Nghiên cứu phân lập hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả

• Tác giả: Nguyễn Khắc Sinh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cường
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Saponin và khả năng kháng u
• 1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin
• 1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin
• 1.4. Saponin từ hải sâm
• 1.5. Nguồn saponin từ hải sâm. Một số phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học
• 1.6. Sắc kí lớp mỏng
• 1.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR)
• 1.8. Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thư
• 1.8.1. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào
• 1.8.2. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào
• 1.8.3. Mô hình động vật thí nghiệm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Loài hải sâm Cercodemas anceps
• 2.3. Mẫu chế phẩm sinh học. Dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180
• 2.4. Dòng tế bào ung thư vú MCF7
• 2.5. Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116
• 2.6. Chuột nhắt trắng Swiss
• 2.7. Hoá chất, thiết bị
• 2.8. Dụng cụ và vật tư tiêu hao
• 2.9. Phương pháp nghiên cứu
• 2.9.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm
• 2.9.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm
• 2.9.3. Phương pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp
• 2.9.4. Phương pháp xác định tế bào apoptosis dưới tác dụng của CPSH
• 2.9.5. Phương pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm
• 2.9.6. Phương pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí nghiệm
• 2.9.7. Các phương pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps
• 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được
• 3.3. Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập
• 3.4. Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình in vitro và in vivo
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hợp chất saponin kháng ung thư từ hải sâm

Hợp chất saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên có khả năng kháng ung thư mạnh mẽ. Chúng được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và động vật, trong đó có hải sâm. Nghiên cứu về Cercodemas anceps cho thấy tiềm năng lớn của các hợp chất này trong việc điều trị ung thư. Saponin có cấu trúc phức tạp, bao gồm các aglycone và gốc monosaccharide, tạo nên tính chất hoạt động bề mặt đặc biệt. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau.

1.1. Đặc điểm và cấu trúc của hợp chất saponin

Hợp chất saponin có cấu trúc phức tạp với hai phần chính: aglycone và glycone. Aglycone thường là một triterpen hoặc steroid, trong khi glycone là các gốc đường. Sự kết hợp này tạo ra khả năng tạo bọt và hoạt động kháng ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng cấu trúc của saponin ảnh hưởng đến hoạt tính kháng ung thư của chúng.

1.2. Tác dụng kháng ung thư của saponin từ hải sâm

Các hợp chất saponin từ hải sâm như Cercodemas anceps đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng các saponin này có thể kích thích quá trình apoptosis và ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị ung thư từ nguồn gốc tự nhiên.

II. Thách thức trong nghiên cứu hợp chất saponin kháng ung thư

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất saponin kháng ung thư từ hải sâm vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự phức tạp trong cấu trúc của các hợp chất này, dẫn đến khó khăn trong việc phân lập và xác định cấu trúc. Hơn nữa, sự đa dạng về hoạt tính sinh học của các loại saponin cũng tạo ra thách thức trong việc đánh giá hiệu quả điều trị.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập hợp chất saponin

Quá trình phân lập hợp chất saponin từ Cercodemas anceps thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp trong cấu trúc của chúng. Các phương pháp sắc ký và phân tích hiện đại như NMR và HPLC cần được áp dụng để đạt được hiệu quả cao trong việc tách chiết và xác định cấu trúc.

2.2. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư của saponin

Việc đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất saponin cần được thực hiện trên nhiều dòng tế bào khác nhau để có cái nhìn toàn diện về hiệu quả điều trị. Các mô hình in vitro và in vivo cần được sử dụng để xác định chính xác tác dụng của các hợp chất này.

III. Phương pháp nghiên cứu hợp chất saponin từ hải sâm

Nghiên cứu về hợp chất saponin từ Cercodemas anceps được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng ung thư. Sử dụng các kỹ thuật hiện đại giúp tối ưu hóa quy trình nghiên cứu và nâng cao độ chính xác của kết quả.

3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm

Quá trình phân lập hợp chất saponin từ Cercodemas anceps thường sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các mẫu được chiết xuất và phân tích để xác định các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư.

3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Sau khi phân lập, các hợp chất saponin cần được xác định cấu trúc bằng các phương pháp như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối. Điều này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các hợp chất này trong việc kháng ung thư.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất saponin từ Cercodemas anceps có hoạt tính kháng ung thư đáng kể. Các thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư cho thấy khả năng ức chế sự phát triển và kích thích apoptosis. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ nguồn gốc tự nhiên.

4.1. Kết quả thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư

Các thử nghiệm cho thấy hợp chất saponin từ hải sâm có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư MCF7 và HCT116. Giá trị IC50 cho thấy hiệu quả điều trị tiềm năng của các hợp chất này.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc kháng ung thư

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng ung thư từ hợp chất saponin. Việc kết hợp các hợp chất này với các liệu pháp điều trị hiện có có thể nâng cao hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về hợp chất saponin từ Cercodemas anceps đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và tối ưu hóa quy trình sản xuất. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hợp chất saponin

Nghiên cứu cần tiếp tục để khám phá thêm nhiều hợp chất saponin mới từ hải sâm và các nguồn tự nhiên khác. Việc phát triển các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm từ saponin

Các sản phẩm từ hợp chất saponin có thể được phát triển thành thuốc điều trị ung thư hiệu quả. Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học và ngành công nghiệp dược phẩm để đưa các sản phẩm này vào thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook - Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới. Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung thư. Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên. Như vậy, bệnh ung thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức to lớn cho tất cả chúng ta.

Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%). Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư.

Tổ chức Y tế thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao. Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đã trở thành vấn nạn của xã hội ra sao. Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau.

Trong đó, xu hướng sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật nhất. Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của các tế bào ung thư. Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác động đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan trọng và được ưu tiên hàng đầu. 1 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chất saponin.

Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợp chất saponin. Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích: 1. Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps 2. Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo.

2 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Saponin và khả năng kháng u Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, có đặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi. Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng Latin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòng khi rung lắc mạnh với nước. Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là do saponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốc monosaccharide.

Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cực trong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước. Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá, hoa và hạt. Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anti- cancer) [11]. Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon, saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi triterpenes có đủ 30 carbon.

Các thành phần glycone của chúng thường là oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]. Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình 1.Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác nhau. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ chế tác động hóa sinh học của saponin. Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hình thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u.

Dioscin là 1 thành phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis. Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về 3 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng với tubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trên nhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10]. Vài loại saponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình và kích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10].

Đối với động vật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhau như polyphyllin D thuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24]. Trong khi đó, saponin kết hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều. Hơn nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn. Cơ chế kháng u của một số saponin Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp cũng rất đa dạng.

Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường khác nhau. Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u. Chúng làm giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là α- fetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11]. Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50 đối với tế bào ác tính.

Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh, saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương trình thông qua canxi [11]. Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích thích miễn dịch. Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở 4 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF. Avincin D và G gây ức chế sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức chế trùng hợp tubulin.

Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu trình tế bào ở pha G1. Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào, ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERT của telomere.