Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong cơ thể sống, các gốc tự do (chủ yếu là các gốc oxy hoạt động - ROS và gốc nitơ hoạt động - RNS như $O_2^{\bullet-}$, $HO^{\bullet}$, $RO^{\bullet}$, $LO^{\bullet}$, $LOO^{\bullet}$) được sinh ra liên tục qua các quá trình chuyển hóa nội sinh hoặc do tác động của các yếu tố ngoại sinh bất lợi như ô nhiễm môi trường, bức xạ, tia cực tím và hóa chất độc hại. Ở trạng thái sinh lý bình thường, cơ thể duy trì sự cân bằng động giữa gốc tự do và hệ thống chống oxi hóa. Khi mất cân bằng xảy ra do sự gia tăng quá mức của các gốc tự do, tình trạng stress oxi hóa sẽ xuất hiện, dẫn đến tổn thương cấu trúc màng lipid (peroxid hóa lipid), biến tính protein và tổn hại acid nucleic. Hiện nay, y học đã xác định hơn 60 loại bệnh lý ở người có liên quan trực tiếp đến stress oxi hóa, bao gồm ung thư, bệnh lý tim mạch, xơ vữa động mạch, thoái hóa thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và quá trình lão hóa sớm.

Để hạn chế tác hại của gốc tự do, việc bổ sung các chất chống oxi hóa ngoại sinh là cần thiết. Các chất chống oxi hóa tổng hợp (như BHA, BHT) tiềm ẩn nguy cơ tác dụng phụ, trong khi các chất chiết xuất tự nhiên từ thực vật lại phụ thuộc nhiều vào quỹ đất, điều kiện thời tiết mùa vụ và dễ lẫn tạp chất, dung môi trong quá trình chiết tách. Trong bối cảnh đó, việc khai thác nguồn chất chống oxi hóa từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn có đặc tính probiotic, thể hiện nhiều ưu thế vượt trội: tốc độ sinh trưởng nhanh, quy trình nuôi cấy quy mô lớn ít tốn kém, dễ kiểm soát và mang lại lợi ích kép cho sức khỏe đường tiêu hóa.

Trước đó, Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược thuộc Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM đã phân lập từ mẫu đất tại Krông Pa, Gia Lai và sàng lọc được chủng Bacillus subtilis KP3. Chủng này đã được chứng minh có hoạt tính chống oxi hóa in vitro và sở hữu các đặc tính probiotic điển hình (tỷ lệ sống sót 66% ở pH 2; 61% trong muối mật 0,5%; đối kháng Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae; không mang gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy; bảo vệ gan trên chuột bị gây độc bằng $CCl_4$ ở liều $10^9$ bào tử/kg). Tuy nhiên, các bằng chứng thực nghiệm về tác động bảo vệ của dịch chiết từ chủng này trên mô hình tế bào nuôi cấy vẫn chưa được thiết lập.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của dịch chiết Bacillus subtilis KP3 trên mô hình tế bào" được thực hiện bởi sinh viên Phan Thị Diệu (Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM, chuyên ngành Vi sinh - Sinh học phân tử, khóa 2012 - 2016) dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Cát Đông nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể:

  1. Lên men và thu nhận sinh khối bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 đạt độ sạch theo tiêu chuẩn thực nghiệm.
  2. Chiết xuất các phân đoạn chất chống oxi hóa ngoại bào và chất chống oxi hóa nội bào (gồm phân đoạn tổng, phân đoạn thân dầu và phân đoạn thân nước).
  3. Đánh giá độc tính tế bào của các dịch chiết trên dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 thông qua thử nghiệm MTT.
  4. Đánh giá tác động bảo vệ chống stress oxi hóa gây bởi $H_2O_2$ của các dịch chiết trên tế bào MCF-7 thông qua các chỉ dấu sinh học: khả năng khử sắt tổng (FRAP), hàm lượng glutathion khử (GSH), hoạt tính các enzym superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GPx).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis KP3 và dòng tế bào ung thư vú người MCF-7; nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược thuộc Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM, hoàn thành vào tháng 05 năm 2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên các khái niệm và cơ sở khoa học về:

  • Probiotic: Theo định nghĩa của FAO/WHO (2002/2012), probiotic là các vi sinh vật sống mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ khi được sử dụng với lượng thích hợp. Chi Bacillus (đặc biệt là B. subtilis, B. clausii, B. cereus, B. pumilus) có ưu thế tạo nội bào tử bền vững với nhiệt, acid dạ dày và enzym tiêu hóa.
  • Hệ thống chống oxi hóa nội sinh: Gồm các phân tử phi enzym (GSH) và các enzym bảo vệ chủ chốt:
    • Superoxid dismutase (SOD): Chuyển hóa gốc superoxyd ($O_2^{\bullet-}$) thành $H_2O_2$ và oxy.
    • Catalase (CAT): Phân giải nhanh $H_2O_2$ thành $H_2O$ và $O_2$.
    • Glutathion peroxidase (GPx): Sử dụng NADPH và GSH để khử hydroperoxid và peroxid hữu cơ thành nước hoặc alcol tương ứng.
  • Chất chống oxi hóa từ vi khuẩn Bacillus: Các hợp chất như carotenoid màng bào tử, bacillithiol, surfactin, peptide vòng và exopolysaccharide đóng vai trò bẫy gốc tự do, bảo vệ tế bào vi khuẩn và tế bào vật chủ khỏi tác nhân oxi hóa.

Phương pháp nghiên cứu

Khóa luận sử dụng các phương pháp thực nghiệm vi sinh, sinh hóa và sinh học tế bào:

  • Phương pháp lên men và làm sạch bào tử: Lên men trên môi trường thạch đậu nành bổ sung khoáng ở 37°C trong 48 giờ. Làm sạch tế bào sinh dưỡng theo quy trình Nicholson và Setlow (1990) bằng ly tâm (10.000g, 4°C), xử lý lysozym (50 µg/ml), rửa bằng dung dịch KCl 1M/NaCl 0,5M, NaCl 1M, SDS 0,05% và nước khử khoáng. Định lượng mật độ bằng phương pháp đếm sống (CFU/ml).
  • Phương pháp chiết tách:
    • Chất ngoại bào: Lên men 3 lít môi trường TSB trong 24 giờ, ly tâm thu dịch nổi, đông khô trong 48 giờ, chiết cắn đông khô bằng ethanol và cô quay thu hồi cắn.
    • Chất nội bào: Tán siêu âm phá màng bào tử mật độ $2 \times 10^{12}$ bào tử trong dung dịch NaOH 1M (30 phút), sau đó chiết phân đoạn tổng bằng Chloroform:Ethanol (2:1 tt/tt), phân đoạn thân dầu bằng Chloroform, và phân đoạn thân nước bằng Ethanol; ly tâm thu dịch nổi và cô quay đuổi dung môi.
  • Thử nghiệm độc tính tế bào (MTT assay): Đánh giá trên tế bào MCF-7 ($2 \times 10^4$ tế bào/giếng) nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FCS, tiếp xúc với các dãy nồng độ chất thử (1,6 đến 24 µg/ml) trong 24 giờ. Sử dụng Doxorubicin (5,4 µg/ml) làm chứng dương. Đo độ hấp thu tại bước sóng 570 nm.
  • Mô hình gây stress oxi hóa trên tế bào: Tế bào MCF-7 ($1 \times 10^6$ tế bào) được ủ trước với chất thử (12 và 24 µg/ml), chứng âm (dung môi), chứng dương (Vitamin C 250 µg/ml) trong 24 giờ, sau đó cảm ứng stress oxi hóa bằng $H_2O_2$ 100 µM trong 24 giờ.
  • Các phương pháp định lượng sinh hóa:
    • Hàm lượng protein: Phương pháp Bradford (1976), đo OD tại 595 nm dựa trên đường chuẩn BSA (0,175 – 1,4 mg/ml).
    • Khả năng chống oxi hóa tổng (FRAP): Phương pháp Benzie và Strain (1999), đo phức hợp Fe²⁺–TPTZ tại 593 nm dựa trên đường chuẩn $FeCl_2$ (15,56 – 250 µM).
    • Hàm lượng GSH: Phương pháp khử DTNB tạo TNB đo tại 412 nm dựa trên đường chuẩn GSH (3,125 – 50 µM).
    • Hoạt tính SOD: Phương pháp Marklund (1974), đo tốc độ ức chế sự tự oxi hóa của Pyrogallol tại 320 nm.
    • Hoạt tính GPx: Phương pháp Flohe và Gunzler (1984), đo độ tiêu hao NADPH tại bước sóng 340 nm.
    • Hoạt tính CAT: Phương pháp Goth (1991), tạo phức màu vàng giữa $H_2O_2$ dư với amonium molybdate đo tại 405 nm dựa trên đường chuẩn $H_2O_2$ (4,0625 – 65 mM).
  • Xử lý số liệu: Thống kê mô tả (Mean ± SD), phân tích phương sai ANOVA một yếu tố và phép kiểm Post Hoc bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 22 (mức ý nghĩa p < 0,05); đồ thị và giá trị $IC_{50}$ xử lý qua GraphPad Prism 6.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Probiotic, gốc tự do và vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa

Chương này tổng quan về định nghĩa, tiêu chuẩn chọn lọc và tác dụng lâm sàng của probiotic (phòng ngừa tiêu chảy do Rotavirus, tiêu chảy do kháng sinh, ức chế Helicobacter pylori, hỗ trợ bệnh viêm ruột, ung thư, bảo vệ đường tiết niệu và hội chứng bất dung nạp lactose). Tác giả tổng hợp đặc điểm phân loại của chi Bacillus, khả năng hình thành nội bào tử chứa calci dipicolinat chịu nhiệt, kháng hóa chất và bức xạ. Chương 1 phân tích cơ chế hình thành gốc tự do, tổn thương do stress oxi hóa, cũng như cơ chế hoạt động của hệ thống chống oxi hóa nội sinh (SOD, Catalase, GPx, GSH) và ngoại sinh.

Chương tổng quan đi sâu vào các nghiên cứu tiền đề về vi khuẩn sinh chất chống oxi hóa:

  • Vi khuẩn acid lactic (LAB) như Lactobacillus delbrueckii, L. brevis BJ20 bảo vệ tế bào Caco-2 và Hep-G2 khỏi tổn thương peroxid.
  • Xạ khuẩn Streptomyces eri 12 có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH ($EC_{50} = 842,18 \pm 161,24$ µg/ml).
  • Các loài thuộc chi Bacillus như B. amyloliquefaciens bắt gốc hydroxyl và DPPH; B. simplex XJ-25 sinh chất ngoại bào khử sắt và bảo vệ màng lipid; B. coagulans RK-02 sinh exopolysaccharide (EPS) ức chế oxi hóa acid linoleic đạt 74%; hợp chất cyclo (d-Tyr-d-Phe) từ Bacillus sp. N; surfactin từ B. subtilis CSY191; bacillithiol và carotenoid trong cấu trúc bào tử Bacillus.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc sinh phẩm, hóa chất và quy trình thực nghiệm. Chủng B. subtilis KP3 được cung cấp từ các nghiên cứu trước của nhóm tác giả Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM. Tác giả trình bày các sơ đồ quy trình:

  • Sơ đồ lên men thu sinh khối trên thạch đậu nành bổ sung khoáng.
  • Sơ đồ làm sạch bào tử gồm 7 bước ly tâm và rửa bằng các dung dịch muối, lysozym và chất tẩy rửa SDS 0,05%.
  • Quy trình đếm sống xác định mật độ vi sinh vật theo giới hạn 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa của FDA.
  • Quy trình chiết tách chất chống oxi hóa ngoại bào (từ dịch đông khô TSB) và nội bào (từ $2 \times 10^{12}$ bào tử, xử lý kiềm kết hợp tán siêu âm).
  • Bảng thành phần thể tích và điều kiện ủ đo quang phổ cho 5 thử nghiệm sinh hóa: định lượng protein (Bradford), FRAP, GSH, SOD, GPx và Catalase.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Kết quả lên men và làm sạch bào tử B. subtilis KP3: Khuẩn lạc trên thạch TSA sau 24 giờ có màu trắng đục, tròn, bóng, rìa nguyên (đường kính 0,5 – 1 cm); sau 48 giờ khuẩn lạc lan rộng, rìa nhăn và tạo biofilm. Nhuộm Gram cho thấy dạng sinh dưỡng ở 24 giờ và hình thành bào tử ở 48 giờ.

Giai đoạn xử lý Mật độ bào tử ($\times 10^{11}$ bào tử/ml) Tỷ lệ bào tử (%) Thể tích thu nhận (ml) Tổng số lượng bào tử ($\times 10^{13}$ bào tử)
Sau lên men (3,5 L môi trường) 4,50 91,2 30 1,35
Sau làm sạch (Nicholson & Setlow) 4,13 95,6 30 1,24

2. Khối lượng dịch chiết thu nhận: Từ dịch nuôi cấy và $2 \times 10^{12}$ bào tử làm sạch, thu được khối lượng các phân đoạn cắn chiết:

  • Chất chống oxi hóa ngoại bào: 61,6 mg.
  • Chất chống oxi hóa nội bào tổng: 60,2 mg.
  • Phân đoạn nội bào thân dầu (chloroform): 30,2 mg.
  • Phân đoạn nội bào thân nước (ethanol): 29,7 mg.

3. Khảo sát độc tính tế bào (MTT assay): Doxorubicin thể hiện độc tính tế bào rõ rệt với giá trị $IC_{50} = 3,4$ µg/ml. Ngược lại, các dịch chiết từ B. subtilis KP3 ở các nồng độ từ 1,6 đến 24 µg/ml không gây độc tế bào MCF-7 (tỷ lệ ức chế dao động thấp, không phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất thử: ngoại bào từ 1,01% đến 12,25%; nội bào tổng từ 1,46% đến 14,99%; thân dầu từ -1,74% đến 5,39%; thân nước từ 2,83% đến 14,35%). Nồng độ 12 µg/ml và 24 µg/ml được lựa chọn cho các thử nghiệm hoạt tính tiếp theo.

Mẫu thử nghiệm Tỷ lệ ức chế ở 1,6 µg/ml (%) Tỷ lệ ức chế ở 3,2 µg/ml (%) Tỷ lệ ức chế ở 6,4 µg/ml (%) Tỷ lệ ức chế ở 12 µg/ml (%) Tỷ lệ ức chế ở 24 µg/ml (%)
Chất COXH ngoại bào 7,50 12,25 1,01 7,86 11,70
Chất COXH nội bào tổng 2,01 1,46 5,58 8,68 14,99
Nội bào thân dầu -1,74 -8,04 5,39 4,20 3,11
Nội bào thân nước 14,35 5,58 12,16 10,15 2,83
Chứng dương Doxorubicin (5,4 µg/ml) $OD_{570} = 0,382$
Chứng âm (Dung môi) $OD_{570} = 1,476$

4. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trên mô hình tế bào chịu stress $H_2O_2$: Khi xử lý tế bào MCF-7 bằng $H_2O_2$ 100 µM (lô chứng âm), các chỉ số chống oxi hóa đều suy giảm nghiêm trọng so với lô chứng DMSO 0,1% (FRAP giảm từ 18,91 xuống 13,86 nmol/mg protein; GSH giảm từ 49,36 xuống 34,21 nmol/mg protein; SOD giảm từ 2,37 xuống 0,93 U/mg protein; CAT giảm từ 12,85 xuống 8,79 U/mg protein).

Việc bổ sung các phân đoạn dịch chiết nội bào KP3 ở nồng độ 24 µg/ml đã bảo vệ và hồi phục rõ rệt các chỉ số sinh hóa tế bào:

  • Chỉ số FRAP: Mẫu nội bào tổng ở cả hai nồng độ 12 và 24 µg/ml, mẫu thân dầu và thân nước ở 24 µg/ml làm tăng chỉ số FRAP lên tương ứng $19,37 \pm 1,56$, $18,80 \pm 0,63$, $17,78 \pm 1,62$ và $17,99 \pm 1,09$ nmol/mg protein, có ý nghĩa thống kê so với chứng âm ($p < 0,05$) và tương đương với Vitamin C ($17,71 \pm 0,75$ nmol/mg protein).
  • Hàm lượng GSH: Mẫu nội bào thân nước ở 24 µg/ml đạt hàm lượng GSH cao nhất ($59,24 \pm 1,30$ nmol/mg protein), mẫu thân dầu đạt $51,38 \pm 1,89$ nmol/mg protein, nội bào tổng đạt $45,51 \pm 1,57$ nmol/mg protein; đều cải thiện vượt trội so với chứng âm ($34,21 \pm 1,89$ nmol/mg protein).
  • Hoạt tính enzym SOD: Tất cả các dịch chiết đều làm tăng hoạt tính SOD so với chứng âm ($0,93 \pm 0,02$ U/mg protein); trong đó ngoại bào 24 µg/ml ($2,19 \pm 0,12$), nội bào tổng 24 µg/ml ($2,08 \pm 0,04$), thân nước 24 µg/ml ($2,11 \pm 0,10$) đạt mức tương đương Vitamin C ($2,04 \pm 0,13$ U/mg protein).
  • Hoạt tính enzym CAT: Mẫu nội bào tổng 24 µg/ml ($11,63 \pm 0,28$), thân dầu 24 µg/ml ($11,70 \pm 0,41$) và thân nước 24 µg/ml ($11,32 \pm 0,45$) giúp phục hồi hoạt tính Catalase về mức tương đương với Vitamin C ($11,86 \pm 0,75$ U/mg protein).
  • Hoạt tính GPx: Các dịch chiết chưa ghi nhận sự cải thiện có ý nghĩa thống kê so với chứng âm.
  • Dịch chiết ngoại bào: Ngoại trừ tác dụng làm tăng hoạt tính SOD, các chỉ số FRAP, GSH và CAT chưa có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chứng âm ở các nồng độ khảo sát.

Chương 4: Kết luận và đề nghị

Tổng kết 4 kết luận thực nghiệm về việc thu hồi bào tử tinh sạch, chiết tách các phân đoạn dịch chiết, xác nhận tính an toàn tế bào (không gây độc ở 24 µg/ml) và chứng minh tác dụng bảo vệ chống stress oxi hóa của dịch chiết nội bào B. subtilis KP3 trên mô hình tế bào MCF-7. Tác giả đề xuất 2 kiến nghị nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các chỉ dấu chống oxi hóa trên tế bào MCF-7

Lô thử nghiệm Nồng độ FRAP (nmol/mg pro) GSH (nmol/mg pro) GPx (U/mg pro) SOD (U/mg pro) CAT (U/mg pro)
Chứng âm ($H_2O_2$) - $13,86 \pm 0,85$ $34,21 \pm 1,89$ $11,58 \pm 1,29$ $0,93 \pm 0,02$ $8,79 \pm 0,38$
Chứng DMSO 0,1% - $18,91 \pm 1,58$ $49,36 \pm 2,06$ $18,98 \pm 0,62$ $2,37 \pm 0,03$ $12,85 \pm 0,85$
Vitamin C (Chứng dương) 250 µg/ml $17,71 \pm 0,75$ $48,61 \pm 1,53$ $16,34 \pm 1,33$ $2,04 \pm 0,13$ $11,86 \pm 0,75$
Chất ngoại bào 24 µg/ml $16,76 \pm 0,54$ $40,94 \pm 3,99$ $14,69 \pm 1,13$ $2,19 \pm 0,12$ $9,81 \pm 0,69$
Chất nội bào tổng 24 µg/ml $18,80 \pm 0,63$ $45,51 \pm 1,57$ $9,19 \pm 0,61$ $2,08 \pm 0,04$ $11,63 \pm 0,28$
Nội bào thân dầu 24 µg/ml $17,78 \pm 1,62$ $51,38 \pm 1,89$ $14,39 \pm 0,00$ $1,92 \pm 0,10$ $11,70 \pm 0,41$
Nội bào thân nước 24 µg/ml $17,99 \pm 1,09$ $59,24 \pm 1,30$ $8,94 \pm 0,92$ $2,11 \pm 0,10$ $11,32 \pm 0,45$
Chất ngoại bào 12 µg/ml $16,33 \pm 1,74$ $37,23 \pm 1,92$ $7,96 \pm 0,96$ $1,79 \pm 0,03$ $9,98 \pm 0,30$
Chất nội bào tổng 12 µg/ml $19,37 \pm 1,56$ $29,19 \pm 3,15$ $7,09 \pm 1,54$ $1,94 \pm 0,08$ $8,90 \pm 0,05$
Nội bào thân dầu 12 µg/ml $15,53 \pm 1,34$ $47,64 \pm 3,76$ $8,32 \pm 1,78$ $1,39 \pm 0,04$ $10,52 \pm 0,90$
Nội bào thân nước 12 µg/ml $16,81 \pm 1,06$ $44,03 \pm 2,05$ $6,60 \pm 0,66$ $1,84 \pm 0,09$ $11,50 \pm 0,05$

Đóng góp khoa học của đề tài

  1. Hoàn thiện quy trình thực nghiệm: Chuẩn hóa quy trình lên men, làm sạch bào tử vi khuẩn B. subtilis KP3 với tỷ lệ bào tử tinh sạch đạt 95,6%, cùng phương pháp chiết tách phân đoạn nội bào bằng xử lý kiềm và tán siêu âm phá vỡ lớp vỏ bào tử giàu calci dipicolinat.
  2. Chứng minh tính an toàn sinh học tế bào: Xác nhận dịch chiết ngoại bào và nội bào của B. subtilis KP3 không thể hiện độc tính tế bào trên dòng MCF-7 ở các nồng độ khảo sát (lên đến 24 µg/ml).
  3. Cung cấp bằng chứng thực nghiệm in vitro tế bào: Đây là công trình đầu tiên chứng minh dịch chiết nội bào của chủng B. subtilis KP3 có khả năng bảo vệ tế bào người chống lại stress oxi hóa gây bởi $H_2O_2$, khôi phục khả năng khử tổng (FRAP), nồng độ GSH và kích hoạt hệ enzym phòng ngự (SOD, CAT) với hiệu quả tương đương hoạt chất đối chứng Vitamin C ở nồng độ 250 µg/ml.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu chỉ mới khảo sát trên dịch chiết thô và các phân đoạn phân cực sơ bộ (thân dầu, thân nước), chưa tinh sạch và xác định cụ thể cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học chính (như peptide, bacillithiol, carotenoid hay flavonoid vi sinh).
  • Dịch chiết ngoại bào ở nồng độ khảo sát (tối đa 24 µg/ml do giới hạn nồng độ DMSO 0,1%) chưa thể hiện rõ tác dụng chống oxi hóa trên đa số các chỉ số (ngoại trừ SOD).
  • Phạm vi đánh giá chỉ giới hạn trên một dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7).

Hướng nghiên cứu tiếp theo (do tác giả đề xuất)

  • Tiến hành phân lập, tinh chế và xác định bản chất hóa học của các hợp chất chống oxi hóa hiện diện trong bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis KP3.
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính chống oxi hóa và tác động bảo vệ của dịch chiết B. subtilis KP3 trên các dòng tế bào khác (như tế bào biểu mô ruột Caco-2, tế bào gan Hep-G2, tế bào bình thường).

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị đối với sinh viên, học viên cao học và các nhóm nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Dược học và Sinh hóa y sinh:

  • Phương pháp thu nhận và tinh sạch bào tử Bacillus: Cung cấp quy trình chi tiết theo phương pháp Nicholson và Setlow để loại bỏ hoàn toàn tế bào sinh dưỡng, đạt độ tinh sạch cao cho các nghiên cứu sinh học.
  • Quy trình chiết tách nội bào tử: Hướng dẫn kỹ thuật phá vỡ cấu trúc màng/vỏ bào tử bền vững bằng kiềm kết hợp tán siêu âm để thu nhận hoạt chất nội bào.
  • Hệ thống phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trên mô hình tế bào: Cung cấp đầy đủ công thức, hóa chất, nguyên tắc và quy trình chuẩn độ cho 5 thử nghiệm định lượng sinh hóa trên tế bào nuôi cấy ($H_2O_2$, Bradford, FRAP, GSH, SOD, GPx, Catalase).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phải xử lý tế bào bào tử B. subtilis KP3 bằng NaOH kết hợp tán siêu âm trước khi chiết xuất chất nội bào?

Vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus có cấu trúc nhiều lớp rất bền vững và chứa calci dipicolinat, giúp bào tử chống chịu với nhiệt độ, hóa chất và áp suất cơ học. Việc xử lý với dung dịch NaOH 1M và tán siêu âm 30 phút nhằm làm tăng tính thấm và phá vỡ cấu trúc vỏ bào tử, giúp giải phóng hoàn toàn các hợp chất chống oxi hóa nội bào vào dung môi chiết tách.

2. Dịch chiết từ B. subtilis KP3 có gây độc cho tế bào MCF-7 không và nồng độ nào được chọn để thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa?

Thử nghiệm MTT cho thấy các phân đoạn dịch chiết ngoại bào, nội bào tổng, nội bào thân dầu và thân nước ở các nồng độ từ 1,6 đến 24 µg/ml đều không gây độc tế bào (tỷ lệ ức chế thấp từ -8,04% đến 14,99% và không phụ thuộc vào nồng độ chất thử; $IC_{50}$ của chứng dương Doxorubicin là 3,4 µg/ml). Do giới hạn nồng độ DMSO tối đa trong môi trường nuôi cấy là 0,1%, nồng độ 12 µg/ml và 24 µg/ml (hai nồng độ cao nhất không gây độc) đã được lựa chọn để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa.

3. Hiệu quả chống stress oxi hóa của dịch chiết nội bào B. subtilis KP3 so với đối chứng Vitamin C như thế nào?

Ở nồng độ 24 µg/ml, các phân đoạn dịch chiết nội bào tổng, thân dầu và thân nước của B. subtilis KP3 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa vượt trội trên tế bào MCF-7 chịu stress $H_2O_2$: làm tăng chỉ số FRAP ($17,78 - 18,80$ nmol/mg protein), hàm lượng GSH ($45,51 - 59,24$ nmol/mg protein), hoạt tính SOD ($1,92 - 2,11$ U/mg protein) và hoạt tính Catalase ($11,32 - 11,70$ U/mg protein). Các giá trị này khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chứng âm ($p < 0,05$) và tương đương về mặt thống kê ($p > 0,05$) với chất đối chứng dương Vitamin C ở nồng độ 250 µg/ml.

4. Tác dụng của dịch chiết ngoại bào khác gì so với dịch chiết nội bào của B. subtilis KP3?

Dịch chiết ngoại bào (ở cả hai mức nồng độ 12 và 24 µg/ml) có khả năng làm tăng hoạt tính enzym SOD ($2,19 \pm 0,12$ U/mg protein ở 24 µg/ml, tương đương Vitamin C). Tuy nhiên, trên các chỉ số FRAP, GSH và Catalase, dịch chiết ngoại bào chưa tạo ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm, cho thấy các hoạt chất chống oxi hóa chính của chủng KP3 tập trung chủ yếu ở phần nội bào tử.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phan Thị Diệu đã thực hiện thành công quy trình lên men, thu nhận và làm sạch bào tử chủng probiotic Bacillus subtilis KP3 đạt độ tinh sạch 95,6%, đồng thời tách chiết các phân đoạn chất chống oxi hóa nội bào và ngoại bào. Các kết quả thực nghiệm trên mô hình tế bào ung thư vú MCF-7 khẳng định các dịch chiết an toàn, không gây độc tế bào ở nồng độ khảo sát lên đến 24 µg/ml. Đề tài chứng minh các phân đoạn dịch chiết nội bào (ở nồng độ 24 µg/ml) có khả năng bảo vệ tế bào hiệu quả trước stress oxi hóa gây bởi $H_2O_2$ thông qua việc duy trì chỉ số khử tổng FRAP, nâng cao hàm lượng GSH và kích hoạt hoạt tính các enzym chống oxi hóa nội sinh (SOD, CAT) tương đương với Vitamin C ở nồng độ 250 µg/ml.