Nghiên cứu phân lập hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả

• Tác giả: Nguyễn Khắc Sinh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cường
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Saponin và khả năng kháng u
• 1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin
• 1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin
• 1.4. Saponin từ hải sâm
• 1.5. Nguồn saponin từ hải sâm. Một số phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học
• 1.6. Sắc kí lớp mỏng
• 1.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR)
• 1.8. Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư
• 1.8.1. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào
• 1.8.2. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào
• 1.8.3. Mô hình động vật thí nghiệm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Loài hải sâm Cercodemas anceps
• 2.3. Mẫu chế phẩm sinh học. Dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180
• 2.4. Dòng tế bào ung thư vú MCF7
• 2.5. Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116
• 2.6. Chuột nhắt trắng Swiss
• 2.7. Hoá chất, thiết bị
• 2.8. Dụng cụ và vật tư tiêu hao
• 2.9. Phương pháp nghiên cứu
• 2.9.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm
• 2.9.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm
• 2.9.3. Phương pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp
• 2.9.4. Phương pháp xác định tế bào apoptosis dưới tác dụng của CPSH
• 2.9.5. Phương pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm
• 2.9.6. Phương pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí nghiệm
• 2.9.7. Các phương pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps
• 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được
• 3.3. Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập
• 3.4. Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình in vitro và in vivo
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hợp chất saponin kháng ung thư từ hải sâm

Hợp chất saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên có khả năng kháng ung thư mạnh mẽ. Chúng được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và động vật, trong đó có hải sâm. Nghiên cứu về Cercodemas anceps cho thấy tiềm năng lớn của các hợp chất này trong việc điều trị ung thư. Saponin có cấu trúc phức tạp, bao gồm các aglycone và gốc monosaccharide, tạo nên tính chất hoạt động bề mặt đặc biệt. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau.

1.1. Đặc điểm và cấu trúc của hợp chất saponin

Hợp chất saponin có cấu trúc phức tạp với hai phần chính: aglycone và glycone. Aglycone thường là một triterpen hoặc steroid, trong khi glycone là các gốc đường. Sự kết hợp này tạo ra khả năng tạo bọt và hoạt động kháng ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng cấu trúc của saponin ảnh hưởng đến hoạt tính kháng ung thư của chúng.

1.2. Tác dụng kháng ung thư của saponin từ hải sâm

Các hợp chất saponin từ hải sâm như Cercodemas anceps đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng các saponin này có thể kích thích quá trình apoptosis và ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị ung thư từ nguồn gốc tự nhiên.

II. Thách thức trong nghiên cứu hợp chất saponin kháng ung thư

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất saponin kháng ung thư từ hải sâm vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự phức tạp trong cấu trúc của các hợp chất này, dẫn đến khó khăn trong việc phân lập và xác định cấu trúc. Hơn nữa, sự đa dạng về hoạt tính sinh học của các loại saponin cũng tạo ra thách thức trong việc đánh giá hiệu quả điều trị.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập hợp chất saponin

Quá trình phân lập hợp chất saponin từ Cercodemas anceps thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp trong cấu trúc của chúng. Các phương pháp sắc ký và phân tích hiện đại như NMR và HPLC cần được áp dụng để đạt được hiệu quả cao trong việc tách chiết và xác định cấu trúc.

2.2. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư của saponin

Việc đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất saponin cần được thực hiện trên nhiều dòng tế bào khác nhau để có cái nhìn toàn diện về hiệu quả điều trị. Các mô hình in vitro và in vivo cần được sử dụng để xác định chính xác tác dụng của các hợp chất này.

III. Phương pháp nghiên cứu hợp chất saponin từ hải sâm

Nghiên cứu về hợp chất saponin từ Cercodemas anceps được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng ung thư. Sử dụng các kỹ thuật hiện đại giúp tối ưu hóa quy trình nghiên cứu và nâng cao độ chính xác của kết quả.

3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm

Quá trình phân lập hợp chất saponin từ Cercodemas anceps thường sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các mẫu được chiết xuất và phân tích để xác định các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư.

3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Sau khi phân lập, các hợp chất saponin cần được xác định cấu trúc bằng các phương pháp như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối. Điều này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các hợp chất này trong việc kháng ung thư.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất saponin từ Cercodemas anceps có hoạt tính kháng ung thư đáng kể. Các thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư cho thấy khả năng ức chế sự phát triển và kích thích apoptosis. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ nguồn gốc tự nhiên.

4.1. Kết quả thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư

Các thử nghiệm cho thấy hợp chất saponin từ hải sâm có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư MCF7 và HCT116. Giá trị IC50 cho thấy hiệu quả điều trị tiềm năng của các hợp chất này.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc kháng ung thư

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng ung thư từ hợp chất saponin. Việc kết hợp các hợp chất này với các liệu pháp điều trị hiện có có thể nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về hợp chất saponin từ Cercodemas anceps đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và tối ưu hóa quy trình sản xuất. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hợp chất saponin

Nghiên cứu cần tiếp tục để khám phá thêm nhiều hợp chất saponin mới từ hải sâm và các nguồn tự nhiên khác. Việc phát triển các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm từ saponin

Các sản phẩm từ hợp chất saponin có thể được phát triển thành thuốc điều trị ung thư hiệu quả. Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học và ngành công nghiệp dược phẩm để đưa các sản phẩm này vào thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh ung thư đang là một trong những thách thức y tế lớn nhất của nhân loại trong thế kỷ 21. Theo các báo cáo dịch tễ học quốc tế, căn bệnh này là nguyên nhân gây ra khoảng 7,6 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu, chiếm khoảng 13% tổng số trường hợp tử vong do bệnh tật, và con số này được dự báo sẽ vượt mốc 11 triệu người vào năm 2030. Tại Việt Nam, thống kê ghi nhận mỗi năm có khoảng 150.000 ca mắc mới và hơn 75.000 trường hợp tử vong, tương đương trung bình 205 người tử vong mỗi ngày. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp bách trong việc tìm kiếm các hoạt chất mới có nguồn gốc tự nhiên nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính phụ của hóa trị liệu truyền thống.

Luận văn tập trung nghiên cứu phân lập các hợp chất triterpene saponin có hoạt tính sinh học cao từ loài hải sâm Cercodemas anceps, một nguồn dược liệu biển giàu tiềm năng nhưng chưa được khảo sát toàn diện. Mục tiêu cốt lõi của đề tài là phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất saponin tinh khiết, đồng thời đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người và kiểm chứng hiệu lực ức chế u rắn in vivo trên động vật thực nghiệm.

Nghiên cứu được triển khai trên 1,5 kg mẫu hải sâm tươi thu thập tại khu vực biển Bắc Vàn, huyện đảo Cô Tô, tỉnh Quảng Ninh vào tháng 4 năm 2014, phối hợp thực hiện cùng Viện Hóa sinh biển và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Ý nghĩa của công trình thể hiện ở việc bổ sung dữ liệu hóa học chuyên sâu về lớp triterpene glycoside từ sinh vật biển Việt Nam, đồng thời cung cấp bằng chứng thực nghiệm về chỉ số nồng độ ức chế và tỷ lệ giảm thể tích khối u, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư từ biển.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân loại hợp chất tự nhiên, trong đó saponin được phân chia thành 11 lớp cấu trúc hóa học chính dựa trên bộ khung carbon gồm 27 hoặc 30 nguyên tử carbon gắn với các gốc đường. Trong hệ sinh thái biển, hải sâm thuộc lớp Holothuroidea đặc trưng bởi nhóm triterpene glycoside có phần aglycon là holostane-3β-ol liên kết với chuỗi oligosaccharide phân nhánh hoặc mạch thẳng chứa các gốc sulfate.

Cơ sở sinh học của đề tài dựa trên cơ chế chết theo chương trình của tế bào ung thư. Khác với hiện tượng hoại tử gây viêm mô lân cận, quá trình chết theo chương trình diễn ra có kiểm soát, đặc trưng bởi sự cô đặc chất nhiễm sắc, phân cắt DNA thành các đoạn khoảng 180 cặp base và sự chuyển vị của phân tử phosphatidylserine từ mặt trong ra bề mặt ngoài màng tế bào. Về mặt dược lý, nghiên cứu áp dụng thang đánh giá hiệu lực kháng u chuẩn của H. Itokawa cùng lý thuyết định lượng độc tính tế bào thông qua chỉ số ức chế 50% sự tăng sinh tế bào nhằm phân loại mức độ hoạt tính của các hợp chất tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được xây dựng từ quy trình chiết xuất 1,5 kg mẫu hải sâm tươi đã loại bỏ nội tạng, thu được 29,5 g cặn chiết metanol tổng số. Để phân lập các hợp chất tinh sạch, phương pháp sắc ký cột pha thường silica gel kết hợp sắc ký pha đảo RP-18 và hệ thống sắc ký lỏng trung áp MPLC Biotage-Isolera One được lựa chọn nhờ khả năng phân tách tối ưu các hợp chất phân cực phức tạp. Cấu trúc phân tử được xác định chính xác bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR và 2D-NMR ở tần số 500 MHz cho phổ proton và 125 MHz cho phổ carbon, kết hợp các kỹ thuật tương tác không gian như HSQC, HMBC, COSY và ROESY.

Về khảo nghiệm sinh học, hoạt tính gây độc tế bào được sàng lọc trên 3 dòng tế bào gồm ung thư mô liên kết Sarcoma-180, ung thư vú MCF7 và ung thư biểu mô ruột kết HCT116. Phương pháp thử nghiệm quang phổ MTS được lựa chọn nhờ độ nhạy cao, đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 490 nm để định lượng sản phẩm formazan tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sau 48 giờ xử lý. Tế bào chết theo chương trình được phát hiện bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang kép Annexin V và Propidium Iodide trên kính hiển vi laser quét đồng tụ.

Khảo nghiệm in vivo sử dụng cỡ mẫu gồm 35 chuột nhắt trắng Swiss khỏe mạnh có trọng lượng từ 18 đến 20 gam, phân bố ngẫu nhiên vào 4 lô nghiên cứu có kiểm soát thể trọng đồng đều: lô đối chứng sinh học (5 cá thể), lô đối chứng ung thư (10 cá thể), lô điều trị bằng thuốc đối chứng 6-Mercaptopurine liều 48 mg/kg (10 cá thể) và lô điều trị bằng chế phẩm sinh học liều 3,93 mg/kg (10 cá thể). Chuột được tiêm cấy 1,5 triệu tế bào Sarcoma-180 dưới da vùng ngực trái để tạo u rắn, theo dõi kích thước khối u liên tục trong timeline 32 ngày bằng thước kẹp kỹ thuật số. Toàn bộ chỉ số huyết học ngoại vi được phân tích tự động bằng hệ thống máy Swelab Alpha nhằm đánh giá độ an toàn sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tách chiết từ phân đoạn phân cực cao của dịch chiết hải sâm đã phân lập thành công 2 hợp chất triterpene saponin tinh khiết dạng bột màu trắng. Hợp chất 1 được phân lập với khối lượng 3,5 mg từ phân đoạn chiết nước, được xác định là colochiroside A với 59 tín hiệu carbon trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân, mang khung holostan đặc trưng và chuỗi 5 đơn vị đường có gắn nhóm sulfate. Hợp chất 2 được phân lập từ phân đoạn dung môi diclorometan và xác định là philinopside A.

Thử nghiệm độc tính tế bào in vitro cho thấy cả hai hợp chất đều thể hiện khả năng ức chế tăng sinh rõ rệt trên các dòng tế bào ung thư khảo sát trong dải nồng độ thử nghiệm từ 1,5 đến 48 µg/mL. Kết quả nhuộm huỳnh quang xác nhận chế phẩm sinh học có khả năng kích hoạt mạnh mẽ sự ngoại bào hóa phosphatidylserine trên bề mặt tế bào Sarcoma-180 và MCF7 sau 24 giờ tiếp xúc ở các nồng độ từ 10 đến 40 µg/mL.

Trên mô hình động vật mang u rắn thực nghiệm, chế phẩm sinh học nguồn gốc hải sâm ở liều 3,93 mg/kg thể trọng cho thấy hiệu quả kìm hãm rõ rệt tốc độ gia tăng thể tích khối u rắn so với lô đối chứng không điều trị. Đáng chú ý, các cá thể chuột sử dụng chế phẩm sinh học duy trì được sự tăng trưởng thể trọng ổn định và bảo toàn các chỉ số tế bào máu ngoại vi, trong khi lô dùng thuốc hóa trị chuẩn 6-Mercaptopurine ghi nhận hiện tượng suy giảm nhẹ chỉ số hồng cầu và biến động thể trọng.

Mô hình diễn giải dữ liệu thực nghiệm tiêu biểu:
+-----------------------------------------------------------------------------+
| Biểu đồ 1: Đồ thị đáp ứng liều - tỷ lệ sống của tế bào (IC50 từ 1,5-48 µg/mL)|
| Biểu đồ 2: Động học tăng trưởng thể tích khối u rắn V = 0,4 x a x b² (32 ngày)|
| Bảng so sánh: Tỷ lệ ức chế u (IR%) và các chỉ số huyết học trên Swelab Alpha |
+-----------------------------------------------------------------------------+

Thảo luận kết quả

Khả năng kháng u vượt trội của các hợp chất saponin phân lập từ hải sâm Cercodemas anceps bắt nguồn từ mối tương quan mật thiết giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học. Sự hiện diện của khung aglycon holostan kết hợp với chuỗi oligosaccharide sulfat hóa tạo ra ái lực gắn kết đặc hiệu với màng tế bào ung thư, kích hoạt các tín hiệu nội bào dẫn đến quá trình chết theo chương trình thông qua con đường ty thể mà không gây vỡ màng ồ ạt như hiện tượng hoại tử.

Khi đặt trong sự so sánh với các nghiên cứu trước đây về loài hải sâm cát Holothuria scabra với hai hợp chất holothurin A3 và A4 có chỉ số ức chế từ 0,32 đến 1,12 µg/mL, các hợp chất từ Cercodemas anceps thể hiện hoạt tính sinh học tương đồng nhưng sở hữu tính chọn lọc cao. Hơn nữa, việc phối hợp cao chiết giàu saponin từ hải sâm cùng cao chiết nấm linh chi trong chế phẩm sinh học đã tạo ra tác động hiệp đồng, vừa ức chế khối u vừa bảo vệ hệ thống tạo máu và tăng cường sức đề kháng của cơ thể vật chủ. Dữ liệu thực nghiệm này khi được trình bày qua các đồ thị tăng trưởng thể tích theo thời gian và bảng tổng hợp các thông số huyết học sẽ minh chứng rõ nét cho tiềm năng phát triển liệu pháp hỗ trợ điều trị ung thư an toàn từ sinh vật biển.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu học thuật thành ứng dụng thực tiễn trong ngành dược phẩm sinh học, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp trọng tâm:

1. Tối ưu hóa quy trình chiết tách bán công nghiệp: Các viện nghiên cứu chuyên ngành cần chủ trì nâng cấp quy trình chiết xuất sử dụng hệ thống sắc ký lỏng áp suất trung bình kết hợp nhựa hấp phụ tái sinh, hướng tới mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi saponin toàn phần đạt tối thiểu 0,05% khối lượng khô trong vòng 12 tháng tới.
2. Mở rộng thử nghiệm tiền lâm sàng đa mô hình: Nhóm nghiên cứu sinh học thực nghiệm cần phối hợp với các cơ sở y khoa triển khai thử nghiệm trên ít nhất 5 dòng tế bào ung thư kháng thuốc khác nhau và mở rộng đánh giá cơ chế ức chế hình thành mạch máu khối u in vivo trong lộ trình từ 18 đến 24 tháng.
3. Phát triển hệ dẫn thuốc nano hướng đích: Các phòng thí nghiệm công nghệ dược phẩm cần tiến hành nghiên cứu vi bao hợp chất saponin trong các hạt liposome hoặc micelle nano nhằm nâng cao độ tan, kéo dài thời gian bán hủy sinh học và tăng sinh khả dụng đường uống thêm khoảng 30% đến 40% trong thời gian 12 tháng.
4. Quy hoạch bảo tồn và nuôi trồng nguồn dược liệu: Sở Khoa học & Công nghệ cùng các địa phương ven biển phía Bắc cần xây dựng đề án bảo tồn nguồn lợi tự nhiên và thử nghiệm mô hình nuôi bán tự nhiên loài hải sâm Cercodemas anceps tại vùng biển Quảng Ninh - Hải Phòng, đặt mục tiêu bảo đảm sản lượng dược liệu ổn định khoảng 5 đến 10 tấn sinh khối mỗi năm trong giai đoạn 3 đến 5 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và phương pháp luận của công trình mang lại giá trị học thuật và ứng dụng trực tiếp cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Hóa sinh học, Hóa hợp chất thiên nhiên: Tài liệu cung cấp quy trình phân lập chi tiết các hợp chất phân cực cao và phương pháp luận giải cấu trúc hóa học phức tạp bằng hệ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D-NMR hiện đại.
• Các nhà khoa học và bác sĩ chuyên ngành Ung bướu thực nghiệm: Cung cấp quy trình chuẩn từ khâu sàng lọc độc tính tế bào in vitro bằng kỹ thuật MTS đến thiết kế mô hình u rắn Sarcoma-180 trên động vật để đánh giá thuốc kháng u.
• Các doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm và Thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Nguồn tham khảo giá trị về công thức phối chế cao chiết sinh vật biển kết hợp thảo dược nhằm phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư có độ an toàn sinh học cao.
• Cơ quan quản lý tài nguyên và nghiên cứu sinh học biển: Cung cấp cơ sở khoa học về giá trị dược liệu của họ Cucumariidae, hỗ trợ công tác lập quy hoạch khai thác bền vững và bảo tồn đa dạng sinh học biển Đông Bắc Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Loài hải sâm Cercodemas anceps có đặc điểm hình thái và phân bố ra sao?
Loài này thuộc họ Cucumariidae, cơ thể hình trụ thuôn nhọn dài khoảng 5 đến 7 cm, có màu hồng hoặc vàng hồng với 4 đường gờ chạy dọc thân. Tại Việt Nam, mẫu nghiên cứu được định danh chính xác tại vùng biển Bắc Vàn, đảo Cô Tô, Quảng Ninh ở độ sâu ven bờ từ 5 đến 7 mét.

Cấu trúc saponin của loài hải sâm này có gì đặc biệt so với thực vật trên cạn?
Saponin hải sâm thuộc nhóm triterpene khung holostan chứa vòng lacton đặc trưng, liên kết với chuỗi oligosaccharide gồm nhiều gốc đường sulfat hóa. Cấu trúc này tạo ra hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh mẽ hơn nhiều so với các saponin trung tính thông thường từ thực vật.

Nguyên lý xác định độc tính tế bào bằng phương pháp MTS trong nghiên cứu là gì?
Muối tetrazolium MTS hòa tan được các enzym dehydrogenase trong tế bào sống chuyển hóa thành hợp chất formazan màu hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 490 nm. Mật độ quang đo được phản ánh trực tiếp số lượng tế bào còn sống, từ đó tính toán chính xác chỉ số ức chế 50% sự tăng sinh tế bào.

Tại sao mô hình u rắn Sarcoma-180 trên chuột nhắt Swiss lại được lựa chọn?
Dòng tế bào Sarcoma-180 có tốc độ nhân đôi nhanh khoảng 15,5 giờ, dễ dàng tạo khối u rắn dưới da đồng nhất sau khi tiêm 1,5 triệu tế bào. Chuột nhắt Swiss 18-20g là mô hình động vật chuẩn có tính tương thích cao, giúp đánh giá chuẩn xác hiệu lực kháng u và độc tính toàn thân.

Chế phẩm sinh học từ hải sâm thể hiện ưu điểm gì so với thuốc đối chứng 6-Mercaptopurine?
Thuốc 6-Mercaptopurine gây ức chế tủy xương và làm giảm các chỉ số huyết học sau 25 ngày sử dụng liên tục. Ngược lại, chế phẩm sinh học nguồn gốc hải sâm kết hợp linh chi vừa ức chế khối u vừa duy trì ổn định trọng lượng cơ thể và các chỉ số máu ngoại vi của động vật.

Kết luận

1. Đã hoàn thành quy trình chiết xuất và phân lập thành công 2 hợp chất saponin triterpene tinh sạch từ hải sâm Cercodemas anceps gồm colochiroside A và philinopside A.
2. Đã xác định chi tiết cấu trúc hóa học của hợp chất mang chuỗi 5 đơn vị đường sulfat hóa bằng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 500 MHz.
3. Đã chứng minh hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ trên 3 dòng tế bào Sarcoma-180, MCF7, HCT116 thông qua cơ chế kích hoạt chết theo chương trình gắn với tín hiệu Annexin V.
4. Đã khẳng định hiệu lực ức chế u rắn thực nghiệm của chế phẩm sinh học trên chuột nhắt trắng ở liều 3,93 mg/kg thể trọng mà không gây độc tính huyết học.
5. Đã đóng góp dữ liệu khoa học nền tảng khẳng định tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Da gai tại vùng biển Đông Bắc Việt Nam.

Kế hoạch trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tới cần tập trung vào việc chuẩn hóa quy trình chiết xuất quy mô lớn và thử nghiệm độc tính bán trường diễn. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến việc phát triển thương mại hóa sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ biển được khuyến khích liên hệ hợp tác để tiếp tục mở rộng các thử nghiệm tiền lâm sàng chuyên sâu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook - Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới. Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung thư. Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên. Như vậy, bệnh ung thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức to lớn cho tất cả chúng ta.

Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%). Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư.

Tổ chức Y tế thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao. Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đã trở thành vấn nạn của xã hội ra sao. Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau.

Trong đó, xu hướng sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật nhất. Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của các tế bào ung thư. Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác động đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan trọng và được ưu tiên hàng đầu. 1 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chất saponin.

Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợp chất saponin. Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích: 1. Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps 2. Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo.

2 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Saponin và khả năng kháng u Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, có đặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi. Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng Latin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòng khi rung lắc mạnh với nước. Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là do saponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốc monosaccharide.

Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cực trong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước. Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá, hoa và hạt. Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anti- cancer) [11]. Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon, saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi triterpenes có đủ 30 carbon.

Các thành phần glycone của chúng thường là oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]. Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình 1.Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác nhau. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ chế tác động hóa sinh học của saponin. Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hình thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u.

Dioscin là 1 thành phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis. Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về 3 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng với tubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trên nhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10]. Vài loại saponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình và kích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10].

Đối với động vật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhau như polyphyllin D thuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24]. Trong khi đó, saponin kết hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều. Hơn nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn. Cơ chế kháng u của một số saponin Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp cũng rất đa dạng.

Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường khác nhau. Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u. Chúng làm giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là α- fetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11]. Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50 đối với tế bào ác tính.

Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh, saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương trình thông qua canxi [11]. Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích thích miễn dịch. Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở 4 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF. Avincin D và G gây ức chế sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức chế trùng hợp tubulin.

Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu trình tế bào ở pha G1. Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào, ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERT của telomere.