MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài. Mục tiêu của đề tài. Nội dung nghiên cứu .2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
Enzyme Manganese peroxidase. Cấu trúc và tính chất. Enzyme MnP oxy hóa có chứa các hợp chất phenolic và các hợp chất nonphenolic. Vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase.
Aflatoxin và phƣơng pháp khử độc tố Aflatoxin. Độc tố Aflatoxin. Khử độc tố bằng phương pháp phi sinh học. Khử độc tố bằng phương pháp sinh học .23 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Mẫu vật và Chủng vi sinh vật. Phƣơng pháp nghiên cứu .1 Phương pháp lấy mẫu đất. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật. Phương pháp sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase.
Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase lớn nhất. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật. Khảo sát một số yếu tổ ảnh hướng đến sự sinh tổng hợp enzyme MnP của chủng nấm Pl3. Khảo sát khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin của enzyme Manganese peroxidase.
Phương pháp xử lý số liệu .33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Phân lập, sƣu tập và nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật. Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất. Các chủng vi sinh vật phân lập từ một số mẫu thực phẩm.
Sưu tập một số chủng nấm. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp MnP. Định tính hoạt tính MnP. Định lượng hoạt độ MnP ngoại bào.
Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh tổng hợp enzyme MnP của chủng nấm Pl3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose. Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3.
Ảnh hưởng của nồng độ pH. Khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin của enzyme MnP từ chủng Pl3 .47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB1 aflatoxin B1 CTAB Đệm cetyltrimethyl ammonium bromide EtBr Ethidium bromide LB Luria Bertani MnP Manganese peroxidase PDA Potato Dextrose Agar vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất lý – hóa chủ yếu của các aflatoxin .2: Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA .3: Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam .4: Hàm lượng Afllatoxin sau khi xử lý bằng Metylamin và xử lý nhiệt đơn giản .1: Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu .1: Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ 03 mẫu đất .2: Một số đặc điểm hình thái các chủng vi sinh vật từ mẫu thực phẩm .3: Một số đặc điểm hình thái của 08 chủng nấm sưu tập .4: Kích thước vòng hoạt tính MnP của các chủng vi sinh vật trên môi trường chọn lọc .5: Hoạt độ enzyme MnP .6: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các thời gian nuôi cấy .7: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ Glucose .8: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ NH4NO3 .9: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ pH. 47 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử và vị trí hoạt động của MnP .2: Chu trình xúc tác của MnP .3: Nấm Aspergillus flavus và nấm Aspergillus parasiticus .4: Cấu trúc các loại Aflatoxin .5: Đường cong hấp thụ UV của các aflatoxin B1, G1 và G1 .6: Chuyển hóa Aflatoxin B1 thành hydroxi-dihydro-aflatoxin B1 và là aflatoxin Ro .1: Hình ảnh các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường LB .2: Hình ảnh 05 chủng vi sinh vật phân lập trên 03 mẫu đất tại khu vực thành phố Thái Nguyên .3: Khuẩn lạc 03 chủng vi sinh vật phân lập trên Nem chua (NC), Nato (NT), Tương (T-3) .4: Hình thái của một số chủng nấm sưu tập .5: Hình thái hệ sợi của một số chủng nấm .6: Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme Manganese peroxidase trên môi trường chọn lọc có bổ sung guaiacol .7: Vòng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ Glucose .8: Vòng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ NH4NO3.9: Vòng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ pH .10: Hình ảnh chạy TLC mẫu thử phân hủy aflatoxin B1. 47 ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Kích thước vòng hoạt tính MnP ở các nồng độ Glucose (cm) .2: Kích thước vòng hoạt tính MnP ở các nồng độ NH4NO3 (cm) .3: Kích thước vòng hoạt tính MnP ở các nồng độ pH (cm).
Lý do chọn đề tài Nhiễm nấm mốc nấm trên lương thực, thực phẩm như ngũ cốc (gạo, ngô,.), hạt có dầu (đậu tương, lạc,…), gia vị (hạt tiêu đen, nghệ,…), các loại quả, hạt khác (hạt dẻ, dừa,…) và trong sữa của động vật là vấn đề nghiêm trọng. Các nhà nghiên cứu trên thế giới, cũng như ở Việt Nam đang tích cực nghiên cứu, khảo sát mức độ nhiễm độc tố từ nấm mốc nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật nuôi. Nấm mốc phát triển không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của hạt mà còn sinh ra các độc tố khác nhau gọi chung là mycotoxin. Trong những độc tố nguy hiểm phải kể đến aflatoxin.
Độc tố aflatoxin được cấu tạo hoá học rất ổn định (vòng thơm) và khó bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng, axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ. Độc tố aflatoxin được sản xuất chủ yếu bởi loài vi nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 (AFB1) được coi là một loại độc tố mạnh với các đặc tính gây đột biến, gây quái thai, gây ung thư gan và ức chế miễn dịch ở động vật và có thể ở người. Do đó, sử dụng các phương pháp phân hủy độc tố aflatoxin được coi là một giải pháp quan trọng để hạn chế được sự nguy hiểm của chúng.
Theo như nhiều nghiên cứu trước đây, để phân hủy độc tố aflatoxin có nhiều cách khác nhau như phương pháp vật lý (nhiệt độ, chiếu xạ), phương pháp hóa học (axit hóa, amoni hóa, ozon hóa), phương pháp sinh học (sinh vật, chiết xuất, enzyme). Trong đó, phương pháp vật lý và phương pháp hóa học ít được sử dụng hơn vì các kĩ thuật này không hiệu quả về mặt kinh tế, đồng thời, hiệu suất phân hủy thấp (chiếu xạ), khó thực hiện trong thực tế, gây ảnh hưởng tối thiểu về chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm, bên cạnh đó còn gây mùi vị không tốt (ozon hóa). Phương pháp kiểm soát aflatoxin bằng vi sinh vật học rất đáng được quan tâm sử dụng vì giá thành rẻ, sử dụng thuận tiện, có lợi cho sản xuất, tạo ra sản phẩm sạch, đảm bảo sức khỏe và quyền lợi cho người tiêu dùng. Độc tố aflatoxin bị phân giải bởi 2 một số loại vi sinh vật nhất định mà chủ yếu là nấm mục trắng bằng cách tiết ra hệ enzyme oxy hóa mạnh bao gồm manganese peroxidase, laccase.
Việt Nam là một nước nhiệt đới ẩm, có hệ vi sinh vật phát triển mạnh mẽ và đa dạng. Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nghiên cứu sản suất hệ enzyme oxy hóa này. Bên cạnh đó, đây còn là nguồn nguyên liệu di truyền quan trọng để tạo ra các chế phẩm enzyme tái tổ hợp, tiền đề cho nghiên cứu đột phá tạo ra các chế phẩm sinh học trong công nghiệp xử lý rác thải. Manganese peroxidase là một trong các loại enzyme chính trong phân giải lignin.
Trên thế giới các nghiên cứu về Manganese peroxidase đặc biệt được quan tâm do tính chất quan trọng của nó. Các nghiên cứu này tập trung vào tuyển chọn chủng vi sinh vật mới, tiết enzyme mạnh. Các gene mã hóa cho Manganese peroxidase đã được biểu hiện tái tổ hợp vào P. niger, … Tuy nhiên các kết quả hiện nay vẫn còn nhiều hạn chế, khả năng ứng dụng vẫn còn khó khăn.
Manganese peroxidase cũng đã được thương mại hóa bởi hãng hóa chất hàng đầu Sigma, tuy vậy, giá thành của enzyme thương mại rất đắt lên đến hàng ngàn dollar cho 1g enzyme. Góp phần vào việc nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme Manganese peroxidase chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase có khả năng phân hủy độc tố aflatoxin B1‖. Mục tiêu của đề tài Sàng lọc được chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Manganese peroxidase mạnh có khả năng phân hủy độc tố aflatoxin B1 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi sinh vật từ một số mẫu mẫu đất, mẫu thực phẩm; và sưu tập một số chủng nấm từ các nguồn cung cấp của viện nghiên cứu, trung tâm.
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật phân lập và sưu tập được. 3 - Sàng lọc và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase từ chủng vi sinh vật được đã được phân lập. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme Manganese peroxidase của chủng vi sinh vật tuyển chọn. - Khảo sát khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin B1 bằng enzyme Manganese peroxidase từ chủng vi sinh vật tuyển chọn.
4 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Enzyme Manganese peroxidase 1. Khái niệm Manganese peroxidase (MnP) (EC 1.13) là một glycoprotein có chứa nhân heme, MnP xúc tác phản ứng oxy hóa Mn2+ thành Mn3+, do đó có thể oxy hóa một số lượng lớn chất nền phenolic. MnP được phát hiện lần đầu tiên vào giữa những năm 1980 ở P.
chrysosporium [7], [21], [32] bởi hai nhóm nghiên cứu quốc tế (M. Crawford's) và được đặc trưng như một enzyme oxy hóa quan trọng để phân hủy lignin (Paszczyński et al. Có nhiều chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng sản xuất enzyme Manganese peroxidase. Tuy nhiên, MnP được tìm thấy chủ yếu ở các loại nấm mục trắng, chẳng hạn như Phanerochaete chrysosporium, Ganoderma sp., và Irpex lacteus [29], [41].
Gần đây, việc sản xuất các enzyme ligninolytic bao gồm MnP đã được chứng minh ở Phyllosticta, Aspergilus, Fusarium và Penicillium [36], [44]. Trong quá trình phân hủy, hệ thống MnP tạo ra các gốc tự do có phản ứng cao và không đặc hiệu phân cắt các liên kết đơn vị cacbon và ete của các hợp chất phenol và phi phenol khác nhau. Do đó, một loạt các khả năng oxy hóa cơ chất khiến nó trở thành một loại enzyme thú vị cho các ứng dụng công nghệ sinh học trong một số ngành công nghiệp.