Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong bệnh lý học tim mạch hiện đại, sự hình thành các huyết khối (thrombus) trong lòng mạch là nguyên nhân trực tiếp dẫn tới nhiều biến chứng nguy hiểm như nhồi máu cơ tim, đột quỵ thiếu máu não và tắc nghẽn động mạch. Các giải pháp điều trị và phòng ngừa huyết khối chủ yếu dựa vào các tác nhân tiêu sợi huyết (fibrinolytic agents). Trong số các enzyme có hoạt tính làm tan huyết khối tự nhiên, Nattokinase—một protease serine chiết xuất lần đầu từ món ăn lên men truyền thống Natto của Nhật Bản—được ghi nhận có khả năng phân giải sợi fibrin mạnh mẽ và an toàn, kích thích cơ thể gia tăng sản sinh plasmin nội sinh mà không gây tác dụng phụ chảy máu ồ ạt như một số thuốc chống đông thông thường.
Phần lớn các nghiên cứu trước đây tập trung khai thác enzyme Nattokinase từ trực khuẩn Bacillus subtilis phân lập trên các giá thể đậu tương lên men của khu vực Đông Á (như Natto của Nhật Bản, Douchi của Trung Quốc, hay Chungkook-Jang và Doen-Jang của Hàn Quốc). Boza là đồ uống lên men truyền thống từ ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch, kê) phổ biến tại Thổ Nhĩ Kỳ và các nước Đông Âu (Bulgaria, Romania, Albania). Hệ vi sinh vật trong Boza bao gồm tập hợp đa dạng các loài vi khuẩn lactic và trực khuẩn Bacillus subtilis. Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bế Thị Đài (ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, năm 2014) được thực hiện nhằm mục đích sàng lọc và đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase từ nguồn vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm Boza thương mại.
Mục đích và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể trong văn bản bao gồm:
- Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân hủy máu đông Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập được.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (thời gian nuôi cấy, pH ban đầu của môi trường và nguồn carbon) đến khả năng sinh tổng hợp Nattokinase của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn phân lập từ sản phẩm đồ uống lên men Boza.
- Vật liệu nghiên cứu: Mẫu đồ uống lên men truyền thống Boza của công ty Harmonica (Bulgaria).
- Địa điểm và thời gian thực hiện: Đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên; thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 06/2014.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung khái niệm
- Bản chất hóa sinh của Nattokinase: Nattokinase (EC 3.4.21.62, trong văn bản ký hiệu EC = 3.62) là một enzyme thuộc phân nhóm subtilisin của họ protease serine. Cấu trúc enzyme gồm một chuỗi đơn polypeptide gồm 275 gốc acid amin, không có cầu nối disulfide, khối lượng phân tử phân tích đạt khoảng 27.728 Da (nằm trong dải khối lượng phân tử 27,7–44 kDa), điểm đẳng điện pI = 8,6 ± 0,3. Trung tâm hoạt động của enzyme mang bộ ba xúc tác đặc trưng gồm gốc hydroxyl của Ser-221, vòng imidazol của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32. Enzyme bền nhiệt đến 60°C, hoạt động trong dải pH từ 6–12 (tối ưu ở pH 8–10 và nhiệt độ 30–70°C).
- Cơ chế phân giải fibrin: Enzyme Nattokinase tác động tiêu huyết khối qua 3 con đường:
- Trực tiếp: Giáng hóa trực tiếp polymer fibrin không tan trong cục máu đông thành các đoạn peptide phân tử lượng thấp, tan trong nước (cơ chế tương tự plasmin).
- Gián tiếp qua Urokinase: Kích hoạt tiền enzyme prourokinase chuyển hóa thành urokinase, thúc đẩy biến đổi plasminogen thành plasmin.
- Gián tiếp qua t-PA: Kích hoạt quá trình tổng hợp chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) trong huyết tương.
- Hệ vi sinh vật trong Boza: Nước uống Boza lên men chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic (Lactobacillus brevis, Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus sp.,...) cùng sự hiện diện của trực khuẩn Bacillus subtilis.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Mẫu Boza được pha loãng bậc 10 đến nồng độ $10^{-6}$, cấy trang trên môi trường thạch LBA (Luria-Bertani Agar), ủ ở 37°C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc khác nhau được làm thuần khiết bằng kỹ thuật cấy ria. Hoạt tính tiêu máu đông được kiểm tra sơ bộ trên môi trường thạch máu thỏ (BAM): dùng ống đục lỗ thạch lấy khối vi khuẩn đường kính 0,5 cm đặt lên đĩa thạch BAM, ủ ở 37°C trong 18 giờ và đo đường kính vòng phân giải. Chủng có đường kính vòng phân giải > 1,5 cm được chọn để nghiên cứu tiếp.
- Phương pháp nghiên cứu hình thái: Đánh giá kích thước, hình dạng, màu sắc, bề mặt và mép ria của khuẩn lạc trên môi trường LBA. Quan sát hình thái tế bào, cách sắp xếp và khả năng sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X (soi dầu) sau khi nhuộm Gram.
- Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa:
- Thử nghiệm catalase: Phản ứng giải phóng oxy tạo bọt khí khi tiếp xúc với dung dịch $H_2O_2$.
- Thử nghiệm oxidase: Nhỏ thuốc thử $N,N,N',N'$-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride lên sinh khối vi khuẩn bôi trên giấy lọc, phản ứng dương tính khi chuyển sang màu tím trong 10 giây.
- Thử nghiệm chuyển hóa carbohydrate: Nuôi cấy trên môi trường thạch Triple Sugar Iron Agar (TSI) để kiểm tra khả năng lên men glucose, lactose, sucrose, khả năng sinh hơi và sinh khí $H_2S$.
- Phương pháp định lượng hoạt tính Nattokinase: Thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứa fibrin thỏ (R. Dubey, 2011). Đĩa thạch dày 5 mm gồm hỗn hợp 5 mL dung dịch fibrin thỏ 2% (w/v) trong đệm phosphate (pH 7,4) và 35 mL dung dịch agar 2%. Tạo các giếng thạch đường kính 5 mm, nạp 100 µL dịch nổi ly tâm (sau khi ly tâm dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút, 4°C trong 20 phút), ủ ở 37°C trong 18 giờ. Đo đường kính vòng phân giải ($D$, tính bằng mm). Hoạt tính enzyme được tính theo công thức:
$$\text{Hoạt tính enzyme (U)} = \frac{(D^2 - 5^2) \times 3{,}14}{16}$$
- Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:
- Thời gian nuôi cấy: Nuôi lắc 150 vòng/phút trong môi trường cơ bản (CM) ở 37°C; thu mẫu tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 72 giờ.
- pH ban đầu: Khảo sát các giá trị pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N), nuôi lắc 36 giờ ở 37°C.
- Nguồn carbon: Thay thế nguồn carbon trong môi trường CM bằng glucose, glycerol, maltose và sucrose ở nồng độ 0,1%, nuôi lắc 36 giờ ở 37°C.
- Phương pháp bảo quản và nhân giống: Chủng giống được bảo quản trên thạch nghiêng LBA ở 4°C (cấy chuyển định kỳ 2–3 tuần/lần). Nhân giống vi khuẩn trong môi trường lỏng LB (lắc 150 vòng/phút, 37°C, 24 giờ) đạt mật độ khoảng $10^8$ tế bào/mL trước khi cấy truyền 10% thể tích vào môi trường lên men.
- Xử lý số liệu: Tính toán giá trị trung bình và vẽ đồ thị biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel.
Nội dung chính theo từng phần của khóa luận
Phần 1: Mở đầu
Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu phòng ngừa các bệnh tim mạch và đột quỵ do huyết khối. Tác giả nêu bật vai trò sinh học của Nattokinase, tổng quan về sự phân bố của vi khuẩn sinh Nattokinase trong các thực phẩm lên men truyền thống, xác lập mục tiêu phân lập chủng vi sinh vật từ đồ uống Boza, đồng thời chỉ rõ ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài đối với lĩnh vực công nghệ vi sinh.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Tác giả tổng hợp các tài liệu học thuật về:
- Giá trị dinh dưỡng và dược lý của đậu nành, sản phẩm Natto và hoạt chất Nattokinase.
- Cơ chế tác dụng sinh học, cấu trúc hóa học, các nghiên cứu in vitro, in vivo trên chuột, chó và các thử nghiệm lâm sàng trên người tại Nhật Bản, Hoa Kỳ.
- Tình hình nghiên cứu trong nước: dẫn chứng thử nghiệm lâm sàng sản phẩm Nattospes trên 64 bệnh nhân đột quỵ thiếu máu não tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 (năm 2008) và các đánh giá tại Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Quân y 103.
- Tổng quan về đồ uống Boza: quy trình sản xuất từ ngũ cốc lên men, thành phần dinh dưỡng và cấu trúc hệ vi sinh vật (các nhóm vi khuẩn lactic và trực khuẩn Bacillus).
- Danh lục các nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân giải fibrin trong tự nhiên (bao gồm vi khuẩn Bacillus, xạ khuẩn Streptomyces, nấm sợi Aspergillus, Fusarium, Penicillium và một số loài tảo).
Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết về xuất xứ vật liệu mẫu Boza Harmonica (Bulgaria), địa điểm thực hiện tại Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, danh mục 18 loại hóa chất và hệ thống trang thiết bị thí nghiệm (tủ ấm, máy ly tâm lạnh, tủ sấy, box cấy vô trùng, máy UV-VIS...). Phần này mô tả thành phần định lượng của 4 môi trường nuôi cấy (CM, BAM, LBA, LB) cùng chi tiết quy trình thao tác phân lập, nhuộm Gram, thử nghiệm sinh hóa, thử nghiệm khuếch tán thạch fibrin và bố trí các thí nghiệm khảo sát điều kiện lên men.
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Nội dung chương tập trung công bố và phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được:
- Phân lập vi khuẩn sinh Nattokinase: Từ mẫu Boza, tác giả phân lập và thuần khiết được 5 chủng vi khuẩn (ký hiệu từ BL1 đến BL5). Thử nghiệm trên môi trường thạch máu thỏ (BAM) cho thấy các chủng BL2, BL3 và BL5 không tạo vòng phân giải; chủng BL1 tạo vòng phân giải đường kính 1,1 cm; chủng BL4 tạo vòng phân giải lớn nhất đạt 1,7 cm (> 1,5 cm) nên được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chính.
- Đặc điểm hình thái của chủng BL4: Khuẩn lạc trên môi trường LBA sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C có dạng hình tròn hoặc gần tròn, đường kính 2–3 mm (0,2–0,3 cm), màu trắng sữa, không tiết sắc tố vào môi trường, bề mặt ướt, nhăn nheo, bám dính yếu và dễ tách khỏi mặt thạch, rìa mép không đều dạng răng cưa. Dưới kính hiển vi quang học, tế bào có dạng hình que kích thước 0,8 × 1,5 µm, hai đầu tròn đều, bắt màu nhuộm Gram dương ($G^+$), có khả năng sinh bào tử.
- Đặc tính sinh hóa của chủng BL4: Chủng BL4 thể hiện tính chất đặc trưng của chi Bacillus: phản ứng catalase dương tính ($+$), phản ứng oxidase dương tính ($+$), hô hấp hiếu khí, chuyển hóa glucose sinh acid và sinh hơi ($+$), lên men sucrose ($+$), không lên men lactose ($-$), có khả năng sinh khí $H_2S$ ($+$).
- Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: Hoạt tính Nattokinase xuất hiện sau 12 giờ nuôi cấy (đạt 200 U), tăng dần và đạt cực đại tại thời điểm 36 giờ (đạt 370 U trong môi trường cơ bản CM). Sau 36 giờ, hoạt tính enzyme suy giảm nhanh (tại 48 giờ chỉ còn 220 U, tương đương khoảng 60% mức cực đại).
- Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu: Trong dải pH khảo sát từ 5,0 đến 8,0, vi khuẩn BL4 đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme. Môi trường có pH ban đầu bằng 7,0 cho hoạt tính Nattokinase cao nhất (đạt 390 U), các mức pH khác cho hoạt tính thấp hơn (pH 5,0 đạt 320 U; pH 6,0 đạt 330 U; pH 8,0 đạt 300 U).
- Ảnh hưởng của nguồn carbon: Trong số 4 nguồn carbon khảo sát ở nồng độ 0,1%, maltose kích thích sinh tổng hợp Nattokinase tốt nhất (đạt hoạt tính 390 U), tiếp đến là glucose (đạt 380 U), glycerol (đạt 350 U) và thấp nhất là sucrose (đạt 310 U, thấp hơn khoảng 20% so với maltose).
Phần Kết luận và kiến nghị
Đúc kết các phát hiện cốt lõi về chủng BL4 phân lập từ Boza và các thông số nuôi cấy tối ưu, đồng thời đề xuất định danh bằng sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rDNA) và mở rộng nghiên cứu tối ưu hóa môi trường ở các giai đoạn tiếp theo.
Kết quả và đóng góp của nghiên cứu
Dữ liệu thực nghiệm chính
Bảng 1: Kết quả sàng lọc khả năng phân giải máu đông của các chủng phân lập từ Boza
| STT |
Ký hiệu chủng |
Khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường BAM |
Đường kính vòng phân giải (cm) |
Kết luận tuyển chọn |
| 1 |
BL1 |
Có ($+$) |
1,1 |
Không chọn |
| 2 |
BL2 |
Không ($-$) |
0 |
Loại |
| 3 |
BL3 |
Không ($-$) |
0 |
Loại |
| 4 |
BL4 |
Có ($+$) |
1,7 |
Tuyển chọn (> 1,5 cm) |
| 5 |
BL5 |
Không ($-$) |
0 |
Loại |
Bảng 2: Đặc điểm hình thái và sinh hóa của chủng vi khuẩn BL4
| Chỉ tiêu nghiên cứu |
Đặc điểm ghi nhận thực nghiệm |
| Hình dạng khuẩn lạc |
Hình tròn hoặc gần tròn, đường kính 2–3 mm (0,2–0,3 cm) |
| Màu sắc và bề mặt |
Màu trắng sữa, không sinh sắc tố, bề mặt ướt, có nếp nhăn, dễ bong |
| Mép ria khuẩn lạc |
Mép không đều, dạng răng cưa |
| Hình thái tế bào |
Dạng hình que, kích thước 0,8 × 1,5 µm, hai đầu tròn đều |
| Nhuộm Gram |
Gram dương ($G^+$) |
| Khả năng sinh bào tử |
Có sinh bào tử ($+$) |
| Phản ứng Catalase |
Dương tính ($+$) |
| Phản ứng Oxidase |
Dương tính ($+$) |
| Chuyển hóa Glucose (sinh acid / sinh khí) |
Dương tính ($+$) / Dương tính ($+$) |
| Chuyển hóa Lactose (sinh khí) |
Âm tính ($-$) |
| Chuyển hóa Sucrose (sinh khí) |
Dương tính ($+$) |
| Khả năng sinh khí $H_2S$ |
Dương tính ($+$) |
Bảng 3: Tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính sinh tổng hợp Nattokinase của chủng BL4
| Yếu tố khảo sát |
Thông số thí nghiệm |
Hoạt tính Nattokinase (U) |
| Thời gian nuôi cấy |
12 giờ |
200 |
|
24 giờ |
350 |
|
36 giờ (Tối ưu) |
370 |
|
48 giờ |
220 |
| pH môi trường ban đầu |
pH 5,0 |
320 |
|
pH 6,0 |
330 |
|
pH 7,0 (Tối ưu) |
390 |
|
pH 8,0 |
300 |
| Nguồn carbon (0,1%) |
Maltose (Tối ưu) |
390 |
|
Glucose |
380 |
|
Glycerol |
350 |
|
Sucrose |
310 |
Đóng góp của đề tài
- Đóng góp khoa học: Khẳng định sự hiện diện của chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase trong sản phẩm đồ uống lên men từ ngũ cốc Boza (Bulgaria), mở rộng nguồn phân lập vi sinh vật sinh enzyme tiêu huyết khối ngoài các sản phẩm đậu nành truyền thống châu Á. Xác định chủng BL4 có các đặc điểm hình thái và sinh hóa mang nhiều nét tương đồng với loài Bacillus subtilis.
- Đóng góp thực tiễn: Thiết lập được các thông số môi trường ban đầu (thời gian nuôi cấy 36 giờ, pH 7,0, bổ sung 0,1% maltose trong môi trường cơ bản CM) cho phép chủng BL4 đạt hoạt tính Nattokinase cực đại 390 U ở quy mô phòng thí nghiệm.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
Hạn chế của nghiên cứu
- Chưa định danh chính xác phân loại học của chủng vi khuẩn BL4 đến cấp độ loài và dưới loài bằng phương pháp sinh học phân tử (phân tích trình tự gen 16S rDNA của ribosome) hoặc khóa phân loại Bergey mở rộng.
- Nghiên cứu mới khảo sát đơn lẻ 3 yếu tố (thời gian, pH, nguồn carbon), chưa đánh giá toàn diện ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy, các nguồn nitơ hữu cơ/vô cơ, nồng độ các ion khoáng vi lượng và sự tương tác đa yếu tố đến quá trình lên men.
- Quy mô nghiên cứu dừng lại ở mức bình tam giác thí nghiệm (shake flask), chưa tiến hành thử nghiệm trên hệ thống thiết bị lên men sinh học (bioreactor) cũng như chưa thực hiện quy trình thu hồi và tinh sạch enzyme.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Giải trình tự gen 16S rDNA để xác định chính xác tên khoa học của chủng BL4.
- Khảo sát mở rộng các yếu tố dinh dưỡng (nguồn nitơ, muối khoáng, chất kích thích sinh trưởng) và điều kiện vận hành (nhiệt độ, tốc độ khuấy đảo, độ thông khí) nhằm tối ưu hóa môi trường sản xuất Nattokinase.
- Nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh sạch và thử nghiệm ứng dụng sinh khối vi khuẩn BL4 hoặc enzyme thu hồi trong sản xuất chế phẩm hỗ trợ phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối tim mạch.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học ứng dụng và Hóa sinh - Dược học.
- Nội dung có giá trị ứng dụng:
- Quy trình phân lập và sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme tiêu sợi huyết bằng môi trường thạch máu thỏ (BAM).
- Phương pháp định lượng hoạt tính enzyme Nattokinase dựa trên kỹ thuật khuếch tán đĩa thạch fibrin theo công thức bán kính vòng phân giải của R. Dubey (2011).
- Công thức pha chế các môi trường chuyên dụng (CM, BAM, LBA) và số liệu cơ sở về đặc tính sinh trưởng, sinh tổng hợp protease của chủng vi khuẩn phân lập từ đồ uống lên men ngũ cốc.
Câu hỏi thường gặp
1. Chủng vi khuẩn BL4 được phân lập từ nguồn vật liệu nào và dựa trên tiêu chuẩn lựa chọn nào?
Chủng vi khuẩn BL4 được phân lập từ mẫu sản phẩm đồ uống lên men truyền thống Boza của công ty Harmonica (Bulgaria). Tiêu chuẩn tuyển chọn chủng là khả năng tạo vòng phân giải fibrin trên môi trường thạch máu thỏ (BAM) lớn hơn 1,5 cm sau 18 giờ ủ ở 37°C (chủng BL4 đạt đường kính vòng phân giải 1,7 cm).
2. Những đặc điểm hình thái và sinh hóa nào của chủng BL4 cho thấy sự tương đồng với trực khuẩn Bacillus subtilis?
Chủng BL4 có khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt ướt nhăn nheo, ria răng cưa; tế bào dạng hình que kích thước 0,8 × 1,5 µm, hai đầu tròn đều, bắt màu Gram dương ($G^+$), có khả năng sinh nội bào tử; phản ứng catalase dương tính, oxidase dương tính, hô hấp hiếu khí và chuyển hóa được các loại đường tạo acid.
3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng BL4 đạt hoạt tính Nattokinase cao nhất là gì?
Điều kiện nuôi cấy tối ưu xác định được gồm: nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C trong môi trường cơ bản (CM) với nguồn carbon thay thế là maltose nồng độ 0,1%, pH ban đầu của môi trường đạt 7,0 và thời gian nuôi cấy là 36 giờ. Ở điều kiện này, hoạt tính Nattokinase đạt giá trị cực đại là 390 U.
4. Tại sao Nattokinase được đánh giá có tính an toàn cao hơn các thuốc chống đông máu thông thường?
Theo tổng quan tài liệu trong văn bản, Nattokinase phân hủy trực tiếp sợi fibrin đã hình thành và kích thích sản sinh plasmin, urokinase, t-PA nội sinh, nhưng không làm ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin. Do đó, enzyme không làm suy giảm cơ chế đông máu tự nhiên của cơ thể và không gây biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu thông thường.
5. Hoạt tính Nattokinase trong nghiên cứu được tính toán theo công thức nào?
Hoạt tính Nattokinase được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch fibrin thỏ 2% (đường kính giếng 5 mm) sau 18 giờ ủ ở 37°C, tính theo công thức:
$$\text{Hoạt tính enzyme (U)} = \frac{(D^2 - 5^2) \times 3{,}14}{16}$$
Trong đó $D$ là đường kính vòng phân giải đo được (tính bằng mm), và một đơn vị hoạt tính (U) tương đương với lượng enzyme trong 25 µL dung dịch tạo ra diện tích vòng phân giải $1\text{ mm}^2$.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bế Thị Đài đã phân lập thành công chủng vi khuẩn Gram dương BL4 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase từ sản phẩm đồ uống lên men ngũ cốc Boza của Bulgaria. Chủng BL4 mang nhiều đặc điểm hình thái và sinh hóa tương đồng với Bacillus subtilis, có khả năng tạo vòng phân giải máu đông đạt 1,7 cm trên đĩa thạch BAM. Quá trình khảo sát điều kiện lên men cho thấy chủng BL4 đạt hoạt tính Nattokinase tối ưu 390 U sau 36 giờ nuôi cấy trong môi trường CM bổ sung 0,1% maltose ở pH 7,0. Kết quả này cung cấp cơ sở thực nghiệm quan trọng cho việc nghiên cứu khai thác và định danh các nguồn vi sinh vật mới phục vụ sản xuất chế phẩm phòng chống huyết khối.
