I. Tổng Quan Phát Triển Vectơ Biểu Hiện Không Cần Chất Kích Thích
Bacillus subtilis là một vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu kỹ lưỡng và là một nhà máy tế bào lý tưởng để sản xuất protein dị hợp. Vectơ biểu hiện không cần chất kích thích ngày càng được ưa chuộng do chi phí thấp và không độc hại. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ biểu hiện ở B. subtilis là vectơ con thoi Escherichia coli, do đó biểu hiện nền có thể cản trở hiệu quả của các bước nhân dòng ở E. coli. Do đó, việc tạo ra các vectơ biểu hiện có thể sản xuất protein dị hợp ở mức độ cao ở B. subtilis mà không cần chất kích thích, đồng thời vẫn ức chế biểu hiện rò rỉ ở E. coli, là một yêu cầu trong sản xuất protein dị hợp. Nghiên cứu này tập trung vào phát triển các vectơ mới dựa trên promoter Pgrac để giải quyết vấn đề này. Trích dẫn: 'B. subtilis is an ideal cellular factory for producing heterologous proteins.'
1.1. Ưu điểm của Bacillus Subtilis trong sản xuất Protein
Bacillus subtilis có nhiều ưu điểm như khả năng phát triển tốt trên các nguồn carbon rẻ tiền, khả năng chịu đựng cao trong quá trình lên men công nghiệp và được công nhận là an toàn (GRAS). Vi khuẩn này thiếu endotoxin và tính gây bệnh, không có thiên vị đáng kể trong việc sử dụng codon. Do đó, nó trở thành một nhà máy tế bào hấp dẫn cho sản xuất protein dị hợp. Việc sử dụng các promoter mạnh để xây dựng các hệ thống biểu hiện là một trong những chiến lược chính để biểu hiện các protein dị hợp và đồng hợp.
1.2. Vectơ biểu hiện cảm ứng và không cảm ứng So sánh
Một loạt các vectơ biểu hiện đã được phát triển để sản xuất protein tái tổ hợp trong B. subtilis. Chúng có thể là cảm ứng hoặc không cảm ứng. Các vectơ biểu hiện không cần chất kích thích gần đây đã nhận được nhiều sự chú ý hơn do những nhược điểm của chất kích thích như chi phí cao và độc tính. Các vectơ biểu hiện trong B. subtilis là vectơ sao chép hoặc vectơ tích hợp. Loại đầu tiên phổ biến hơn và thúc đẩy sự biểu hiện của gen mục tiêu ở mức độ cao hơn.
II. Thách Thức Biểu Hiện Nền và Chi Phí Chất Kích Thích trong Sản Xuất
Các vectơ biểu hiện trong B. subtilis thường là vectơ con thoi B. subtilis - Escherichia coli, điều này có thể dẫn đến biểu hiện nền không mong muốn trong quá trình nhân dòng ở E. coli. Điều này làm giảm hiệu quả tổng thể của quá trình sản xuất protein. Thêm vào đó, việc sử dụng các chất kích thích đắt tiền và đôi khi độc hại làm tăng thêm chi phí và sự phức tạp của quy trình. Do đó, nhu cầu cấp thiết là phát triển các hệ thống biểu hiện có thể kiểm soát chặt chẽ biểu hiện nền trong E. coli và loại bỏ hoàn toàn nhu cầu về chất kích thích trong B. subtilis.
2.1. Vấn đề biểu hiện nền trong E. coli khi sử dụng Vectơ Con Thoi
Sự hiện diện của biểu hiện nền trong E. coli khi sử dụng vectơ con thoi là một thách thức lớn. Biểu hiện nền có thể dẫn đến sự hình thành các protein không mong muốn, làm giảm hiệu quả của quá trình nhân dòng và gây khó khăn cho việc tinh chế sản phẩm cuối cùng. Việc ức chế hiệu quả biểu hiện nền trong E. coli là rất quan trọng để đảm bảo thành công của quá trình sản xuất protein.
2.2. Chi phí và Độc tính của Chất Kích Thích trong sản xuất Protein
Việc sử dụng các chất kích thích như IPTG trong các hệ thống biểu hiện cảm ứng làm tăng thêm đáng kể chi phí sản xuất. Hơn nữa, một số chất kích thích có thể độc hại đối với tế bào chủ hoặc gây ra các vấn đề về quy định. Việc loại bỏ sự cần thiết của chất kích thích không chỉ làm giảm chi phí mà còn làm cho quá trình sản xuất an toàn và thân thiện với môi trường hơn.
2.3 Tầm quan trọng của việc kiểm soát biểu hiện gen một cách chặt chẽ
Kiểm soát biểu hiện gen một cách chặt chẽ, đặc biệt là ức chế biểu hiện rò rỉ trong E. coli và kích hoạt hiệu quả trong B. subtilis, đóng một vai trò then chốt trong việc tối ưu hóa năng suất và chất lượng protein tái tổ hợp. Việc phát triển hệ thống biểu hiện hiệu quả và có thể kiểm soát cho phép kiểm soát chính xác thời gian, mức độ và vị trí của biểu hiện gen, từ đó giải quyết các thách thức liên quan đến chi phí, độc tính và biểu hiện rò rỉ, dẫn đến tăng năng suất và quy trình sản xuất bền vững hơn.
III. Phương Pháp Sử Dụng Promoter Pgrac để Phát Triển Vectơ Mới
Promoter Pgrac là một promoter mạnh được tạo ra bằng cách lai promoter PgroES và toán tử lac để biểu hiện quá mức protein trong B. subtilis. Các promoter này có tiềm năng tạo ra các vectơ sản xuất protein dị hợp một cách không cần chất kích thích trong B. subtilis nhưng vẫn có thể kiểm soát được ở E. coli do sự hiện diện của gen lacI trên nhiễm sắc thể ở E. coli và sự vắng mặt của nó trên B. subtilis. Nghiên cứu này đã tạo ra các vectơ biểu hiện không cần chất kích thích mang promoter Pgrac, bao gồm plasmid không cần chất kích thích và vectơ tích hợp không cần chất kích thích, bằng cách xóa gen lacI trên các plasmid pHT có thể cảm ứng IPTG. Pgrac57, Pgrac100, Pgrac212 là các biến thể mạnh mẽ của promoter Pgrac.
3.1. Đặc Điểm và Ưu Điểm của Promoter Pgrac trong B. subtilis
Promoter Pgrac được tạo ra bằng cách kết hợp các yếu tố điều hòa từ promoter PgroES và toán tử lac. Điều này cho phép điều chỉnh biểu hiện gen một cách mạnh mẽ và linh hoạt. Sự hiện diện của toán tử lac cho phép kiểm soát biểu hiện thông qua gen lacI ở E. coli, trong khi sự vắng mặt của gen này ở B. subtilis cho phép biểu hiện không cần chất kích thích. Promoter Pgrac là một lựa chọn hứa hẹn để phát triển các hệ thống biểu hiện có thể kiểm soát chặt chẽ.
3.2. Xóa Gen LacI Chìa Khóa Tạo Vectơ Biểu Hiện Không Cần Chất Kích Thích
Việc xóa gen lacI trên các plasmid pHT có thể cảm ứng IPTG là một bước quan trọng để tạo ra các vectơ biểu hiện không cần chất kích thích. Bằng cách loại bỏ gen lacI, sự ức chế biểu hiện của protein mục tiêu bị loại bỏ, dẫn đến biểu hiện liên tục trong B. subtilis mà không cần thêm chất kích thích. Phương pháp này cho phép sản xuất protein một cách hiệu quả và kinh tế.
IV. Kết Quả Phát Triển Thành Công Vectơ Biểu Hiện Pgrac bgaB Không Cần Chất Kích Thích
Trong phần đầu tiên, plasmid không cần chất kích thích đã được xây dựng và việc sản xuất protein dị hợp được kiểm soát bởi chúng đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng bgaB từ Geobacillus stearothermophilus làm gen báo cáo. Các plasmid cho biểu hiện độc lập với IPTG ở B. subtilis và ức chế biểu hiện nền ở E. coli đã được chứng minh bằng cách sử dụng promoter Pgrac01 và protein báo cáo BgaB. Plasmid pHT1655 (AlacI 1362 bp, Pgrac01-bgaB) biểu hiện BgaB một cách độc lập với IPTG, chiếm 14,6% tổng số protein nội bào mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào chủ. Trong khi đó, nó vẫn ức chế biểu hiện nền ở E. coli với tỷ lệ ức chế là 5. Ban đầu, chiến lược tạo ra plasmid không cần chất kích thích bằng cách xóa gen lacI đã đạt được kết quả như mong đợi.
4.1. Biểu Hiện BgaB độc lập IPTG bằng Plasmid pHT1655 ở B. subtilis
Plasmid pHT1655 (AlacI 1362 bp, Pgrac01-bgaB) thể hiện khả năng biểu hiện BgaB một cách độc lập với IPTG. Protein BgaB chiếm 14,6% tổng số protein nội bào mà không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của tế bào chủ. Thành công này chứng minh tính khả thi của việc sử dụng promoter Pgrac01 kết hợp với việc xóa gen lacI để tạo ra các vectơ biểu hiện không cần chất kích thích hiệu quả.
4.2. Ức Chế Biểu Hiện Nền Hiệu Quả ở E. coli bằng Plasmid pHT1655
Mặc dù cho phép biểu hiện không cần chất kích thích ở B. subtilis, plasmid pHT1655 vẫn duy trì khả năng ức chế biểu hiện nền ở E. coli. Tỷ lệ ức chế biểu hiện nền là 5, chứng tỏ rằng plasmid này có thể kiểm soát chặt chẽ biểu hiện gen trong cả hai sinh vật. Khả năng này rất quan trọng để đảm bảo tính toàn vẹn của quá trình nhân dòng và sản xuất protein.
V. Kết Quả Tối Ưu Hóa Hiệu Quả Biểu Hiện Bằng Các Promoter Pgrac Mạnh Hơn
Tiếp theo, các plasmid không cần chất kích thích đã được tạo ra bằng cách sử dụng các promoter mạnh hơn và xóa các đoạn khác nhau của gen Jacl. Một loạt các plasmid biểu hiện không cần chất kích thích đã được tạo ra bằng cách sử dụng các promoter mạnh hơn mang đột biến trong các vùng promoter cốt lõi và các chuỗi ngược dòng, bao gồm Pgrac57 (-35”, -15”), Pgrac100 (UP”, -357,-15”), và sử dụng yếu tố ổn định có thể kiểm soát axit ribonucleic thông tin (mRNA) 5’ (CoSE), bao gồm Pgrac212. Biểu hiện BgaB bởi các chủng B. subtilis mang plasmid AlacI với Pgrac57, Pgrac100 và Pgrac212 chiếm 22. Các plasmid AlacI với Pgrac57, Pgrac100 ức chế biểu hiện nền ở FE. coli với tỷ lệ ức chế là 1.
5.1. Sử dụng Promoter Pgrac57 và Pgrac100 để tăng cường biểu hiện
Việc sử dụng các promoter mạnh hơn như Pgrac57 và Pgrac100 dẫn đến sự gia tăng đáng kể biểu hiện BgaB trong B. subtilis. Các promoter này, mang các đột biến trong các vùng promoter cốt lõi, cho phép phiên mã hiệu quả hơn của gen mục tiêu. Kết quả là, plasmid mang các promoter này có thể sản xuất lượng protein tái tổ hợp cao hơn.
5.2. Áp dụng yếu tố CoSE Pgrac212 để kiểm soát biểu hiện gen
Việc sử dụng yếu tố ổn định có thể kiểm soát axit ribonucleic thông tin (mRNA) 5’ (CoSE) Pgrac212 cung cấp một phương pháp bổ sung để kiểm soát biểu hiện gen. Yếu tố CoSE giúp tăng cường sự ổn định của mRNA, dẫn đến tăng cường dịch mã và sản xuất protein. Việc kết hợp Pgrac212 vào plasmid biểu hiện cho phép điều chỉnh chính xác thời gian và mức độ biểu hiện gen.
VI. Ứng Dụng Tiềm Năng Thương Mại và Hướng Phát Triển trong Tương Lai
Nghiên cứu này đã chứng minh một cách tiếp cận mới để thay đổi các vectơ biểu hiện có thể cảm ứng IPTG thành vectơ biểu hiện không cần chất kích thích, cho phép sản xuất protein mục tiêu ở mức độ cao trong B. subtilis mà không cần chất kích thích đồng thời vẫn duy trì sự ức chế biểu hiện nền trong E. coli, bằng cách xóa gen Jac] trên plasmid. Bên cạnh đó, một loạt các vectơ sao chép và tích hợp khác nhau với nhiều mức độ biểu hiện đã được tạo ra để đáp ứng các mục đích khác nhau. Cách tiếp cận này với các vectơ biểu hiện không cần chất kích thích có sẵn để biểu hiện các gen khác nhau trong các nghiên cứu trong tương lai. Các kết quả tích cực thể hiện giá trị thương mại tiềm năng của các vectơ mới được xây dựng.
6.1 Ứng dụng trong sản xuất protein công nghiệp
Các vectơ mới có thể được sử dụng để sản xuất quy mô lớn các protein công nghiệp, chẳng hạn như enzyme, dược phẩm và vật liệu sinh học, với chi phí thấp hơn và độ an toàn cao hơn.
6.2 Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản
Các vectơ mới có thể được sử dụng để nghiên cứu chức năng gen và quá trình sinh học trong B. subtilis và các vi sinh vật khác. Chúng cũng có thể được sử dụng để phát triển các công cụ sinh học mới cho các ứng dụng khác nhau.
6.3 Hướng phát triển trong tương lai
Trong tương lai, các vectơ mới có thể được tối ưu hóa hơn nữa để tăng hiệu quả biểu hiện và giảm biểu hiện nền. Chúng cũng có thể được sửa đổi để phù hợp với các ứng dụng cụ thể, chẳng hạn như biểu hiện protein độc hại hoặc biểu hiện gen có mục tiêu. Nghiên cứu này có thể được mở rộng sang các loại vi khuẩn khác.
