Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học cây Vam (Diospyros dictyonema Heirn, Ebenaceae)

Nghiên cứu thành phần hóa học cây vam Diospyros dictyonema Heirn thuộc họ Ebenaceae, cung cấp thông tin quý giá cho y học và công nghiệp.

• Tác giả: Lục Quang Tấn
• Người hướng dẫn: Gs. Phan Tống Sơn
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học cây Vam Diospyros dictyonema. Heirn (Ebenaceae)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: Tổng quan về chi Thi (Diospyros), ̣ họ Thi (Ebenaceae)
• 1.1. Vài nét về thực vật chi Thị
• 1.2. Vài nét về thành phần hóa học chi Thị
• 1.3. Vài nét về các phương pháp chiết mẫu thực vật. Chọn dung môi chiết
• 1.4. Quá trình chiết
• 1.5. Vài nét chung về phương pháp sắc ký. Sắc ký lớp mỏng
• 1.6. Vài nét chung về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
• 1.7. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)
• 1.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu thực vật. Phương pháp phân lập các hợp chất. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
• 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất. Điểm nóng chảy (Mp)
• 2.4. Phổ khối lượng (ESI-MS)
• 2.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
• 2.6. Độ quay cực riêng [α]D
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và hóa chất
• 3.2. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu
• 3.3. Phân lập các hợp chất
• 3.4. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất
• 3.4.1. Hợp chất 1: 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol
• 3.4.2. Hợp chất 2: 5-Megastigmene-3,9-diol 3-O-β-D-glucopyranoside
• 3.4.3. Hợp chất 3: Kaempferol 3-O-α-L-(2′′,3′′-di-E-p-coumaroyl)rhamnopyranoside (2'',3''-Di-O-p-coumaroylafzelin)
• 3.4.4. Hợp chất 6: Quercetin 3-O-(2″-O-β-D-glucopyranosyl)-α-L-rhamnopyranoside
• 3.4.5. Hợp chất 7: Kaempferol 3-O-(2″-O-β-D-glucopyranosyl)-α-L-rhamnopyranoside
• 4. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1
• 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2
• 4.3. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3
• 4.4. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 4
• 4.5. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 5
• 4.6. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 6
• 4.7. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 7
• 4.8. Các hợp chất đã phân lập và xác định cấu trúc từ lá Vam
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây Vam Diospyros dictyonema Heirn và họ Ebenaceae

Cây Vam, hay còn gọi là Diospyros dictyonema Heirn, thuộc họ Ebenaceae, là một trong những loài thực vật có giá trị cao trong nghiên cứu hóa học thực vật. Chi Diospyros có khoảng 450-500 loài, chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới. Cây Vam không chỉ nổi bật với giá trị thương mại mà còn với các thành phần hóa học phong phú. Nghiên cứu về cây Vam giúp hiểu rõ hơn về các hợp chất hữu cơ và tiềm năng ứng dụng trong y học.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây Vam

Cây Vam là cây thân gỗ, có chiều cao trung bình từ 10 đến 20 mét. Lá cây có hình bầu dục, màu xanh đậm, và hoa có màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả của cây Vam có hình cầu, thường chín vào mùa hè. Đặc điểm sinh học này giúp cây thích nghi tốt với môi trường sống ở các khu rừng nhiệt đới.

1.2. Vai trò của họ Ebenaceae trong hệ sinh thái

Họ Ebenaceae không chỉ cung cấp gỗ quý mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự đa dạng sinh học. Các loài trong họ này thường là nơi cư trú của nhiều loài động vật và côn trùng, góp phần vào sự cân bằng sinh thái. Cây Vam, với các hợp chất hóa học độc đáo, cũng có thể là nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu dược lý.

II. Thách thức trong nghiên cứu hóa học cây Vam Diospyros dictyonema

Mặc dù cây Vam có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu hóa học của nó gặp phải một số thách thức. Đầu tiên, việc thu thập mẫu cây Vam trong tự nhiên không dễ dàng do sự phân bố hạn chế. Thứ hai, các phương pháp chiết xuất và phân tích hóa học cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả. Cuối cùng, việc xác định cấu trúc của các hợp chất hóa học từ cây Vam vẫn còn nhiều điều chưa được khám phá.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập mẫu

Việc thu thập mẫu cây Vam thường gặp khó khăn do địa hình hiểm trở và sự phân bố không đồng đều của loài này. Điều này ảnh hưởng đến khả năng nghiên cứu và phân tích các hợp chất hóa học có trong cây.

2.2. Thách thức trong phương pháp chiết xuất

Các phương pháp chiết xuất hiện tại chưa tối ưu cho cây Vam, dẫn đến việc thu được lượng hợp chất thấp. Cần nghiên cứu và phát triển các phương pháp chiết xuất mới để nâng cao hiệu quả thu hồi các hợp chất có giá trị.

III. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây Vam Diospyros dictyonema

Nghiên cứu hóa học cây Vam sử dụng nhiều phương pháp hiện đại để phân tích và xác định các hợp chất. Các phương pháp này bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), phổ hồng ngoại (IR), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Mỗi phương pháp có ưu điểm riêng, giúp cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học của các hợp chất.

3.1. Sắc ký lớp mỏng TLC trong phân tích

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp đơn giản và hiệu quả để phân tách các hợp chất trong mẫu chiết xuất từ cây Vam. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng sự hiện diện của các hợp chất chính và đánh giá độ tinh khiết của chúng.

3.2. Phổ hồng ngoại IR và ứng dụng

Phổ hồng ngoại (IR) được sử dụng để xác định các nhóm chức trong hợp chất hóa học. Phương pháp này giúp nhận diện các liên kết hóa học và cấu trúc phân tử của các hợp chất chiết xuất từ cây Vam.

3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những phương pháp mạnh mẽ nhất để xác định cấu trúc hóa học. NMR cung cấp thông tin chi tiết về môi trường hóa học của các nguyên tử trong phân tử, giúp xác định cấu trúc chính xác của các hợp chất từ cây Vam.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của cây Vam

Nghiên cứu về cây Vam đã dẫn đến việc phát hiện nhiều hợp chất hóa học có giá trị. Các hợp chất này không chỉ có tiềm năng ứng dụng trong y học mà còn có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy cây Vam có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm, mở ra hướng đi mới cho các sản phẩm tự nhiên.

4.1. Các hợp chất đã được phân lập

Trong quá trình nghiên cứu, nhiều hợp chất đã được phân lập từ cây Vam, bao gồm flavonoid, quinone và terpenoid. Những hợp chất này có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng.

4.2. Ứng dụng trong y học và công nghiệp

Các hợp chất chiết xuất từ cây Vam đã cho thấy hoạt tính sinh học đáng kể, bao gồm khả năng chống viêm và chống oxy hóa. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm y tế và mỹ phẩm từ nguồn gốc tự nhiên, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu cây Vam Diospyros dictyonema

Nghiên cứu cây Vam (Diospyros dictyonema) không chỉ góp phần làm phong phú thêm kho tàng hóa học thực vật mà còn mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y học và công nghiệp. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khám phá hết tiềm năng của loài cây này. Việc phát triển các phương pháp nghiên cứu mới và tối ưu hóa quy trình chiết xuất sẽ là chìa khóa để khai thác giá trị của cây Vam trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hóa học thực vật

Nghiên cứu hóa học thực vật sẽ tiếp tục phát triển, đặc biệt là trong việc tìm kiếm các hợp chất mới từ thiên nhiên. Cây Vam có thể là một trong những nguồn tài nguyên quý giá cho các nghiên cứu này.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất từ cây Vam. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức nghiên cứu sẽ giúp thúc đẩy tiến bộ trong lĩnh vực này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chi Thị (Diospyros), thuộc họ Thị (Ebenaceae), là một chi thực vật thân gỗ phong phú với quy mô khoảng 450 đến 500 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Trong lịch sử hóa sinh học, các loài thuộc chi này nổi tiếng với giá trị kinh tế cao từ gỗ Mun quý hiếm cũng như nguồn quả ăn truyền thống. Đến nay, các công trình khoa học quốc tế đã phát hiện và xác định cấu trúc của hơn 187 hợp chất tự nhiên từ chi Diospyros, tập trung chủ yếu vào các nhóm chất quinone, flavonoid và triterpenoid. Mặc dù vậy, loài cây Vam (Diospyros dictyonema Hiern.) – một loài cây ăn quả bản địa đặc trưng tại vùng châu thổ sông Hồng với chiều cao thân gỗ từ 5 đến 8 m – hoàn toàn chưa từng được khảo sát chuyên sâu về mặt hóa thực vật.

Nghiên cứu này được triển khai nhằm giải quyết sự thiếu hụt dữ liệu khoa học về cây Vam, với mục tiêu cụ thể là phân lập các hợp chất tự nhiên tinh khiết từ lá cây và giải mã chính xác cấu trúc hóa học của chúng. Mẫu thực vật gồm 2,0 kg lá cây khô thu hái tại huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định vào tháng 10 năm 2010 đã được tiến hành chiết tách và phân tích tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành ở Hà Nội. Kết quả đạt được có ý nghĩa khoa học sâu sắc khi lần đầu tiên bổ sung vào kho tàng hóa học thực vật 7 hợp chất tinh khiết từ cây Vam, trong đó có 1 hợp chất megastigmane lần đầu tiên được ghi nhận phát hiện trong tự nhiên. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ định hướng phát triển dược liệu và bảo tồn nguồn gen thực vật đặc hữu của Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các nền tảng lý thuyết cốt lõi của hóa học hợp chất thiên nhiên và hóa hữu cơ phân tích:

• Lý thuyết chiết tách và phân bố lỏng - lỏng: Dựa trên nguyên lý hòa tan có chọn lọc theo gradient độ phân cực tăng dần của các dung môi hữu cơ. Quá trình chiết ngấm kiệt bằng metanol giúp thu hồi tối đa các thành phần nội bào và ngoại bào, sau đó dịch chiết thô được phân chia thành các cặn phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng n-hexan, cloroform, etyl axetat và n-butanol.
• Nguyên lý sắc ký hấp phụ: Áp dụng cơ chế tương tác vi mô giữa chất hấp phụ (pha tĩnh) và dung môi rửa giải (pha động) dựa trên sự khác biệt về ái lực và hệ số phân bố $R_f$. Pha thường (Silica gel 60) được sử dụng để phân tách các chất theo cực tính, trong khi pha đảo (YMC/ODS) xử lý hiệu quả các phân đoạn phân cực cao chứa dẫn xuất glycoside.
• Hệ thống lý thuyết quang phổ nhận dạng phân tử: Sử dụng tổ hợp các phương pháp phổ học hiện đại để xác định công thức phân tử và cấu trúc lập thể. Khung lý thuyết bao gồm phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) để xác định khối lượng ion phân tử, cùng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT 90 và DEPT 135) và 2D-NMR ($^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC) để xác lập các liên kết không gian và khung carbon.
• Các khái niệm chuyên ngành chính: Khung megastigmane ($C_{13}$ nor-isoprenoid), flavonoid glycoside (dẫn xuất kaempferol, quercetin gắn gốc rhamnopyranosyl hoặc glucopyranosyl), liên kết ete nội vòng và hiệu ứng tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết.

Phương pháp nghiên cứu

• Quy mô và phương pháp chọn mẫu: Cỡ mẫu sử dụng là 2,0 kg bột lá khô cây Vam được thu hái ngẫu nhiên từ các cá thể trưởng thành tại huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định. Mẫu tiêu bản thực vật được giám định tên khoa học chính xác bởi chuyên gia phân loại thực vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và được lưu trữ mẫu chuẩn đối chứng.
• Quy trình chiết tách và phân tích:
  • Chiết ngâm: Mẫu bột lá khô được ngâm chiết kiệt trong dung môi metanol nguyên chất ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần ngâm trong 48 giờ) bên trong bình chiết dung tích 20 lít. Sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 120 g cặn chiết tổng metanol.
  • Phân bố phân đoạn: 120 g cặn tổng được hòa tan phân tán vào nước rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 10,0 g cặn n-hexan, 22,0 g cặn cloroform, 25,0 g cặn etyl axetat và 45,0 g cặn n-butanol.
  • Phân lập sắc ký: Tiến hành sắc ký cột (CC) trên chất hấp phụ Silica gel 60 (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho cặn cloroform, và sắc ký pha đảo YMC (cỡ hạt 30 - 50 $\mu$m) cho cặn etyl axetat. Quá trình tách được kiểm soát và định hướng liên tục bởi sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn pha thường $F_{254}$ và pha đảo RP18.
  • Xác định cấu trúc: Đo điểm nóng chảy trên thiết bị Kofler micro-hotstage; đo phổ ESI-MS trên máy Agilent 1100 LC-MSD Trap; đo độ quay cực trên máy JASCO DIP-1000; đo phổ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz) trên thiết bị Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer.
• Lý do lựa chọn phương pháp: Sự phối hợp giữa sắc ký cột pha thường và pha ngược trung áp cho phép làm sạch triệt để các chất có độ phân cực tương đương nhau trong dịch chiết thực vật phức tạp mà không gây thoái hóa chất. Phương pháp phổ NMR phân giải cao 500 MHz là công cụ không phá hủy mẫu, mang lại độ phân giải tín hiệu tối ưu để thiết lập vị trí từng liên kết dị nguyên tử.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tách chiết và tinh chế từ các phân đoạn chiết của lá cây Vam đã phân lập thành công 7 hợp chất hữu cơ sạch với cấu trúc phân tử được xác định rõ ràng:

• Phát hiện 1 - Đột phá về hợp chất megastigmane mới trong thiên nhiên: Từ 22,0 g cặn cloroform, đã phân lập được hợp chất 1 (15 mg) dưới dạng chất rắn không màu, nhiệt độ nóng chảy từ 178 đến 180°C. Phân tích quang phổ khẳng định đây là 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol ($C_{13}H_{24}O_3$, $M = 228\text{ g/mol}$). Hợp chất này trước đây chỉ được tạo ra bằng phản ứng thủy phân nhân tạo trong phòng thí nghiệm từ ascleposide D, và đây là lần đầu tiên được tìm thấy tồn tại trong trạng thái tự nhiên.
• Phát hiện 2 - Nhóm nor-isoprenoid và dẫn xuất đặc hữu: Phân lập thành công hợp chất 2 (10 mg, chất bột vô định hình màu trắng, $[\alpha]D^{25} = +30^\circ$) là 5-Megastigmene-3,9-diol 3-O-$\beta$-D-glucopyranoside ($C{19}H_{34}O_8$) và hợp chất 5 (10 mg, dạng dầu sệt không màu) được đặt tên là Diodictyonema A.
• Phát hiện 3 - Đa dạng flavonoid glycoside quý: Từ 25,0 g cặn etyl axetat, qua sắc ký pha đảo YMC đã phân lập được 4 dẫn xuất flavonoid có hoạt tính sinh học cao bao gồm: hợp chất 3 (7 mg, Platanoside hay Kaempferol 3-O-$\alpha$-L-(2″,3″-di-E-p-coumaroyl)rhamnopyranoside, $C_{39}H_{32}O_{14}$, $M = 724$), hợp chất 4 (9 mg, Afzelin, nhiệt độ nóng chảy 172 - 174°C, $M = 432$), hợp chất 6 (11 mg, Quercetin 3-O-(2″-O-$\beta$-D-glucopyranosyl)-$\alpha$-L-rhamnopyranoside) và hợp chất 7 (15 mg, Kaempferol 3-O-(2″-O-$\beta$-D-glucopyranosyl)-$\alpha$-L-rhamnopyranoside, $M = 594$).

Thảo luận kết quả

Cấu trúc của hợp chất 1 được luận giải chi tiết nhờ phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Phổ $^{13}\text{C}$-NMR và DEPT thể hiện 13 tín hiệu carbon, trong đó có 3 nhóm metyl ($\delta_C\text{ 23,46; 21,81; 25,70}$), 2 nhóm CH mang oxy ($\delta_C\text{ 66,69}$ và $68,78$), 1 nhóm $\text{CH}_2$ gắn oxy ($\delta_C\text{ 78,24}$), 1 carbon bậc bốn gắn oxy ($\delta_C\text{ 85,42}$) và 1 carbon bậc bốn tại $\delta_C\text{ 44,01}$. Trên phổ tương tác xa HMBC, tương tác giữa proton $H\text{-}11$ ($\delta_H\text{ 3,44}$ và $3,64$) với carbon $C\text{-}5$ ($\delta_C\text{ 85,42}$) chứng minh sự hình thành vòng tetrahydrofuran nội phân tử thông qua cầu oxy $C(5)\text{-}O\text{-}C(11)$. Tương tác giữa proton $H\text{-}10$ ($\delta_H\text{ 1,20}$) với carbon $C\text{-}9$ ($\delta_C\text{ 68,78}$) xác định vị trí nhóm hydroxy mạch nhánh.

Các dữ liệu định lượng và tương quan phân bố cặn chiết có thể được mô tả trực quan qua biểu đồ cơ cấu cặn chiết: từ 120 g dịch cô tổng metanol, tỷ lệ thu hồi cặn n-butanol chiếm cao nhất với 37,50% (45 g), tiếp theo là cặn etyl axetat đạt 20,83% (25 g), cặn cloroform chiếm 18,33% (22 g) và cặn n-hexan chiếm 8,33% (10 g). Các bảng đối chiếu phổ NMR đa chiều thể hiện sự tương thích hoàn toàn giữa hằng số tương tác spin ($J$) và độ dịch chuyển hóa học ($\delta$) thực nghiệm với các dữ liệu chuẩn quốc tế.

So sánh với các nghiên cứu trước đây trên các loài cùng chi Diospyros (vốn chủ yếu chứa các hợp chất naphthoquinone như plumbagin, diospyrin hoặc triterpene khung lupane), thành phần hóa học của cây Vam thể hiện tính đặc thù cao khi tập trung nhiều hợp chất khung megastigmane và các flavonoid được acyl hóa phức tạp bởi axit p-coumaric. Sự khác biệt này đóng vai trò là dấu chỉ điểm hóa phân loại thực vật (chemotaxonomy) quan trọng cho phân chi bản địa.

Đề xuất và khuyến nghị

• Mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng viêm, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và khả năng gây độc tế bào ung thư đối với 7 hợp chất tinh khiết đã phân lập, đặc biệt là hợp chất mới 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol và Platanoside với mục tiêu đạt giá trị $\text{IC}_{50} < 20\text{ }\mu\text{g/mL}$; hoàn thành trong thời gian 12 tháng do Viện Hóa học phối hợp cùng Viện Hóa sinh biển thực hiện.
• Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và làm sạch: Ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng điều chế áp suất cao (Prep-HPLC) nhằm nâng cao hiệu suất phân lập hợp chất 1 và hợp chất 7 lên thêm 25 - 30% so với phương pháp sắc ký cột truyền thống; giao bộ môn Hóa hữu cơ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên chủ trì triển khai trong giai đoạn 2026 - 2027.
• Quy hoạch vùng trồng và bảo tồn nguồn gen: Thiết lập chương trình nhân giống vô tính và bảo tồn cây Vam với quy mô trên 500 cá thể tại các tỉnh ven sông Hồng (Nam Định, Thái Bình) nhằm bảo tồn loài thực vật giàu tiềm năng này; đề xuất Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phối hợp các trường đại học thực hiện trong 24 tháng.
• Khảo sát hóa học các bộ phận khác: Mở rộng nghiên cứu phân tích thành phần hóa học trên vỏ thân, rễ và quả chín của cây Vam để phát hiện thêm các dẫn xuất naphthoquinone và triterpenoid mới; giao nhóm nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên thực hiện trong vòng 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Các nhà nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên và hóa dược: Sử dụng dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR phân giải cao làm tài liệu quy chuẩn để tra cứu, đối chiếu khi xác định cấu trúc các hợp chất nor-isoprenoid $C_{13}$ và flavonoid glycoside.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Hóa học, Dược học: Nắm bắt quy trình thực nghiệm mẫu mực từ khâu xử lý mẫu lá thực vật, lựa chọn dung môi phân đoạn lỏng - lỏng, kỹ thuật nhồi cột sắc ký khô/ướt đến các bước phân tích dữ liệu ESI-MS, DEPT và HMBC.
• Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất dược mỹ phẩm: Tham khảo nguồn dẫn chất thực vật có tiềm năng chống oxy hóa mạnh (flavonoid và megastigmane) để định hướng chiết xuất hoạt chất ứng dụng vào các dòng sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên.
• Các nhà thực vật học và quản lý bảo tồn sinh học: Bổ sung cơ sở dữ liệu hóa phân loại (chemotaxonomy) của chi Diospyros, phục vụ công tác giám định, đánh giá giá trị kinh tế - dược liệu và bảo tồn đa dạng sinh vật đồng bằng Bắc Bộ.

Câu hỏi thường gặp

• Đóng góp khoa học mới nhất của luận văn là gì? Luận văn lần đầu tiên công bố sự tồn tại của hợp chất 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol (hợp chất 1, 15 mg) trong tự nhiên từ lá cây Vam. Trước nghiên cứu này, cấu trúc $C_{13}H_{24}O_3$ chỉ được biết đến như một sản phẩm thủy phân bán tổng hợp trong phòng thí nghiệm.
• Hệ thống sắc ký nào đã được áp dụng để phân lập các chất sạch? Nghiên cứu kết hợp sắc ký cột pha thường Silica gel 60 (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm) với hệ dung môi cloroform/metanol và sắc ký pha đảo YMC (30 - 50 $\mu$m) dùng hệ metanol/nước, giúp tách thành công các chất có độ phân cực gần nhau.
• Cấu trúc không gian của các hợp chất được chứng minh bằng cách nào? Cấu trúc được giải đoán chính xác bằng tổ hợp phổ ESI-MS xác định khối lượng, phổ cộng hưởng từ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz), $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz), DEPT, cùng các kỹ thuật tương tác 2D-NMR như $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, HSQC và HMBC trên máy Bruker AM500.
• Tại sao lại chọn phân đoạn chiết etyl axetat để tách flavonoid? Cặn etyl axetat thu được 25 g từ 120 g cặn tổng metanol có độ phân cực trung bình cao, là môi trường hòa tan tối ưu cho các hợp chất flavonoid mang các gốc đường glycoside như rhamnose và glucose.
• Nguồn gốc mẫu lá cây Vam trong nghiên cứu được thu thập từ đâu? Toàn bộ 2,0 kg mẫu lá cây Vam phục vụ nghiên cứu được thu hái tại huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định vào tháng 10/2010, sau đó được định danh khoa học chính xác bởi chuyên gia phân loại thực vật.

Kết luận

• Đã xử lý và chiết xuất thành công 120 g cặn tổng metanol từ 2,0 kg lá khô cây Vam (Diospyros dictyonema Hiern.) thu hái tại Nam Định.
• Phân lập và làm sạch hoàn toàn 7 hợp chất hữu cơ có độ tinh khiết cao thuộc nhóm megastigmane và flavonoid glycoside.
• Lần đầu tiên phát hiện hợp chất 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol trong giới tự nhiên và tìm ra hợp chất Diodictyonema A.
• Xác lập đầy đủ các hằng số vật lý, dữ kiện phổ ESI-MS, $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR cho toàn bộ 7 hợp chất được phân lập.
• Đề ra lộ trình 12 - 24 tháng nhằm nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro và mở rộng khảo sát các bộ phận rễ, thân, quả của cây Vam.

Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm đến việc phát triển hoạt chất từ nguồn thực vật bản địa hãy đẩy mạnh hợp tác nghiên cứu để đưa các phát hiện khoa học từ cây Vam ứng dụng hiệu quả vào thực tiễn y dược học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………. Tổng quan về chi Thi ̣ (Diospyros), họ Thi ̣(Ebenaceae). Vài nét về thực vật chi Thị 3 1. Vài nét về thành phần hóa học chi Thị 6 1.

Vài nét về các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật. Chọn dung môi chiết 17 1. Quá trình chiết 18 1. Vài nét chung về phƣơng pháp sắc ký.

Sắc ký lớp mỏng 20 1. Vài nét chung về các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) 21 1. Phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy) 21 1.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 21 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Mẫu thực vật. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất.

Sắc ký lớp mỏng (TLC) 25 2. Sắc ký lớp mỏng điều chế 25 2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. Điểm nóng chảy (Mp) 25 2.

Phổ khối lƣợng (ESI-MS) 25 2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 26 2. Độ quay cực riêng []D 26 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIÊM ̣ VÀ KẾT QUẢ.

Thiế t bi,̣ dụng cụ thí nghiệm và hóa chất. 27 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thiế t bi,̣ dụng cụ 27 3. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất.

Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu 27 3. Phân lập các hợp chất …………………………………………………. Hằ ng số vâ ̣t lý và các dƣ̃ kiê ̣n phổ của các hơ ̣p chấ t. Hơ ̣p chấ t 1: 5,11-Epoxy-3,9-megastigmanediol 33 3.

Hơ ̣p chấ t 2: 5-Megastigmene-3,9-diol 3-O--D-glucopyranoside 33 3. Hơ ̣p chấ t 3: Kaempferol 3-O-α -L-(2′′,3′′-di-E-p- coumaroyl)rhamnopyranoside (2'',3''-Di-O-p-coumaroylafzelin. Hơ ̣p chấ t 6: Quercetin 3-O-(2″-O--D-glucopyranosyl)-α-L- rhamnopyranoside 36 3. Hơ ̣p chấ t 7: Kaempferol 3-O-(2″-O--D-glucopyranosyl)-α-L- rhamnopyranoside 36 CHƢƠNG 4.

THẢO LUẬN KẾT QUẢ. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3.

Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 4. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 5. Xác định cấ u trúc hóa ho ̣c của hơ ̣p chấ t 6. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 7.

Các hợp chất đã phân lập và xác định cấu trúc từ lá Vam. 74 KẾT LUẬN…………………………………………………………………………75 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….77 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2. Ảnh quả và lá cây Vam .24 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ảnh hoa cây Vam.

Phổ 1H-NMR của 1. Phổ 13C-NMR của 1…………………………………………………. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của 1. Phổ 1H-1H COSY của 1.

Cấ u trúc hóa ho ̣c của 1. Các tƣơng tác HMBC và 1H-1H COSY chủ yế u của 1. Phổ HSQC của 1. Phổ HMBC của 1.

Cấ u trúc hóa ho ̣c của 2. Phổ 1H-NMR của 2. Phổ 13C-NMR của 2. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của 2.

Phổ HSQC của 2. Phổ HMBC của 2. Mô ̣t số tƣơng tác HMBC chủ yế u của 2. Phổ 1H-NMR của 3.

Phổ 13C-NMR và DEPT của 3. Cấ u trúc hóa ho ̣c của 3. Phổ khố i lƣơ ̣ng của 3. Cấ u trúc hóa ho ̣c của 4.

Phổ 1H-NMR của 4. Phổ 13C-NMR và DEPT của 4. Phổ khố i lƣơ ̣ng của 4. Phổ 1H-NMR của 5.

Phổ 13C-NMR và DEPT của 5. Cấ u trúc hóa ho ̣c của 5………………………………………………. Mô ̣t số tƣơng tác HMBC chính của 5. Phổ khố i lƣơ ̣ng của 5.

Phổ HSQC của 5. Phổ HMBC của 5 .65 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phổ 1H-NMR của 6. Phổ 13C-NMR và DEPT của 6.

Phổ khố i lƣơ ̣ng của 6. Cấ u trúc hóa ho ̣c của 6. Cấ u trúc hóa ho ̣c của 7. Phổ 1H-NMR của 7.

Phổ 13C-NMR của 7. Phổ khố i lƣơ ̣ng của 7 .72 DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Bảng 1. Các hợp chất đã phân lập đƣợc từ chi Diospyros…………………….2: Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết metanol của cây Vam……………. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết cloroform…………………….

Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết Ethyl acetat………………. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 2 và các chất tham khảo. Dƣ̃ kiê ̣n phổ NMR của 3 và chất tham khảo.

Dƣ̃ kiê ̣n phổ của 4. Dƣ̃ kiê ̣n phổ của 5 và chất tham khảo. Dƣ̃ kiê ̣n phổ NMR của 6. Dƣ̃ kiê ̣n phổ NMR của 7……………………………………………….73 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cô ̣ng hƣởng tƣ̀ ha ̣t nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement Phổ DEPT by Polarisation Transfer 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khố i ion hóa phun mù điê ̣n Spectrum tƣ̉ FAB-MS Fast Atom Bombardment Phổ khố i lƣơ ̣ng bắ n phá Mass Spectrometry nguyên tƣ̉ nhanh 1 H-1H COSY 1 H-1H Chemical Shift Phổ COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Phổ cô ̣ng hƣởng tƣ̀ ha ̣t nhân Spectroscopy proton HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác di ̣ha ̣t nhân qua Connectivity nhiề u liên kế t HR-TOF- High Resolution Time Phổ khố i phân giải cao MS of-Flight Mass Spectrometer HSQC Heteronuclear Single- Phổ tƣơng tác di ̣ha ̣t nhân qua 1 Quantum Coherence liên kế t IR Infrared Spectroscopy Phổ hồ ng ngoa ̣i IUPAC International Union of Pure Hiê ̣p hô ̣i Hóa học lý thuyết và and Applied Chemistry ứng dụng Quố c tế TLC Thin layer chromatography Sắ c ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilan Tetrametyl silan 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1.

Tổng quan về chi Thi (Diospyros), ̣ họ Thi (Ebenaceae) ̣ 1. Vài nét về thực vật chi Thị Chi Thị (tên khoa học: Diospyros) là một chi (bao gồm cả những loài trƣớc đây có tên chi là Maba) gồ m có khoảng 450-500 loài. Các cây thuộc chi này đều là cây thân gỗ. Phần lớn chúng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, chỉ một số ít loài sinh sống ở khu vực ôn đới.

Chi này bao gồm một số loài có giá trị thƣơng mại quan trọng, hoặc là để lấy quả ăn (bao gồm các loài Hồng, Thị, Cậy nhƣ D. virginiana) hoặc là để lấy gỗ. Có hai nhóm gỗ có giá trị thƣơng mại là gỗ Mun trơn: loại gỗ Mun đen thuần túy (đáng chú ý là D. mun) và gỗ Mun sọc (Mun vàng hay Mun Macassar - D.

Các loài trong chi Diospyros thƣờng bị ấu trùng của một số loài bƣớm thuộc bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) phá hại nhƣ Gymnoscelis rufifasciata, Eupseudosoma aberrans và Hypercompe indecisa. Dƣới đây là mô ̣t một số loài tiêu biể u của chi Diospyros  D. blancoi (đồng nghĩa: Cavanillea philippensis, D. philippensis): Thị Đài Loan, Thị lông.

Có nguồn gốc từ Philipin. Quả màu đỏ tƣơi khi chín. canaliculata (đồng nghĩa D. castanea (đồng nghĩa: Maba castanea): Thị dẻ  D.

celebica: Mun vàng, Mun Macassar. crassiflora: Mun châu Phi, Mun Benin, Thị châu Phi  D. Confertifolia: Đông Nam Á. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

digyna (đồng nghĩa: D. obtusifolia): Thị đen. Có nguồn gốc ở Mexico, quả có vỏ màu xanh và cùi thịt trắng khi còn xanh và chuyển thành đen khi chín. ebenum (đồng nghĩa: D.

glaberrima): ô mộc, Mun Ceylon, Thị Ceylon, Mun Mauritius, Mun thị. Loài cây của vùng nhiệt đới châu Á với gỗ lõi có màu sẫm đƣợc dùng trong đồ gỗ mỹ nghệ. kaki: Hồng, Thị Nhật Bản, Thị Trung Quốc  D. kurzii: Cẩm thị, Cẩm Andaman.

Có nguồn gốc ở Tây Nam Á và đông nam châu Âu. Đƣợc ngƣời Hy Lạp cổ đại biết đến nhƣ là "quả của Thƣợng Đế", tức dios pyros, từ đây mà có tên khoa học của chi này. Quả nhỏ có mùi vị giống nhƣ cả Mận và Chà là. mabacea: Mun quả đỏ, miền bắc New South Wales - loài đang nguy cấp cao độ.

macassar: Mun Macassar, Mun Ấn Độ  D. macrocalyx (đồng nghĩa: D. loureiroana, Royena macrocalyx). major: có nhiều ở bờ biển phía đông Australia.

malabarica (đồng nghĩa: D. peregrina): Cƣờm thị, Thị đầu heo, Thị Ấn Độ, Mun núi  D. malabarica thứ malabarica: Thị dại Ấn Độ  D. malabarica thứ siamensis: Thị dại Thái Lan, Mun dại Thái Lan  D.

maritima: Cẩm thị, vàng nghệ 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. marmorata: Mun Andaman,  D. melanoxylon: Mun Đông Ấn. Lá của loài này đƣợc thu hái để làm thuốc lá bidi của ngƣời Ấn Độ.

mespiliformis: Mun châu Phi  D. nitida: Thị đen  D. oleifera: Thị dầu  D. pentamera: Mun sim, Thị xám - bờ biển phía đông Australia.

rubra: Thị rừng  D. rumphii (đồng nghĩa: D. utilis): Mun đen, Mun Macassar  D. saletti: Mun sọc  D.

sandwicensis: Loài cây đặc hữu của Hawaii, tại đây gọi là lama. siamang: (đồng nghĩa D. siamensic: Cẩm thị, Thị Thái Lan  D. sinensis: Thị núi, Thị Trung Quốc  D.

texana: Thị Texas. Cây bụi nhiều cành hay cây thân gỗ nhỏ có nguồn gốc ở miền trung và tây Texas cũng nhƣ tây nam Oklahoma, tại đây chúng sống trên các sƣờn núi đá khô cằn. Quả nhỏ hơn quả của cây Thị châu Phi, đƣợc nhiều loài chim và thú ăn. Nó đã từng đƣợc ngƣời Mỹ bản địa dùng làm thuốc nhuộm để thuộc da.

tomentosa: Mun Nepal  D. tonkinensis: Mun sọc  D. trichophylla (đồng nghĩa: D. venosa (đồng nghĩa: D.

8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. virginiana: Thị châu Mỹ, Thị Mỹ, Mun trắng. Có nguồn gốc ở miền đông Bắc Mỹ. Vài nét về thành phần hóa học chi Thị Thành phần hóa học của chi Thị rất phong phú và đa dang bao gồm nhiều lớp chấ t có cấ u trúc khá lý thú.

Các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đƣợc 187 hơ ̣p chấ t , trong đó chủ yế u là các hơ ̣p chấ t flavonoi d, quinone, tecpenoid v. Tuy nhiên , cho đế n nay vẫn chƣa có nghiên cƣ́u nào về thành phầ n hóa học của cây D. Chính vì vậy , viê ̣c nghiên cƣ́u thành phầ n hóa học của cây D. dictyonema có ý nghĩa khoa học cao.

Các hợp chất đã phân lập đƣợc từ chi Diospyros Ký Tên hơ ̣p chấ t CTPT Phân lâ ̣p tƣ̀ loài hiêụ 1 Batocanone C22H14O7 Diospyros batocana 2 Ilexol C30H50O Diospyros spp. 3 Diospyrososide C21H32O13 Diospyros angustifolia 4 3,3'-Bi[6-hydroxy-5-methoxy-2- C24H14O8 Diospyros melanoxylon methylnaphthoquinone] 5 3,8'-Biplumbagin C22H14O6 Diospyros maritima 6 Kakispyrol C22H24O9 Diospyros kaki 7 Biramentaceone C22H14O6 Diospyros montana 8 6'',8'-Bisdiosquinone C44H26O14 Diospyros mafiensis 9 Bisisodiospyrin C22H14O7 D. japonica ; Diospyros morrisiana; D. lycioides 10 3-Bromo-5-hydroxy-2-methyl-1,4- C11H7BrO3 Diospyros maritima naphthoquinone 11 Canaliculatin C21H14O6 Diospyros canaliculata 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.