và hình thành vách ngăn. Ở các tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn và dịch bào tử nấm mốc, bào tử nấm mốc bị ức chế nảy mầm và bị biến dạng nặng sau 24 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn.
Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis D7 đối với sự nảy mầm của bào tử nấm mốc Neoscytalidium dimidiatum ở các tỷ lệ và thời gian khác nhau Tỷ lệ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 24 giờ Đối Bào tử bắt đầu Mầm tiếp tục Tơ nấm phát triển Tơ kéo dài, một số chứng nảy mầm, một số kéo dài và hình và kéo dài hình thành vách mầm kéo dài thành tơ ngăn 0,5:1 Bào tử bị ức chế Một số ít bào Mầm kéo dài và Tơ kéo dài, nhưng tử bắt đầu nảy hình thành tơ bị biến dạng, mầm không hình thành vách ngăn 7 1:1 Bào tử bị ức chế Một số ít bào Mầm phát triển Bào tử và mầm bị và biến dạng, tử bắt đầu nảy chậm ức chế và biến một số ít bắt đầu mầm dạng nảy mầm 2:1 Bào tử bị ức chế Bào tử bị biến Bào tử bị biến Bào tử bị biến nảy mầm và bị dạng, một số ít dạng, mầm không dạng nặng biến dạng bắt đầu nảy kéo dài mầm Đối chứng Tỉ lệ 0,5:1 Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 2:1 4 giờ 8 giờ 12 giờ 8 24 giờ Hình 2. Tác động của dịch nuôi cấy Bacillus licheniformis D7 lên hình thái và khả năng nảy mầm của bào tử Neoscytalidium dimidiatum Để làm rõ thêm sự tác động của dịch nuôi cấy chủng B. licheniformis D7 lên khả năng nảy mầm của bào tử mốc N. dimidiatum, chúng tôi đã cấy trải các hỗn hợp dịch nuôi cấy vi khuẩn phối trộn với dịch bào tử nấm mốc lên đĩa môi trường PGA.
Kết quả thu được như sau (Hình 3): Nhìn chung, ở tỉ lệ phối trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn với dịch bào tử nấm mốc 0,5:1, bào tử nấm mốc không có khả năng sinh trưởng trên đĩa môi trường sau 8 giờ ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn.