Nghiên cứu đặc điểm hình thái và DNA barcode của loài Macrosolen tricolor tại Hưng Yên và Hà Nội

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu nghiên cứu đặc điểm hình thái vi phẫu và dna barcode của loài macrosolen tricolor lecomte dans thu, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất

• Tác giả: Vũ Hồng Ngọc
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Quỳnh Nga
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hình Thái Và DNA Barcode Của Loài Macrosolen Tricolor Tại Hưng Yên Và Hà Nội
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tổng quan về họ Loranthaceae
• 1.2. Tổng quan về chi Macrosolen
• 1.2.1. Vị trí phân loại thực vật
• 1.2.2. Nghiên cứu về chi Macrosolen trên thế giới
• 1.2.3. Nghiên cứu về chi Macrosolen tại Việt Nam
• 1.3. Khái quát nghiên cứu về loài Macrosolen tricolor
• 1.3.1. Phân bố
• 1.3.2. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái
• 1.3.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng
• 1.4. Nghiên cứu DNA barcode
• 1.4.1. Ứng dụng DNA barcode trong nghiên cứu định danh thực vật
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp kế thừa tài liệu
• 2.2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu vật
• 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái so sánh
• 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
• 2.2.5. Phương pháp sinh học phân tử
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xác định tên khoa học
• 3.2. Đặc điểm hình thái
• 3.3. Đặc điểm vi phẫu
• 3.3.1. Đặc điểm vi phẫu thân và lá
• 3.3.2. Đặc điểm bột dược liệu
• 3.4. Xác định loài dựa trên chỉ thị rbcL
• 3.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và khuyếch đại vùng gen rbcL
• 3.4.2. Kết quả giải trình tự
• 3.4.3. Kết quả xác định loài dựa trên công cụ BLAST
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• A. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• B. DANH MỤC BẢNG
• C. DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hình thái và DNA barcode của Macrosolen tricolor

Nghiên cứu hình thái và DNA barcode của loài Macrosolen tricolor tại Hưng Yên và Hà Nội là một bước tiến quan trọng trong việc phân loại và nhận diện thực vật. Loài này thuộc họ Loranthaceae, nổi bật với đặc điểm hình thái độc đáo và giá trị dược liệu cao. Việc nghiên cứu không chỉ giúp xác định chính xác loài mà còn góp phần bảo tồn biodiversity và phát triển các ứng dụng y học từ thực vật.

1.1. Đặc điểm hình thái của loài Macrosolen tricolor

Loài Macrosolen tricolor có hình thái đặc trưng với cây bụi cao khoảng 0,5m, cành màu xám và lá hình trứng ngược. Đặc điểm này giúp phân biệt loài với các loài khác trong họ Tầm gửi.

1.2. Tầm quan trọng của DNA barcode trong nghiên cứu thực vật

Phương pháp DNA barcode giúp xác định chính xác loài thực vật thông qua phân tích gen. Điều này đặc biệt hữu ích trong việc phân loại các loài có hình thái tương đồng nhưng khác nhau về gen.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu Macrosolen tricolor

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về Macrosolen tricolor, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phân loại và nhận diện loài. Các loài trong họ Loranthaceae thường có hình thái tương đồng, gây khó khăn trong việc xác định chính xác. Hơn nữa, việc thu thập mẫu vật từ các địa điểm khác nhau cũng gặp nhiều khó khăn do điều kiện môi trường và sự phân bố không đồng đều.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập mẫu vật

Việc thu thập mẫu vật từ Hưng Yên và Hà Nội gặp khó khăn do điều kiện khí hậu và địa hình. Điều này ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng mẫu thu thập.

2.2. Sự tương đồng giữa các loài trong họ Loranthaceae

Nhiều loài trong họ Loranthaceae có hình thái tương tự nhau, gây khó khăn trong việc phân loại. Điều này đòi hỏi các phương pháp phân tích gen để xác định chính xác.

III. Phương pháp nghiên cứu hình thái và DNA barcode của Macrosolen tricolor

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để phân tích hình thái và DNA barcode của Macrosolen tricolor. Các mẫu vật được thu thập từ Hưng Yên và Hà Nội, sau đó tiến hành phân tích hình thái và gen để xác định đặc điểm riêng biệt của loài. Phương pháp này không chỉ giúp nhận diện loài mà còn cung cấp dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu vật

Mẫu vật được thu thập từ các địa điểm khác nhau và xử lý theo quy trình chuẩn để đảm bảo độ chính xác trong phân tích. Việc này bao gồm cả việc bảo quản mẫu và chuẩn bị cho các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Phân tích hình thái và vi phẫu

Phân tích hình thái và vi phẫu giúp xác định các đặc điểm cấu trúc của loài. Các thông số như kích thước lá, hình dạng hoa được ghi nhận chi tiết để phục vụ cho việc phân loại.

3.3. Phân tích DNA barcode

Phân tích DNA barcode được thực hiện để xác định trình tự gen rbcL. Kết quả giúp so sánh với các mẫu đã công bố trên Genbank, từ đó xác định chính xác loài.

IV. Kết quả nghiên cứu hình thái và DNA barcode của Macrosolen tricolor

Kết quả nghiên cứu cho thấy Macrosolen tricolor có những đặc điểm hình thái rõ ràng và DNA barcode xác định chính xác loài. Các mẫu vật thu thập từ Hưng Yên và Hà Nội đều cho kết quả tương đồng với các mẫu đã công bố trước đó. Điều này khẳng định tính chính xác của phương pháp nghiên cứu và giá trị của loài trong y học cổ truyền.

4.1. Đặc điểm hình thái và vi phẫu

Các đặc điểm hình thái như kích thước lá, hình dạng hoa được ghi nhận rõ ràng. Vi phẫu cho thấy cấu trúc tế bào đặc trưng của loài, giúp phân biệt với các loài khác.

4.2. Kết quả phân tích DNA barcode

Kết quả phân tích DNA barcode cho thấy trình tự gen rbcL của Macrosolen tricolor tương đồng với các mẫu đã công bố, khẳng định tính chính xác trong phân loại.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu Macrosolen tricolor

Nghiên cứu về Macrosolen tricolor không chỉ có giá trị trong việc phân loại mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong y học. Loài này được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền để chữa trị nhiều bệnh lý. Việc xác định chính xác loài giúp nâng cao hiệu quả sử dụng và bảo tồn nguồn dược liệu quý giá này.

5.1. Giá trị dược liệu của Macrosolen tricolor

Loài Macrosolen tricolor được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa trị các bệnh như gãy xương, tiêu chảy. Nghiên cứu cho thấy loài này có tiềm năng lớn trong việc phát triển thành thuốc.

5.2. Bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu

Việc nghiên cứu và xác định chính xác loài giúp bảo tồn nguồn dược liệu quý giá. Điều này không chỉ có lợi cho y học mà còn cho sự phát triển bền vững của hệ sinh thái.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu Macrosolen tricolor

Nghiên cứu hình thái và DNA barcode của Macrosolen tricolor tại Hưng Yên và Hà Nội đã đạt được những kết quả khả quan. Việc xác định chính xác loài và các đặc điểm hình thái mở ra nhiều cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về loài này để khai thác tối đa giá trị dược liệu và bảo tồn nguồn gen.

6.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học từ Macrosolen tricolor. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về mối quan hệ giữa Macrosolen tricolor và các loài khác trong họ Loranthaceae. Điều này sẽ giúp làm rõ hơn về sự đa dạng sinh học và giá trị sử dụng của loài.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Họ Tầm gửi (Loranthaceae) bao gồm phần lớn các loài thực vật bán ký sinh trên thân gỗ, phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong y học cổ truyền Việt Nam, nhiều loài thuộc họ này được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Trong đó, Tang ký sinh là vị thuốc phổ biến được dùng trong các bài thuốc điều trị bệnh lý cơ xương khớp. Theo quy chuẩn của Dược điển Việt Nam V (2017), dược liệu Tang ký sinh chính thức được quy định thu hái từ loài Scurrula parasitica L. ký sinh trên cây Dâu tằm (Morus alba L.).

Tuy nhiên, trên thực tế thu hái thương phẩm, người dân thường nhầm lẫn hoặc cố ý thu hái lẫn lộn nhiều loài Tầm gửi khác nhau mọc trên cây Dâu, điển hình là loài Đại cán ba màu — có tên khoa học là Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser. Loài này cũng được lưu truyền trong kinh nghiệm dân gian với công dụng giã đắp bó gãy xương và hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa. Một số nghiên cứu hiện đại gần đây đã phân lập được hợp chất mới Macrotricolorin A từ loài này, đồng thời chứng minh các phân đoạn chiết xuất có hoạt tính chống viêm, bảo vệ gan và hạ đường huyết. Mặc dù có giá trị dược dụng tiềm năng, Dược điển Việt Nam V hiện chưa có chuyên luận hay bất kỳ mô tả quy chuẩn nào về đặc điểm hình thái, cấu trúc giải phẫu hiển vi cũng như chỉ thị phân tử để nhận diện loài Macrosolen tricolor. Việc thiếu hụt bộ dữ liệu chuẩn hóa dẫn đến nguy cơ nhầm lẫn loài trong thu hái, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng và tính an toàn của dược liệu.

Nhằm giải quyết vấn đề kiểm định và chuẩn hóa dược liệu, tác giả Vũ Hồng Ngọc (Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội) đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp với hai mục tiêu cụ thể:

1. Nghiên cứu và xác định được đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu của loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser).
2. Xác định được DNA barcode của loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser) được thu thập ở 2 địa điểm là Hưng Yên và Hà Nội và so sánh với trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank.

• Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu tiêu bản tươi và tiêu bản khô của loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser) sống bán ký sinh trên các cây chủ (Dâu tằm, Bưởi, Hồng).
• Phạm vi không gian: Huyện Khoái Châu (tỉnh Hưng Yên) và huyện Gia Lâm (thành phố Hà Nội).
• Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu thực địa được thu thập trong giai đoạn từ tháng 8/2022 đến tháng 4/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận kết hợp chặt chẽ giữa phân loại học thực vật cổ điển (hình thái so sánh, giải phẫu hiển vi) và sinh học phân tử hiện đại (chỉ thị DNA barcode), căn cứ trên các khung lý thuyết và phương pháp sau:

• Khung phân loại thực vật và hệ thống tiến hóa: Phân loại theo hệ thống Angiosperm Phylogeny Group IV (APG IV, 2016), công trình phân loại họ Loranthaceae của Nickrent (2008), tài liệu Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2000), luận án phân loại họ Tầm gửi của Lê Ngọc Hân (2014) và mô tả gốc của Lecomte (1914), Danser (1929).
• Khung lý thuyết DNA Barcode: Dựa trên tiêu chuẩn của Hiệp hội Mã vạch Sự sống (CBOL - 2009) về việc sử dụng các đoạn gen lục lạp bảo thủ kết hợp đa hình, trọng tâm là vùng gen mã hóa tiểu đơn vị lớn của enzym RuBisCO (rbcL).
• Phương pháp thu thập và xử lý mẫu vật: Áp dụng phương pháp thu mẫu thực vật của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) để xử lý tiêu bản hình thái. Mẫu phục vụ tách chiết DNA được bảo quản lá non bằng phương pháp "Túi trà" (Teabag method) trong hộp kín chứa hạt hút ẩm silicagel. Đối chiếu tiêu bản chuẩn quốc tế Syntypus Pierre 6354 (K000844671) tại Royal Botanic Gardens, Kew và tiêu bản lưu trữ tại Viện Dược liệu (NIMM).
• Phương pháp giải phẫu và kiểm nghiệm hiển vi: Thực hiện theo quy trình trong tài liệu Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi (Nguyễn Viết Thân). Thân và lá tươi (lấy vị trí 1/3 từ cuống lá) được cắt lát mỏng bằng dao lam, tẩy trắng mô bằng dung dịch nước Javen trong 20–30 phút, rửa sạch, trung hòa bằng dung dịch acid acetic 1% trong 10–15 phút, sau đó nhuộm kép bằng dung dịch xanh methylene 1% (10–15 giây) và đỏ carmin 0,5% (khoảng 5 phút). Tiêu bản vi phẫu và bột dược liệu (sấy ở 60°C, tán mịn, soi trong nước cất) được quan sát trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại 4x, 10x, 20x, 40x và chụp ảnh bằng phần mềm cellSens Entry.
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số: Tách chiết từ mô lá theo phương pháp Doyle & Doyle (1990) có tối ưu hóa, sử dụng đệm CTAB bổ sung β-mercaptoethanol, ly tâm phân tách bằng chloroform:isoamyl alcohol, tủa DNA bằng isopropanol lạnh, rửa tủa bằng cồn EtOH 70% và hòa tan bảo quản trong đệm TE. Đánh giá chất lượng và nồng độ DNA bằng điện di trên gel agarose 1% (đệm TBE 1X) so sánh với chuẩn thang λDNA trên máy soi gel UVP Transilluminator PLUS.
  • Khuếch đại PCR vùng gen rbcL: Sử dụng cặp mồi rbcLaF (5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’) và rbcLaR (5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’). Hỗn hợp phản ứng 25 µL gồm 12,5 µL DreamTaq 2X Master Mix, 1,25 µL mỗi mồi (0,5 µM), 2,5 µL dịch DNA khuôn và 7,5 µL nước cất khử ion. Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 95°C trong 30 giây; 35 chu kỳ lặp lại (95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 54°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây); kiểm tra kích thước sản phẩm (~600 bp) bằng điện di gel agarose 1% với thang chuẩn 1 kb DNA Ladder.
  • Xử lý dữ liệu và phân tích tin sinh học: Sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger. Dữ liệu nucleotide được kiểm tra, ghép nối và xử lý trên phần mềm Geneious, sau đó đối chiếu định danh loài trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng thuật toán BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Ký hiệu mẫu	Loài xác định	Cây chủ	Địa điểm thu mẫu	Thời gian thu mẫu
QN44	Macrosolen tricolor	Cây Dâu	Khoái Châu, Hưng Yên	19/08/2022
QN03	Macrosolen tricolor	Cây Dâu	Khoái Châu, Hưng Yên	10/02/2023
QN04	Macrosolen tricolor	Cây Bưởi	Khoái Châu, Hưng Yên	10/02/2023
QN05	Macrosolen tricolor	Cây Hồng	Khoái Châu, Hưng Yên	10/02/2023
QN29	Macrosolen tricolor	Cây Dâu	Gia Lâm, Hà Nội	23/03/2023
QN30	Macrosolen tricolor	Cây Dâu	Gia Lâm, Hà Nội	23/03/2023
QN42	Macrosolen tricolor	Cây Dâu	Khoái Châu, Hưng Yên	08/04/2023

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện cơ sở dữ liệu học thuật về họ Tầm gửi (Loranthaceae) và chi Macrosolen. Họ Loranthaceae có khoảng hơn 70 chi với gần 1000 loài phân bố toàn cầu; tại Việt Nam đã ghi nhận 6 chi (Dendrophthoe, Elytranthe, Helixanthera, Macrosolen, Scurrula, Taxillus) với khoảng 29–33 loài. Chi Macrosolen hiện ghi nhận 42 loài trên thế giới; riêng tại Việt Nam có khoảng 7–8 loài.

Tác giả đi sâu tổng quan về loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser; tên đồng nghĩa: Elytranthe tricolor Lecomte, 1914): từ phân bố địa lý tự nhiên tại miền Bắc, miền Trung Việt Nam đến thành phần hóa học (phân lập các hợp chất Quercetin 3-rhamnoside, Methyl brevifolincarboxylate, Lupeol, các dẫn xuất triterpen và hợp chất diarylpropanoid mới Macrotricolorin A). Về sinh học phân tử, chương tổng quan phân tích ưu thế của chỉ thị gen lục lạp rbcL (chiều dài ~1400 bp, vùng khuếch đại phân tích rbcLa ~600 bp) có tính bảo thủ cao, dễ phục hồi trình tự và có mặt phổ biến trong ngân hàng gen quốc tế, đóng vai trò mã vạch cốt lõi để nhận diện loài.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục 7 mẫu thực địa được thu thập tại Hưng Yên và Hà Nội cùng hệ thống trang thiết bị, hóa chất, quy trình thực nghiệm chuẩn hóa. Bao gồm kỹ thuật xử lý tiêu bản thực vật, phương pháp cắt nhuộm kép vi phẫu dược liệu bằng xanh methylene kết hợp đỏ carmin, kỹ thuật chế tạo tiêu bản bột dược liệu, quy trình chiết tách DNA bằng dung dịch đệm CTAB và thiết lập thông số chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân bản đoạn gen rbcL.

Kết quả và bàn luận

Chương kết quả tập trung vào 4 nhóm nội dung trọng tâm:

1. Xác định tên khoa học và mô tả hình thái: Kết hợp khóa định loại thực vật và tiêu bản chuẩn Kew K000844671 xác định chính xác mẫu nghiên cứu là Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser. Mô tả hình thái chi tiết: Cây bụi gỗ sống bán ký sinh, vỏ xám nứt dọc. Lá mọc đối, dày, dai, phiến lá hình trứng ngược hoặc trứng thuôn, kích thước 2,8–7,5 × 0,5–3,6 cm, mép nguyên, đỉnh tù, gân lông chim. Cụm hoa mọc ở sát nách lá, mỗi cụm gồm 2 hoa; hoa lưỡng tính mẫu 6, dài 1,2–2,2 cm; tràng hợp dạng ống xẻ 6 thùy ở đỉnh (gốc màu đỏ, giữa màu xanh lục, đỉnh màu xanh vàng chuyển dần sang đỏ tím khi hoa nở rộ); 6 nhị màu vàng, chỉ nhị dài 1,5 cm; chỉ nhụy hình trụ dài 1,7 cm, đầu nhụy tròn màu đỏ; 2 lá bắc mọc đối diện nhau ở gốc bầu; quả mọng hình tròn đường kính 7 mm, nhẵn, khi chín màu đỏ đậm mang vòng đài tồn tại ở đỉnh, chứa hạt màu xanh thuôn nhọn một đầu. Tác giả lập bảng so sánh hình thái đối chiếu với loài Scurrula parasitica L. nhằm phục vụ phân biệt thực tế.

2. Đặc điểm vi phẫu giải phẫu:

   • Vi phẫu thân: Thiết diện tròn. Từ ngoài vào trong gồm lớp bần bắt màu xanh (nhiều hàng tế bào xếp thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm, ngoài phủ lớp cutin); mô mềm vỏ gồm tế bào hình trứng/đa giác thành mỏng bắt màu hồng, chứa nhiều tinh thể canxi oxalat hình đa giác; các đám mô cứng nằm rải rác; bó sợi xếp thành cung tròn bao ngoài libe; phần libe bắt màu hồng bao quanh phần gỗ; phần gỗ rất phát triển xếp thành dải tỏa tròn; trong cùng là mô mềm ruột.
   • Vi phẫu lá: Lát cắt ngang qua gân chính cho thấy mặt trên hơi lồi, mặt dưới lồi nhiều. Gồm biểu bì trên và dưới là 1 hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ xếp đều đặn, bắt màu xanh, ngoài phủ cutin; mô mềm chứa rải rác mô cứng màu xanh và tinh thể canxi oxalat hình khối; bó sợi bao bọc mặt trên và mặt dưới của bó libe-gỗ; có 1–5 bó dẫn libe-gỗ với cung libe bao quanh bó mạch gỗ xếp thẳng hàng phía dưới.

3. Đặc điểm vi học bột dược liệu:

   • Bột thân: Bột màu nâu, không mùi; soi kính hiển vi thấy các mảnh bần màu nâu cam, tế bào mô cứng thành dày, mô mềm chứa tinh thể canxi oxalat, bó sợi, mảnh mạch vòng và hạt tinh bột.
   • Bột lá: Bột màu vàng, mùi thơm nhẹ; soi kính hiển vi phát hiện mảnh biểu bì mang lỗ khí khổng, mô mềm, tế bào mô cứng, mảnh mạch vòng, tế bào sợi, mảnh mô mềm mang sắc tố, tinh thể canxi oxalat và hạt tinh bột.

4. Xác định loài bằng DNA barcode (gen rbcL): Thực hiện trên 4 mẫu đại diện (QN04, QN05, QN30, QN42). Kết quả điện di DNA tổng số cho thấy nồng độ DNA thu được dưới 10 ng do lớp cutin dày của lá cản trở quá trình phá vỡ tế bào. Phản ứng PCR khuếch đại thành công đoạn gen rbcL kích thước ~600 bp rõ nét, không có băng phụ. Kết quả giải trình tự Sanger và đối chiếu BLAST trên GenBank khẳng định độ tương đồng 100% với các trình tự chuẩn của loài Macrosolen tricolor (mã số truy cập: ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771). Trong top 100 kết quả tương đồng nhất không xuất hiện Scurrula parasitica, khẳng định chỉ thị rbcL có tính đặc hiệu phân biệt tuyệt đối giữa hai loài.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm gốc và thiết lập các tiêu chuẩn nhận diện loài rõ ràng:

Bảng so sánh hình thái giữa Macrosolen tricolor và Scurrula parasitica

Đặc điểm hình thái	Macrosolen tricolor (Đại cán ba màu)	Scurrula parasitica L. (Tang ký sinh)
Lông bảo vệ	Toàn cây nhẵn nhụi, hoàn toàn không có lông	Toàn thân và cụm hoa có lông hình sao phủ dày
Đặc điểm lá	Lá hình trứng ngược/trứng thuôn, phiến dày dai, dài 2,8–7,5 cm, rộng 0,5–3,6 cm	Lá hình bầu dục, phiến mỏng, dài 3,5–9,5 cm, rộng 1,0–6,0 cm
Lá bắc	2 lá bắc đính đối diện nhau ở gốc bầu, đỉnh tròn	1 lá bắc hình tam giác, có lông ở mép lá
Cấu trúc cụm hoa	Cụm hoa mọc ở nách lá gồm 2 hoa; hoa lưỡng tính mẫu 6; tràng hoa 3 màu: gốc đỏ – giữa xanh – đỉnh xanh vàng/đỏ tím	Cụm hoa mọc ở nách lá gồm 4–5 hoa; hoa mẫu 4–5, có phủ lông; tràng hoa 2 màu (đỏ – xanh)
Hình thái quả	Quả mọng hình tròn, nhẵn bóng, khi chín có màu đỏ sậm	Quả hình trái lê, gốc quả thót lại, có lông bảo vệ, khi chín màu hồng

Bảng kết quả định danh loài dựa trên chỉ thị gen rbcL

Ký hiệu mẫu	Loài đối chiếu tương đồng cao nhất trên GenBank	Mã truy cập GenBank	Độ tương đồng (%)	Chiều dài đoạn giải trình tự
QN04	Macrosolen tricolor	ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771	100%	~600 bp
QN05	Macrosolen tricolor	ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771	100%	~600 bp
QN30	Macrosolen tricolor	ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771	100%	~600 bp
QN42	Macrosolen tricolor	ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771	100%	~600 bp

Đóng góp học thuật và thực tiễn

• Bổ sung dữ liệu giải phẫu hiển vi đầu tiên: Xây dựng bộ ảnh vi phẫu cấu tạo thân, lá và tiêu bản bột dược liệu chi tiết cho loài Macrosolen tricolor, cung cấp dữ liệu kiểm nghiệm hiển vi vốn chưa từng được ghi nhận trong các ấn bản Dược điển Việt Nam.
• Xác thực mã vạch sinh học phân tử: Chứng minh đoạn gen rbcL (~600 bp) có tính bảo thủ cao trong nội bộ loài và có khả năng phân biệt dứt khoát loài Đại cán ba màu với các loài khác trong họ Loranthaceae, đặc biệt là loài Tang ký sinh chính thức Scurrula parasitica.
• Giá trị kiểm nghiệm dược liệu: Đưa ra giải pháp kết hợp đa phương pháp (hình thái cảm quan, giải phẫu hiển vi và DNA barcode) giúp các trung tâm kiểm nghiệm phát hiện triệt để tình trạng nhầm lẫn hoặc pha trộn dược liệu trên thị trường y học cổ truyền.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ trên các phân tích và đề xuất được nêu trong văn bản khóa luận:

• Hạn chế:
  • Hiệu suất tách chiết DNA: Hiệu suất thu hồi DNA tổng số từ mẫu lá khô bảo quản bằng silicagel còn thấp (dưới 10 ng) do lá có lớp cutin dày gây cản trở cơ học và hóa học trong quá trình phá màng tế bào.
  • Tín hiệu giải trình tự: Quá trình đọc trình tự Sanger một chiều xuất hiện một vị trí nucleotide bị nhiễu tín hiệu.
  • Phạm vi mẫu nghiên cứu: Địa bàn lấy mẫu mới chỉ tập trung tại 2 tỉnh/thành phố (Hưng Yên và Hà Nội) với số lượng 7 mẫu, chưa đại diện đầy đủ cho các vùng phân bố sinh thái khác nhau của loài tại Việt Nam.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Cần ưu tiên sử dụng mẫu mô lá tươi để tách chiết DNA trực tiếp nhằm tăng hiệu suất và độ tinh sạch của DNA tổng số.
  • Tiến hành giải trình tự Sanger theo cả hai chiều (forward và reverse) để làm rõ triệt để các vị trí nucleotide bị nhiễu hoặc sai sót kỹ thuật.
  • Mở rộng thu thập thêm các mẫu Macrosolen tricolor ở nhiều vùng địa lý và điều kiện sinh thái khác nhau trên toàn quốc nhằm đánh giá sâu hơn về tính đa dạng hình thái và biến dị di truyền.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị thực tiễn và học thuật cho các nhóm đối tượng:

• Sinh viên và học viên ngành Dược học, Thực vật học, Công nghệ Sinh học: Tham khảo cách tiếp cận nghiên cứu kết hợp giữa phương pháp thực vật truyền thống (vi phẫu, bột dược liệu) và công nghệ sinh học phân tử (tách chiết DNA, phản ứng PCR, giải trình tự, phân tích BLAST).
• Cán bộ kiểm nghiệm dược liệu và chuyên viên tiêu chuẩn hóa: Sử dụng bộ ảnh vi phẫu thân, lá, bột dược liệu và bảng so sánh hình thái để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, tiêu chuẩn chuyên luận Dược điển nhằm nhận dạng, phân biệt loài Macrosolen tricolor với vị thuốc Tang ký sinh (Scurrula parasitica).
• Nhà nghiên cứu Dược liệu và Hóa thực vật: Tham khảo dữ liệu nền tảng về định danh chuẩn loài phục vụ các nghiên cứu chiết xuất, phân lập hoạt chất có hoạt tính sinh học (như Macrotricolorin A) và thử nghiệm dược lý trên loài Đại cán ba màu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Dược điển Việt Nam V quy định dược liệu Tang ký sinh là loài nào và việc nhầm lẫn với Đại cán ba màu diễn ra như thế nào?
Theo Dược điển Việt Nam V (2017), dược liệu Tang ký sinh chuẩn được lấy từ loài Scurrula parasitica L. ký sinh trên cây Dâu tằm (Morus alba L.). Tuy nhiên, do loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor) cũng sống bán ký sinh trên cây Dâu tằm và mang hình thái tương tự, người dân đi hái thuốc thường thu hái cả hai loài mà không phân định rõ ràng.

2. Điểm khác biệt hình thái rõ rệt nhất giúp nhận dạng Macrosolen tricolor bằng mắt thường là gì?
Macrosolen tricolor hoàn toàn nhẵn bóng không có lông (trong khi Scurrula parasitica có lông hình sao); hoa mọc từng cụm 2 hoa ở nách lá, tràng hoa mẫu 6 có 3 dải màu rõ rệt (gốc đỏ, thân xanh lục, đỉnh xanh vàng hoặc đỏ tím khi nở); quả hình tròn màu đỏ đậm khi chín.

3. Vì sao nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Macrosolen tricolor trong nghiên cứu lại thấp (<10 ng)?
Do các mẫu lá dùng để tách chiết được làm khô và bảo quản trong silicagel, kết hợp với đặc tính sinh học của lá Macrosolen tricolor là có lớp biểu bì phủ cutin rất dày, gây cản trở quá trình phá vỡ vách tế bào để giải phóng DNA trong quá trình nghiền với đệm CTAB.

4. Vùng gen rbcL mang lại kết quả định danh phân tử như thế nào trong khóa luận?
Đoạn gen rbcL khuếch đại bằng cặp mồi rbcLaF/rbcLaR cho sản phẩm PCR kích thước ~600 bp rõ nét. Kết quả giải trình tự của 4 mẫu nghiên cứu (QN04, QN05, QN30, QN42) đạt độ tương đồng 100% với các mã trình tự Macrosolen tricolor trên GenBank (ON331649, MH161425, MG999440, HQ317771) và không bắt cặp với Scurrula parasitica trong top 100 kết quả BLAST.

5. Cấu trúc vi phẫu thân của loài Macrosolen tricolor có những đặc điểm giải phẫu nổi bật nào?
Vi phẫu thân có thiết diện tròn; ngoài cùng là lớp bần bắt màu xanh gồm nhiều hàng tế bào xếp đồng tâm và xuyên tâm; mô mềm vỏ chứa nhiều tinh thể canxi oxalat hình đa giác và đám mô cứng rải rác; bó sợi xếp thành cung tròn bao bọc libe; libe màu hồng bao ngoài phần gỗ rất phát triển xếp thành các dải tỏa tròn; trong cùng là mô mềm ruột.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Vũ Hồng Ngọc đã hoàn thành việc xây dựng bộ dữ liệu khoa học toàn diện về hình thái, vi phẫu giải phẫu và chỉ thị phân tử DNA barcode cho loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser) thu thập tại Hưng Yên và Hà Nội. Công trình đã làm rõ các sai khác hình thái vi học và giải phẫu hiển vi đặc trưng ở thân, lá và bột dược liệu, giúp phân biệt rõ ràng loài này với loài Tang ký sinh chuẩn (Scurrula parasitica L.). Kết quả giải trình tự vùng gen rbcL đạt độ tương đồng 100% trên GenBank, khẳng định đây là công cụ nhận diện phân tử tin cậy, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Với vị trí nằm ở đới khí hậu nhiệt đới gió mùa, hệ sinh thái phong phú, thiên nhiên Việt Nam sở hữu lượng tài nguyên động thực vật hết sức đồ sộ, bao gồm nhóm tài nguyên cây thuốc – một bộ phận quan trọng của hệ sinh thái và đóng góp lớn vào công cuộc bảo vệ sức khỏe con người. Gần 6000 loài thực vật đã được sử dụng làm thuốc dưới nhiều dạng như bài thuốc dân gian, thang thuốc y dược học cổ truyền, hay bào chế thành các sản phẩm hiện đại, nghiên cứu chiết xuất hoạt chất, … Nghiên cứu, phân tích về các loài đã được dùng trong dân gian hay những loài chưa được hiểu biết đầy đủ có thể là phương thuốc mới để chữa bệnh, phòng chống bệnh. Họ Tầm gửi (Loranthaceae) bao gồm phần lớn các cây chủ yếu sống ký sinh, dân gian cũng hay gọi chung các giống ký sinh trên cây khác là cây Tầm gửi mà hiếm khi phân định loài. Tuy vậy, các loài Tầm gửi khác nhau với những đặc điểm khác nhau từ hình thái cho đến hoạt chất chứa bên trong chúng, và điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng đóng góp của chúng trên phương diện y dược học.

Cùng một loài Tầm gửi nhưng ký sinh trên các loài khác nhau cũng có thể tạo nên sự khác biệt về hoạt chất trong cây. Trong số các loại Tầm gửi, Tang ký sinh là vị thuốc được sử dụng phổ biến nhất trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh cơ xương khớp. Dược điển Việt Nam V (2017) quy định dược liệu Tang ký sinh được lấy từ loài Scurrula parasitica L. ký sinh trên cây Dâu (Morus alba L.

Tuy nhiên thực tế người dân vẫn thu hái lẫn một số loài Tầm gửi khác trên cây Dâu làm dược liệu Tang ký sinh trong đó có loài Đại cán ba màu - Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans. Loài Đại cán ba màu cũng được ghi chép trong y học dân gian với tác dụng bó vùng gãy xương, trị một số bệnh tiêu hóa. Các nghiên cứu thêm về loài này nhận thấy tác dụng chống viêm, bảo vệ gan, hay phát hiện hợp chất mới cho thấy tiềm năng của Đại cán ba màu để phát triển làm thuốc. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu và DNA barcode của loài Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans.

thu thập tại Hưng Yên và Hà Nội nhằm xây dựng bộ dữ liệu về đặc điểm hình thái, vi phẫu và DNA barcode giúp nhận dạng và phân biệt loài. Góp phần xác 1 định tính đúng của dược liệu làm thuốc phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu. loài đóng góp thêm vào dữ liệu là vô cùng quan trọng cho những hoạt động nghiên cứu kế tiếp tiến hành trên loài này. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Nghiên cứu và xác định được đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu của loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans.

- Xác định được DNA barcode của loài Đại cán ba màu (Macrosolen tricolor (Lecomte) Dans.) được thu thập ở 2 địa điểm là Hưng Yên và Hà Nội và so sánh với trình tự đã công bố trên Genbank. Tổng quan về họ Loranthaceae Họ Tầm gửi (Loranthaceae) gồm khoảng hơn 70 chi, gần 1000 loài phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các loài trong họ chủ yếu là bán ký sinh trên các cây thân gỗ [1]. Jussier [2] là người đầu tiên mô tả và đặt tên cho họ Tầm gửi lấy từ tên chi Loranthus – là một trong hai chi (Loranthus và Scurrula) được nhà thực vật học nổi tiếng người Thụy Điển C.

Linnaeus mô tả trong công trình nghiên cứu “Species Plantarum”[3]. Mặc dù theo phân loại học trước đây đã từng coi Viscaceae (họ Ghi) như là một phân họ của Loranthaceae (họ Tầm gửi), nhưng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì các bằng chứng cho thấy hai họ này là khác biệt có về đặc điểm phôi học [4], tế bào học [5] và địa sinh học [6]. Rất nhiều các công trình nghiên cứu đã phân tích phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu về sinh học phân tử đã tiến hành cho tới nay đều đồng ý với quan điểm tách Loranthaceae thành một họ thực vật độc lập. Từ hệ thống Angiosperm Phylogeny Group I trở đi [7-10] đều chỉ ra rằng họ Loranthaceae có vị trí độc lập với Viscaceae.

Đến năm 2004, Qiu Huaxing và Michael G. Gilbert nằm trong “Flora of China” đã ghi nhận họ Tầm gửi với 8 chi và 48 loài [11]. Nickrent kế thừa hệ thống của Engler và hoàn thiện cây phát sinh chủng loài khi nghiên cứu trên nhiều gen (rbcL, matK, trnL-F), nhóm tác giả cũng sử dụng thuật toán Bayes với phương pháp parsimony có độ tin cậy cao. Trong công trình nghiên cứu, 69 chi trên tổng số 73 chi thuộc họ Tầm gửi được phân tích trên 3 loại gen, kết quả cho thấy: chi Scurrula có mối quan hệ rất gần với Taxillus và chi Macrosolen có mối quan hệ gần gũi với chi Elytranthe.

Ngoài ra, các tác giả đã chỉ ra các nhóm có số lượng nhiễm sắc thể n = 12 gồm các chi thuộc tông Elytrantheae (trong đó có 2 chi gặp ở Việt Nam: Elytranthe và Macrosolen), số lượng nhiễm sắc thể n = 9 gồm các chi thuộc tông Lorantheae (ở Việt Nam có 4 chi: Dendrophthoe, Helixanthera, Scurrula và Taxillus). Như vậy, công trình phân loại các taxon trong họ Tầm gửi (Loranthaceae) của R. Nickrent (2008) là một công trình đồ sộ, tập hợp nhiều phương pháp và bao quát các chi trên toàn thế giới, trong đó có kết hợp các đặc điểm hình thái và dẫn liệu sinh học phân tử để xây dựng 3 cây phát sinh chủng loại mang tính tin cậy cao. Tuy còn một số điểm mới chưa hoàn thiện về vị trí của một số chi nhưng đây là công trình hoàn thiện nhất và mới nhất từ trước đến nay về họ Tầm gửi.

Ở Việt Nam cho đến nay đã ghi nhận họ này có 6 chi: Dendrophthoe, Elytranthe, Helixanthera, Macrosolen, Scurrula, Taxillus với hơn 30 loài, nhiều loài sử dụng làm thuốc. Nguyễn Tiến Bân (1994) [12] trong Tạp chí Sinh học số 16 đã đưa ra danh sách họ Tầm gửi gồm 2 phân họ Loranthoideae và Viscoideae với 8 chi và 43 loài, 1 thứ. Năm 2003, tác giả đã coi Loranthoideae và Viscoideae là 2 họ độc lập [13] với tên là Loranthaceae và Viscaceae; khi đó họ Tầm gửi còn 5 chi, 33 loài và 1 thứ. Tuy nhiên trong 2 công trình trên, tác giả chỉ đề cập đến tên synonym, sinh học – sinh thái, phân bố, giá trị sử dụng nếu có.

Theo Nguyễn Tiến Bân, Scurrula là synonym của Taxillus dựa vào các đặc điểm hình thái chung như: hoa mẫu 4, đối xứng hai bên, cánh hoa dính phần lớn tạo thành ống hoa, phần lớn chiều dài của nhị đính vào bao hoa, số lượng hoa trong cụm hoa ít, cuống chung của cụm hoa ít phát triển. Năm 2014, Lê Ngọc Hân [14] đã xác nhận rằng họ Loranthaceae ở Việt Nam được xác định có 29 loài và 1 thứ xếp trong 1 phân họ 2 tông, 2 phân tông, 6 chi. Tổng quan về chi Macrosolen 1. Vị trí phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại mới nhất APG IV (Angiosperm Phylogeny Group) [8] dựa trên các dẫn liệu về hình thái và sinh học phân tử, chi Macrosolen có vị trí phân loại như sau: Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Angiosperms (Thực vật hạt kín) Bộ: Santalales (Đàn hương)    Họ: Loranthaceae (Tầm gửi)     Chi: Macrosolen (Đại cán) 4 1.

Nghiên cứu về chi Macrosolen trên thế giới Lần đầu tiên vào năm 1830, Blume đề cập đến Macrosolen trong cuốn “Flora Javae nec non insularum adjacentium” [15] như là 1 nhánh của chi Loranthus (họ Loranthaceae) gồm 13 loài được lấy tên lần lượt là: L. clavatus với đặc điểm chung trên cơ quan sinh sản: hoa lưỡng tính, lá bắc 3 rời rạc hoặc liền nhau, cánh hoa hợp thành ống, hoa mọc thành chùm hoặc xim, hiếm khi đơn lẻ, có nhiều sắc màu … Năm 1841, Reichenbach đã tách Macrosolen thành một chi riêng biệt, ghi chép đặc điểm, minh họa chi tiết các loài thuộc chi một cách hệ thống trong tài liệu “Deut. Tên hữu hiệu của chi được chính thức ghi nhận là Macrosolen (Blume) Rchb. và sử dụng đến ngày nay.

Các mô tả về chi không có thay đổi so với nhận định trước đó của Blume. Miquel [17] cũng đồng quan điểm cho rằng Macrosolen là một chi thuộc họ Loranthaceae và gọi tên, miêu tả chi tiết 14 loài thuộc chi này. Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu khác như Betham, Hooker [18,19] vẫn có cùng quan điểm với nhận định đầu tiên của Blume coi Macrosolen là 1 bộ phận của chi Loranthus, hay Engler cho rằng nó là nó là nhánh của chi Elytranthe [20]. Năm 1894, Van Tieghem đưa ra hệ thống phân loại thực vật dựa trên đặc điểm hình thái trong Sur La Classification Des Loranthacées [21].

Trong hệ thống này, Macrosolen là một trong ba chi thuộc tông Elytranthe. Tuy nhiên, hệ thống của Van Tieghem sớm thay đổi sau một năm [22] và chia nhỏ tông Elytranthe bao gồm 18 chi thay vì 3 chi như ban đầu. Các loài vốn thuộc chi Macrosolen trước đó chia vào hai chi theo hệ thống mới là Macrosolen và Miquelina. Năm 1900, Engler nhận thấy sự khác biệt rõ ràng về hình thái ở đài hoa, lá bắc nên quyết định khôi phục lại chi Macrosolen và Enelytranthe [23].

Các tài liệu sau năm 1900 như Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg [24], , The Gardens’ bulletin Singapore [25], Vân Nam thực vật chí [26]… đều công nhận chi Macrosolen nằm trong họ Loranthaceae. Hệ thống phân loại APG IV (2016) [8] đã xếp Macrosolen là một chi thuộc họ Loranthaceae. Hiện nay, chính thức ghi nhận 42 loài thuộc chi Macrosolen theo Plant of the World 5 Online [27]. Các mẫu vật của các loài thuộc chi đã thu thập hiện tại tập trung ở Trung Quốc, khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ.

Nghiên cứu về chi Macrosolen tại Việt Nam Tài liệu Cây cỏ Việt Nam vào năm 2000 [28] đã liệt kê 8 loài thuộc chi Macrosolen bao gồm Macrosolen annamicus, Macrosolen adpressus, Macrosolen avenis, Macrosolen bibracteolatus, Macrosolen cochinchinensis, Macrosolen dianthus, Macrosolen robinsonii, Macrosolen tricolor. Tác giả Phạm Hoàng Hộ dựa trên những đặc điểm hình thái: cây có lá, hoa lưỡng tính, cánh hoa dính liền thành ống, hoa 6 phần, lá bắc nhỏ không bao lấy đài để phân biệt nhận dạng các loài thuộc chi này. Tuy nhiên, loài Macrosolen adpressus trong tài liệu này không có tranh minh họa hay mô tả nào, các tài liệu nghiên cứu về sau cũng không đề cập đến.