CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài 1. Khái quát Ngày nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc,Trung Quốc, Việt Nam,. do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống.
Nếu huyết khối ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… [8, 31] Vi sinh vật là tác nhân quan trọng trong việc hình thành các enzym có hoạt tính phân hủy các huyết khối được hình thành bởi sợi fibrinogen. Tuy vậy, đến nay nattokinase thu hút nhiều chú ý vì thực nghiệm đã chỉ ra rằng: nattokinase có hoạt tính thủy phân fibrin cao gấp 4 lần enzym plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan máu vón cục tồn đọng bám chặt ở nội mạc). Nattokinase rất hữu dụng trong việc phân hủy huyết khối nội sinh ở người vì hoạt tính cao được duy trì ở nội mạc trong thời gian dài bằng liều uống [27].
Hơn nữa, nattokinase cũng tăng cường sản sinh ra plasmin. Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết khối khác như urokinase, streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA). urokinase và streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn.
Thực nghiệm cho thấy nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI- 1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể [30]. Đồng thời nattokinase cũng làm giảm độ nhớt, độ dính của máu, nhờ vậy giảm thiểu được các 1 điều kiện gây ra huyết khối và các tai biến. Khi sử dụng độc lập, enzym ổn định ở pH từ 7-12 và nhiệt độ dưới 50°C [19], [25]. Sự chuyển hóa, thải trừ nattokinase chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Việc sử dụng nattokinase thường xuyên sẽ giúp cải thiện các bệnh lý về máu và tuần hoàn. Nattokinase hỗ trợ sự lưu thông máu, tốc độ vận chuyển máu và giảm độ nhớt của máu, hỗ trợ cơ chế đông máu của cơ thể, hỗ trợ việc duy trì huyết áp ổn dịnh khi dùng 2000 FU nattokinase mỗi ngày. Nattokinase được sử dụng trong các bệnh tim mạch như tăng huyết áp, đột quỵ, đau thắt ngực, huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ hóa động mạch, giãn tĩnh mạch, huyết khối tĩnh mạch ngoại vi, bệnh lý võng mạc. Nattokinase cũng được sử dụng trong các cơn đau: đau xơ cơ, hội chứng suy nhược mãn tính, thiếu oxi mô, u xơ tử cung.
Hoặc sử dụng trong việc loại trừ các phơi nhiễm từ máu động vật, dụng cụ phẫu thuật và chế phẩm máu [36]. Các tương tác thuốc của nattokinase chưa được nghiên cứu đầy đủ. Vào năm 1998, Japan Bio Science laboratory Co. Ltd là công ty đầu tiên trên thế giới sử dụng chủng Bacillus subtilis natto đã được đưa vào lên men công nghiệp nhằm sinh tổng hợp nattokinase.
Sản phẩm được đưa ra thị trường với tên Nattokinase NSK-FD với hoạt lực 13.000 FU/g và sau đó mở rộng và phát triển sang các thị trường Mỹ, châu Âu, Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc. Năm 2001 công ty đã phát triển sản phẩm này với hoạt lực cao hơn và được biết với tên NSK- SD (hoạt lực 20. Sản phẩm này đã nhanh chóng chiếm tổng lượng và thị phần nattokinase lớn nhất thế giới. Sau đó một loạt các hãng khác Cactus và Amano enzym-USA cung cấp chế phẩm nattokinase cho thị trường Mỹ.
Tuy nhiên trong vòng 5 năm trở lại đây, rất nhiều công ty của Đài Loan và Trung Quốc đã sản xuất nattokinase với giá thành khá cạnh tranh so với các sản phẩm từ Nhật Bản hay Mỹ nhưng chất lượng biến động [8]. Theo thống kê sơ bộ, nhu cầu sản phẩm nattokinase ngày càng tăng. Riêng tại thị trường Nhật Bản: doanh số khởi đầu đạt 500 triệu yen (năm 2002), đã tăng đến 1,5 tỉ yen (năm 2006), và đạt 3 tỉ yên vào năm 2010 [8]. Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc, Việt Nam người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng.
Các công ty dược phẩm ở Việt Nam chủ yếu nhập khẩu nguyên liệu nattokinase (hoạt độ khác 2 nhau) từ nhiều nguồn khác nhau với giá thành cao và hoạt tính enzym có thể biến động (giảm) do quá trình vận chuyển và bảo quản. Theo số liệu của công ty Cổ phần Sao Thái Dương, lượng chế phẩm nattokinase hàng tháng phải sử dụng theo ước tính 200 - 300 kg chế phẩm/tháng với hoạt lực 10.000 FU/g và hầu hết được nhập khẩu từ Nhật Bản và Đài Loan. Hàng năm chi phí cho nguyên liệu khoảng 10 - 12 tỷ/năm. Công ty CP Sao Thái Dương hiện chiếm khoảng 20% thị phần của dòng sản phẩm phân phối.
Tạm tính hiện nay Việt Nam đang nhập khoảng 60 tỷ đồng nattokinase làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng trong nước. Từ đó cho thấy nguồn nguyên liệu enzym này có thị trường tiềm năng. Vậy việc hướng tới nghiên cứu làm chủ công nghệ sản xuất nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng đáng được quan tâm. Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase Hiện có hai phương pháp lên men tổng hợp nattokinase từ các chủng Bacillus được phân lập tự nhiên.
Phương pháp lên men bề mặt có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị cao nhưng có nhược điểm là khó khống chế điều kiện vô trùng tuyệt đối trong các phòng lên men khi triển khai ở quy mô sản xuất; Phương pháp lên men chìm có ưu điểm nổi bật của công nghệ này là có thể dễ dàng tự động hóa điều khiển được quá trình lên men và có thể triển khai ở quy mô công nghiệp. Tuy vậy, thực tế các nghiên cứu trong nước cho thấy nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Nói cách khác, công nghệ lên men chủng tự nhiên cần nghiên cứu tối ưu hóa hay yêu cầu cải biến chủng được đặt ra. Bên cạnh các công trình nghiên cứu tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men, một cách tiếp cận khác là ứng dụng công nghệ gen trong tạo chủng biểu hiện tăng cường sản lượng enzym nattokinase có hoạt tính.
Cụ thể, những năm gần đây đã có những nghiên cứu bước đầu tạo nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính bằng hệ thống vi khuẩn (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus). Hướng nghiên cứu nattokinase tái tổ hợp tỏ ra triển vọng vì enzym tái tổ hợp được biểu hiện, hệ thống tiết của tế bào chủ hoạt động hiệu quả, enzym bền hơn (do giảm thiểu được khả năng bị oxy hóa). coli, nattokinase tái tổ hợp đã biểu hiện có hoạt tính nhờ sự gắn kết với peptide tín hiệu tự nhiên ở Bacillus và peptid PelB. Hoạt tính phân hủy fibrin đạt 260 đơn vị urokinase/ml.
Ở Lactobacillus, bằng việc sử dụng hệ thống kiểm soát biểu hiện nhờ nisin, họat tính nattokinase tái tổ hợp cũng đạt 41,7 đơn vị urokinase/ml. Tuy nhiên, cả hai hệ thống trên lượng enzym thu nhận được từ môi trường không cao. Ở Bacillus subtilis, công trình của Chen và cộng sự (2007) đã phát triển vector con thoi Escherichia coli/ Bacillus subtilis để dòng hóa gen mã hóa nattokinase ở E. coli và biểu hiện gen ở B.
Hiệu quả biểu hiện nattokinase đã được cải thiện bằng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy. Lượng lớn nattokinase tái tổ hợp được thu nhận từ môi trường (khoảng 40% protein tổng số), và hoạt tính đạt 77.400 đơn vị casein/ml [9]. Nghiên cứu của Wu và cộng sự (2011) cũng cho hiệu suất tổng hợp nattokinase cao ở B. subtilis do đột biến vùng promoter của chính gen mã hóa, hoạt tính tăng lên từ 113 - 236% [33].
Trong nước, hiện có vài nghiên cứu lên men thu nhận nattokinase chủ yếu theo phương thức lên men bán rắn trên cơ chất đậu nành nấu chín với chủng tự nhiên theo phương pháp truyền thống như Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương (2008) đã tách chiết enzym fibrinase từ B. subtilis NT5, trọng lượng phân tử khoảng 27 kDa, pI 7,04, nhiệt độ tối ưu 60oC và pH tối ưu 7,5; các điều kiện ổn định enzym là Ca2+ và Mg2+ với nồng độ 5 - 10 mM, pH 7 - 7,8; fibrinase đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2011) đã lựa chọn được chủng B. subtilis M1 và D là hai chủng sinh tổng hợp natokinase cao từ các sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương.
Nguyễn Thị Hồng Ngân (2011) đã tìm ra môi trường tối ưu cho phương pháp lên men chìm thu nhận nattokinase. Môi trường lên men có hàm lượng bột đậu tương 4%, 0,5% pepton, 0,01% CaCl2 bổ sung giống 4% trong điều kiện không điều chỉnh pH, lên men trong 22 giờ ở 37oC, lắc 170 vòng/phút thì cho hoạt lực enzym sau lên men cao nhất là 242 FU/ml. Với mong muốn nâng cao hoạt lực sinh tổng hợp nattokinase nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp lên men fed-batch. Kết quả cho thấy hoạt lực nattokinase trong dịch fed-batch gấp 7 lần so với hoạt lực trong dịch lên men theo mẻ.
Đã tiến hành 4 thử nghiệm lên men sinh tổng hợp nattokinase trong thiết bị lên men 100 lít, kết quả bước đầu khá khả quan hoạt lực nattokinase của dịch sau 28 giờ lên men đạt 1400 FU/mL. Tuy nhiên để có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với các thiết bị lên men được trang bị hiện đại với công suất lớn, việc khống chế các thông số kỹ thuật và điều chỉnh quá trình lên men sẽ gặp nhiều khó khăn. Các nghiên cứu chuyển quy mô cần tiếp tục triển khai để có thể sử dụng trong các thiết bị lên men quy mô công nghiệp. Ngoài ra, trong nước đã có một số công trình nghiên cứu tạo nattokinase tái tổ hợp, song chưa có ứng dụng trong sản xuất thực tiễn.
Nguyễn Thị Thảo và cộng sự (2008) đã nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong E. coli BL21/pESUb [4]. Tuy nhiên enzym biểu hiện ra không ở dạng cấu trúc enzym trưởng thành, không có hoạt tính.
Năm 2013, nhóm này đã công bố kết quả thu nhận nattokinase tái tổ hợp 100 mg/lít từ chủng chủ biểu hiện khuyết 8 protease B.