Xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm thượng hoàng Phellinus linteus

Nấm Phellinus linteus, một loại nấm dược liệu quý, đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhờ vào hàm lượng… 82 trang · Đại học An Giang · 2022.

• Tác giả: Lư Thanh Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Thị Thu Ba
• Trường học: Đại học An Giang
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: An Giang

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM TẠ
• LỜI CAM KẾT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 2.1. SƠ LƯỢC NẤM THƯỢNG HOÀNG
• 2.1.1. Phân loại
• 2.1.2. Phân bố
• 2.1.3. Đặc điểm hình thái
• 2.2. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ DƯỢC CHẤT NẤM THƯỢNG HOÀNG (Plellinus linteus)
• 2.2.1. Thành phần dinh dưỡng của nấm thượng hoàng
• 2.2.2. Dược chất trong nấm
• 2.3. HOẠT ĐỘNG SINH HỌC
• 2.3.1. Hoạt động chống viêm
• 2.3.2. Hoạt động kháng vi khuẩn và chống virus
• 2.4. ỨNG DỤNG DƯỢC LÝ
• 2.4.1. Chống ung thư
• 2.4.2. Tác dụng chống ung thư
• 2.4.3. Hạ đường huyết
• 2.4.4. Bảo vệ thần kinh
• 2.4.5. Bảo vệ gan
• 2.5. MỘT SỐ THÀNH PHẦN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI TRỒNG NẤM
• 2.6. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
• 2.6.1. Nghiên cứu trong nước
• 2.6.2. Nghiên cứu ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Thời gian thực hiện
• 3.1.2. Địa điểm thực hiện
• 3.1.3. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
• 3.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen và ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân giống cấp 1 của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus)
• 3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen và ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân giống cấp 2 của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus)
• 3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen và ảnh hưởng của môi trường trồng nấm thượng hoàng (Phellinus linteus)
• 3.3. PHÂN TÍCH DỮ LIỆU
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CẤP 1 ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN TƠ NẤM THƯỢNG HOÀNG
• 4.2. PHÂN TÍCH TRITERPEN TRONG TƠ NẤM NHÂN GIỐNG CẤP I
• 4.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG TRÊN MÔI TRƯỜNG CẤP I
• 4.4. PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG CẤP II ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN TƠ NẤM THƯỢNG HOÀNG
• 4.5. PHÂN TÍCH TRITERPEN TRONG TƠ NẤM NHÂN GIỐNG CẤP II
• 4.6. ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG TRÊN MÔI TRƯỜNG CẤP II
• 4.7. PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI TRỒNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN TƠ NẤM THƯỢNG HOÀNG
• 4.8. PHÂN TÍCH TRITERPEN TRONG TƠ NẤM TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI TRỒNG
• 4.9. ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG TRÊN MÔI TRƯỜNG NUÔI TRỒNG
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ CHƯƠNG

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus

Nấm Phellinus linteus, một loại nấm dược liệu quý, đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhờ vào hàm lượng polysaccharides và triterpen cao. Nghiên cứu này nhằm xác định các thành phần này trong quá trình nhân sinh khối nấm, từ đó mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng trong y học và thực phẩm chức năng. Việc tìm hiểu về nấm thượng hoàng không chỉ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

1.1. Đặc điểm sinh học và giá trị dinh dưỡng của nấm Phellinus linteus

Nấm Phellinus linteus có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như protein, vitamin và khoáng chất. Đặc biệt, polysaccharides và triterpen trong nấm này được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch.

1.2. Tính cấp thiết của nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen

Nhu cầu sử dụng nấm dược liệu ngày càng tăng cao trong cộng đồng. Việc nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus sẽ giúp phát triển các sản phẩm chức năng, đáp ứng nhu cầu sức khỏe của người tiêu dùng.

II. Thách thức trong việc xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm

Việc xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như môi trường nuôi trồng, phương pháp chiết xuất và thời gian thu hoạch đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Do đó, cần có các phương pháp chính xác và hiệu quả để đảm bảo độ tin cậy của dữ liệu.

2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trồng đến hàm lượng hoạt chất

Môi trường nuôi trồng có thể tác động lớn đến sự phát triển và hàm lượng polysaccharides, triterpen trong nấm. Các nghiên cứu cho thấy, nấm được nuôi trong điều kiện tối ưu sẽ cho ra sản phẩm với hàm lượng hoạt chất cao hơn.

2.2. Phương pháp chiết xuất và phân tích hàm lượng

Các phương pháp chiết xuất khác nhau như chiết xuất bằng nước, ethanol hay các dung môi hữu cơ có thể dẫn đến sự khác biệt trong hàm lượng polysaccharides và triterpen. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

III. Phương pháp nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp hiện đại để xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus. Các bước thực hiện bao gồm thu thập mẫu, chiết xuất và phân tích bằng các kỹ thuật như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

3.1. Quy trình thu thập và chuẩn bị mẫu nấm

Mẫu nấm Phellinus linteus được thu thập từ các vùng rừng nguyên sinh, sau đó được xử lý và chuẩn bị theo quy trình nghiêm ngặt để đảm bảo chất lượng mẫu trước khi tiến hành phân tích.

3.2. Kỹ thuật chiết xuất và phân tích hàm lượng

Sử dụng các phương pháp chiết xuất như chiết xuất nước và ethanol, kết hợp với kỹ thuật HPLC để xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen. Kết quả sẽ được so sánh với các tiêu chuẩn đã biết để đánh giá độ chính xác.

IV. Kết quả nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus có sự biến đổi đáng kể tùy thuộc vào môi trường nuôi trồng và phương pháp chiết xuất. Các mẫu nấm được nuôi trong môi trường tối ưu cho thấy hàm lượng hoạt chất cao nhất, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển sản phẩm từ nấm.

4.1. Hàm lượng polysaccharides trong các mẫu nấm

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng polysaccharides đạt tối đa 0,84% trong môi trường nuôi trồng mạt cưa cao su. Điều này chứng tỏ rằng môi trường nuôi trồng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm.

4.2. Hàm lượng triterpen và ứng dụng thực tiễn

Hàm lượng triterpen trong nấm Phellinus linteus cũng được xác định và cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học. Các hợp chất này có khả năng chống viêm và kháng khuẩn, mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về nấm Phellinus linteus

Nghiên cứu hàm lượng polysaccharides và triterpen trong nấm Phellinus linteus đã chỉ ra rằng nấm này có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Việc phát triển quy trình nuôi trồng và chiết xuất hiệu quả sẽ giúp tối ưu hóa hàm lượng hoạt chất, từ đó nâng cao giá trị sản phẩm. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để khám phá thêm nhiều ứng dụng mới từ nấm này.

5.1. Triển vọng phát triển sản phẩm từ nấm Phellinus linteus

Với hàm lượng polysaccharides và triterpen cao, nấm Phellinus linteus có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chức năng và dược phẩm. Cần có thêm các nghiên cứu để khai thác tối đa giá trị của nấm này.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực nấm dược liệu

Nghiên cứu về nấm dược liệu cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều loài nấm khác có giá trị tương tự. Việc bảo tồn và phát triển nguồn gen nấm quý hiếm cũng là một nhiệm vụ quan trọng trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm dược liệu ngày càng khẳng định vị trí quan trọng trong đời sống kinh tế và chăm sóc sức khỏe cộng đồng nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng. Trong số các loài nấm quý, nấm thượng hoàng (Phellinus linteus), thuộc họ Hymenochaetaceae, là một loại nấm gỗ đa niên phân bố chủ yếu tại các vùng rừng nguyên sinh núi cao hiểm trở ở các quốc gia Đông Á và Đông Nam Á. Quả thể nấm thượng hoàng chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính trị liệu giá trị cao như các phức hợp polysaccharides, triterpenoid, polyphenol, furans và styrylpyrones, có khả năng điều hòa miễn dịch, ức chế tế bào khối u, chống viêm, kháng oxy hóa, hỗ trợ bảo vệ gan và hạ đường huyết.

Tuy nhiên, trong tự nhiên, Phellinus linteus sinh trưởng chậm, đòi hỏi thời gian từ nhiều năm đến hàng thập kỷ để hình thành quả thể hoàn chỉnh. Tại Việt Nam, tình trạng khai thác quá mức nguồn "Cổ linh chi" tự nhiên đã khiến nguồn tài nguyên nấm thượng hoàng bản địa cạn kiệt nghiêm trọng. Mặt khác, việc sản xuất quy mô công nghiệp từ thể quả nấm gặp khó khăn lớn về nguồn giống, thời gian sinh trưởng kéo dài và năng suất hoạt chất không ổn định. Việc nghiên cứu nhân sinh khối hệ sợi (tơ nấm) trong điều kiện nhân tạo được xem là hướng tiếp cận hiệu quả nhằm chủ động kiểm soát quy trình, rút ngắn chu kỳ thu hoạch và thu hồi hàm lượng hoạt chất sinh học ổn định. Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Lư Thanh Hiền đã thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp: "Xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong các tiến trình nhân sinh khối nấm thượng hoàng Phellinus linteus".

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

• Xác định hàm lượng polysaccharides và triterpen trong các tiến trình nhân sinh khối nấm thượng hoàng (Phellinus linteus).

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được tác giả phân định thành 3 nội dung:

1. Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân giống cấp 1 của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus).
2. Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của môi trường đến sự nhân giống cấp 2 của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus).
3. Nghiên cứu xác định hàm lượng polysaccharide và triterpen, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của môi trường cơ chất nuôi trồng đến sự phát triển tơ nấm thượng hoàng (Phellinus linteus).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hệ sợi tơ nấm thượng hoàng (Phellinus linteus).
• Không gian nghiên cứu: Khu thí nghiệm thuộc Trường Đại học An Giang - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 02 năm 2022 đến tháng 05 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học ứng dụng trong nông nghiệp và dược liệu, sử dụng mô hình nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm (in vitro).

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các công trình phân loại học của Trịnh Tam Kiệt (2011), xác định Phellinus linteus thuộc ngành Basidiomycota, lớp Basidiomycetes, bộ Hymenochaetales, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus. Các tổng quan hóa thực vật và dược lý học từ các công trình quốc tế (Chen và cs., 2019; Kim và cs., 2003, 2006; Song và cs., 2004; Lee và cs., 1995, 1996) chỉ ra rằng hợp chất polysaccharide hòa tan trong nước (đặc biệt là khung liên kết (1→3)-$\beta$-D-glucan và phức hợp polysaccharide-protein PPC) cùng các dẫn xuất triterpenoid khung lanostane là hai nhóm hoạt chất đại diện cho các tính chất sinh học chống u và chống oxy hóa của loài nấm này.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Thiết kế thí nghiệm: Bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design - CRD).
  • Thí nghiệm cấp 1 (môi trường thạch, đĩa petri): 4 nghiệm thức, 10 lần lặp lại cho theo dõi sinh trưởng và 5 lần lặp lại cho phân tích hóa học.
  • Thí nghiệm cấp 2 (môi trường hạt, bình nước biển): 3 nghiệm thức, 10 lần lặp lại cho theo dõi sinh trưởng và 5 lần lặp lại cho phân tích hóa học.
  • Thí nghiệm nuôi trồng cơ chất (bịch phôi mùn cưa): 4 nghiệm thức, 10 lần lặp lại cho theo dõi sinh trưởng và 5 lần lặp lại cho phân tích hóa học.
• Phương pháp phân tích hóa học:
  • Chiết xuất và định tính triterpen: Chiết mẫu tơ nấm khô bằng ethanol 95% (lắc 24 giờ, lặp lại 5 lần ở nhiệt độ phòng), cô thu hồi dung môi ở 45 °C tạo cao chiết. Định tính bằng phản ứng Liebermann – Burchard (cho tác dụng với acetic anhydride, đun nóng, làm lạnh và bổ sung $H_2SO_4$ đậm đặc quan sát biến đổi màu).
  • Chiết xuất và định lượng polysaccharide toàn phần: Mẫu tơ nấm được tiền xử lý bằng ethanol 96% ở 70 °C trong 60 phút để loại bỏ enzyme, hợp chất phân tử nhỏ và tạp chất tan. Chiết kiềm bằng dung dịch $NaOH$ 5,1% ở 60,1 °C trong 77 phút; trung hòa bằng $HCl$ 5,1%; cô đặc dịch lọc ở 45 °C; thẩm tích bằng màng thẩm tích với nước khử ion ở 10 °C trong 3 ngày; kết tủa polysaccharide bằng ethanol 96% (tỷ lệ 1:4 v/v) ở 4 °C; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu polysaccharide thô (Crude Polysaccharides - CP). Định lượng polysaccharide bằng phương pháp so màu Phenol - Sulfuric Acid (PSA) tại bước sóng cực đại $\lambda = 488$ nm dựa trên đường chuẩn D-glucose dãy nồng độ 0 – 100 $\mu$g/mL.
• Phương pháp xử lý dữ liệu: Dữ liệu thô được ghi nhận bằng Microsoft Excel 2010. Phân tích phương sai một chiều (One-way ANOVA) và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình bằng phép thử DUNCAN ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ bằng phần mềm SAS 9.3 và SPSS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của việc bảo tồn nguồn gen nấm thượng hoàng trước nguy cơ bị cạn kiệt trong tự nhiên và sự cần thiết của giải pháp nhân sinh khối tơ nấm nhân tạo nhằm phục vụ ngành dược liệu. Tác giả xác lập rõ ràng mục tiêu tổng quát, 3 nội dung nghiên cứu gắn liền với 3 giai đoạn nhân giống (cấp 1, cấp 2 và nuôi trồng cơ chất), đồng thời nêu bật ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình trong việc hoàn thiện công thức môi trường để tối ưu hóa đồng thời tốc độ lan tơ và hàm lượng hai nhóm hoạt chất chính là polysaccharide và triterpen.

Chương 2: Tổng quan về vấn đề nghiên cứu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết toàn diện bao gồm:

• Đặc điểm sinh học, phân loại học và hình thái học của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus); phân bố địa lý của chi Phellinus tại Việt Nam và trên thế giới.
• Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất (dẫn chứng số liệu hàm lượng khoáng Na, K, Ca, Mg, protein thô và 17 loại acid amin tự do trong nấm theo tài liệu của Lee và cs., 2010).
• Các hợp chất có hoạt tính sinh học chính: Polysaccharides (cấu trúc phức hợp polysaccharide-protein PPC 73 kDa chứa 61,9% glucose và 19,5% mannose; $\beta$-D-glucan), triterpenoids (dẫn xuất lanostane, axit oleanolic, axit ursolic), terpenoids (phellilane L, atractylenolide I), furans và các dẫn xuất khác (hispolon, phellinuslins A–C).
• Tổng quan hoạt tính dược lý: Kháng viêm (ức chế biểu hiện NF-$\kappa$B, COX-2, giảm TNF-$\alpha$), chống oxy hóa, kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus (MRSA), cơ chế kháng u gián tiếp và trực tiếp (ức chế tế bào HepG2, sarcoma 180), tác dụng hạ đường huyết và bảo vệ tế bào gan trước độc chất dimethylnitrosamine (DMN).
• Thành phần các môi trường phân lập và cơ chất nuôi trồng truyền thống (khoai tây, cao nấm men, pepton, nước dừa, hạt ngũ cốc, mùn cưa).
• Tổng hợp các công trình nghiên cứu tiền bối trong nước (Nguyễn Văn Giang và cs., 2021; Nguyễn Văn Bình và cs., 2018) và ngoài nước (Lee và cs., 1995, 1996; Kim và cs., 2003, 2006).

Chương 3: Vật liệu nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết danh mục vật liệu, trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực hiện cụ thể 9 thí nghiệm độc lập:

• Nội dung 1 (Giống cấp 1): Thí nghiệm 1 khảo sát tốc độ phát triển tơ nấm trên 4 môi trường thạch: Raper (RP), PDA (PA), PDA bổ sung muối khoáng (PM: bổ sung $KH_2PO_4$, $MgSO_4\cdot 7H_2O$, Vitamin B1) và PDA bổ sung nước dừa (PD). Thí nghiệm 2 định tính triterpen trong tơ nấm cấp 1. Thí nghiệm 3 chiết xuất và định lượng polysaccharide trong tơ nấm cấp 1.
• Nội dung 2 (Giống cấp 2): Thí nghiệm 4 khảo sát sự lan tơ trên 3 loại cơ chất hạt: Hạt lúa (HL), Gạo lứt (HG) và Hạt bắp vàng (HB). Thí nghiệm 5 định tính triterpen tơ nấm cấp 2. Thí nghiệm 6 định lượng polysaccharide tơ nấm cấp 2.
• Nội dung 3 (Môi trường nuôi trồng): Thí nghiệm 7 khảo sát sinh trưởng tơ trên 4 công thức cơ chất mùn cưa cao su: MC (100% mạt cưa), MG (95% mạt cưa + 5% cám gạo), MB (95% mạt cưa + 5% bắp xay) và BC (90% mạt cưa + 5% cám gạo + 5% bắp xay). Thí nghiệm 8 định tính triterpen tơ nấm môi trường nuôi trồng. Thí nghiệm 9 định lượng polysaccharide tơ nấm môi trường nuôi trồng.
• Mô tả chi tiết các bước khử trùng, kỹ thuật thao tác vi sinh vô trùng và phương pháp phân tích thống kê.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 phân tích sâu các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Nhân giống cấp 1: Bán kính lan tơ sau 7 ngày đạt cao nhất trên môi trường Raper (4,15 cm), tiếp đến là PDA bổ sung khoáng (3,99 cm) và PDA (3,93 cm); ba nghiệm thức này cùng nhóm phân loại A (không có sự khác biệt thống kê ở mức $p < 0,05$). Môi trường PDA bổ sung nước dừa cho tốc độ lan tơ kém nhất (3,50 cm, thuộc nhóm B, khác biệt có ý nghĩa thống kê). Tác giả lý giải sự ức chế này là do đặc thù sinh lý dinh dưỡng của P. linteus không tương thích với tỷ lệ dưỡng chất của nước dừa dù môi trường này giàu dinh dưỡng.
• Phân tích triterpen: Phản ứng Liebermann – Burchard trên dịch chiết tơ nấm ở cả 3 giai đoạn (cấp 1, cấp 2 và nuôi trồng) đều cho phản ứng chuyển màu từ vàng sang vàng cam, xác nhận sự hiện diện ổn định của nhóm hợp chất triterpen trong sinh khối hệ sợi.
• Định lượng polysaccharide: Xây dựng phương pháp đo quang với đường chuẩn D-glucose đạt độ tuyến tính cao ($R^2$ tương quan tốt). Hàm lượng polysaccharide tích lũy trong tơ nấm thể hiện sự biến động rõ rệt theo thành phần dinh dưỡng của môi trường qua từng giai đoạn nuôi cấy.
• Nhân giống cấp 2: Hệ sợi lan nhanh nhất trên cơ chất hạt lúa (HL) đạt 6,01 cm sau 7 ngày cấy; tuy nhiên hàm lượng polysaccharide lại tích lũy cao nhất trên cơ chất hạt gạo lứt (HG) đạt 0,74%.
• Nuôi trồng cơ chất: Công thức phối trộn BC (90% mạt cưa cao su + 5% cám gạo + 5% bắp xay) cho thời gian lan tơ hoàn toàn 100% bịch phôi ngắn nhất (33 ngày) và mang lại hàm lượng polysaccharide cao nhất (0,84%).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu qua 3 cấp nhân giống và đưa ra các đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao hiệu quả chiết xuất và hoàn thiện quy trình nuôi trồng quả thể.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Dữ liệu thực nghiệm của khóa luận được tổng hợp cụ thể qua bảng số liệu sau:

Giai đoạn nhân sinh khối	Nghiệm thức tối ưu	Tốc độ lan tơ / Thời gian phát triển	Định tính Triterpen	Hàm lượng Polysaccharide (%)
Nhân giống cấp 1 (Đĩa petri)	Môi trường Raper (RP)	Bán kính tơ sau 7 ngày: 4,15 cm (nhóm A)	Dương tính (vàng sang vàng cam)	0,78% (cao nhất cấp 1)
Nhân giống cấp 2 (Bình nước biển)	Cơ chất Hạt lúa (HL) / Hạt gạo lứt (HG)	Chiều dài lan tơ sau 7 ngày: 6,01 cm (trên hạt lúa)	Dương tính (vàng sang vàng cam)	0,74% (cao nhất trên gạo lứt)
Cơ chất nuôi trồng (Bịch phôi mùn cưa)	90% Mạt cưa + 5% cám gạo + 5% bắp xay (BC)	Tơ lan phủ kín 100% bịch phôi trong 33 ngày	Dương tính (vàng sang vàng cam)	0,84% (cao nhất giai đoạn nuôi trồng)

Về mặt kinh tế - kỹ thuật ở giai đoạn nhân giống cấp 1, dù môi trường Raper cho tốc độ lan tơ nhanh nhất (4,15 cm), kết quả phân tích phương sai DUNCAN cho thấy tốc độ này không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với môi trường PDA bổ sung khoáng (3,99 cm) và PDA cơ bản (3,93 cm). Do đó, tác giả đưa ra nhận định có thể ứng dụng môi trường PDA thông thường để nhân giống cấp 1 giúp tiết kiệm chi phí hóa chất và đơn giản hóa thao tác chuẩn bị môi trường.

Đóng góp của đề tài

1. Đề tài đã tuyển chọn được các công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp cho từng giai đoạn nhân sinh khối tơ nấm thượng hoàng (Phellinus linteus), giải quyết được bài toán sinh trưởng chậm của loài nấm này.
2. Xác định được sự tích lũy hoạt chất sinh học (polysaccharide và triterpen) ngay trong hệ sợi tơ nấm mà không cần chờ đến giai đoạn hình thành quả thể lâu năm.
3. Cung cấp quy trình chiết xuất kiềm kết hợp thẩm tích và kết tủa ethanol, cùng điều kiện phản ứng tối ưu cho phép thử định lượng phenol - sulfuric acid ($0,5$ mL phenol 5%, $2,5$ mL $H_2SO_4$ đặc, ủ 10 phút) áp dụng trên sinh khối tơ nấm thượng hoàng.

Kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục khảo sát các điều kiện môi trường vật lý (nhiệt độ, ẩm độ, pH, cường độ chiếu sáng) ảnh hưởng đến khả năng lan tơ và tích lũy hoạt chất.
• Mở rộng nghiên cứu nuôi trồng hình thành quả thể nấm thượng hoàng trên quy mô bán công nghiệp từ nguồn giống tơ đã tối ưu.
• Nghiên cứu sâu hơn về phương pháp định lượng cụ thể hàm lượng triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế về phương pháp phân tích triterpen: Khóa luận mới dừng lại ở bước chiết xuất thô và định tính sự hiện diện của triterpen thông qua phản ứng màu Liebermann – Burchard, chưa thực hiện định lượng nồng độ hoặc tách chiết phân lập từng phân đoạn triterpenoid cụ thể.
• Phạm vi môi trường dinh dưỡng: Nghiên cứu giới hạn khảo sát trên một số loại cơ chất nông nghiệp phổ biến tại địa phương (mạt cưa cao su, cám bắp, cám gạo, lúa, gạo lứt), chưa đánh giá ảnh hưởng của các nguồn cơ chất gỗ khác hoặc bổ sung các nguồn vi lượng đặc thù.
• Hướng mở tiếp theo: Dựa trên giới hạn của đề tài, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung chuẩn hóa quy trình nuôi cấy chìm (submerged fermentation) để sản xuất sinh khối sợi nấm quy mô lớn trong bioreactor, tối ưu hóa các thông số lên men nhằm thu nhận polysaccharides ngoại bào (EPS) và nội bào (IPS), đồng thời phân tích định lượng thành phần triterpen bằng HPLC-MS.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu thực nghiệm tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông nghiệp, Công nghệ thực phẩm và Dược học đang thực hiện các đề tài liên quan đến nấm dược liệu, nuôi cấy mô nấm hoặc chiết tách hoạt chất tự nhiên.
• Cán bộ kỹ thuật tại các trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ, các cơ sở sản xuất meo giống và trang trại nấm dược liệu muốn tham khảo thông số phối trộn cơ chất nhân giống cấp 1, cấp 2 và chuẩn bị bịch phôi nấm thượng hoàng.
• Các nhà nghiên cứu hóa sinh tham khảo quy trình chiết xuất kiềm kết hợp thẩm tích màng để tách polysaccharide thô và kỹ thuật dựng đường chuẩn so màu quang phổ Phenol - Sulfuric Acid.

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường nào cho tốc độ lan tơ nấm thượng hoàng cấp 1 nhanh nhất và tác giả khuyến nghị sử dụng môi trường nào trong thực tế?
Tơ nấm lan nhanh nhất trên môi trường Raper (RP) đạt bán kính trung bình 4,15 cm sau 7 ngày cấy. Tuy nhiên, do môi trường Raper không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) so với môi trường PDA (3,93 cm) và PDA bổ sung khoáng (3,99 cm) trong phép thử DUNCAN, tác giả khuyến nghị có thể sử dụng môi trường PDA thường để nhân giống nhằm tiết kiệm chi phí hóa chất và thuận tiện trong pha chế.

2. Phản ứng định tính triterpen trong khóa luận được thực hiện bằng phương pháp nào và cho hiện tượng gì?
Định tính triterpen được tiến hành bằng phản ứng Liebermann – Burchard. Cao chiết tơ nấm được hòa tan trong acetic anhydride, đun sôi, làm lạnh, sau đó nhỏ từ từ $H_2SO_4$ đậm đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả dịch chiết chuyển sang màu vàng cam, khẳng định sự hiện diện của triterpen trong tơ nấm ở cả 3 giai đoạn nhân giống.

3. Quy trình chiết xuất polysaccharide từ sinh khối tơ nấm được thực hiện như thế nào?
Mẫu tơ nấm khô được tiền xử lý với ethanol 96% ở 70 °C trong 60 phút để bất hoạt enzyme và loại tạp chất phân tử nhỏ. Phần bã được chiết với dung dịch $NaOH$ 5,1% ở 60,1 °C trong 77 phút, lọc lấy dịch rồi trung hòa bằng $HCl$ 5,1%. Dịch sau trung hòa được cô đặc ở 45 °C, đem thẩm tích bằng màng với nước khử ion ở 10 °C trong 3 ngày, sau đó kết tủa với ethanol 96% ở 4 °C và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu nhận polysaccharide thô (CP).

4. Cơ chất nhân giống cấp 2 nào cho tốc độ lan tơ nhanh nhất và cơ chất nào tích lũy polysaccharide cao nhất?
Trên môi trường hạt cấp 2, cơ chất hạt lúa (HL) cho tốc độ lan tơ nhanh nhất đạt chiều dài 6,01 cm sau 7 ngày nuôi cấy. Trong khi đó, cơ chất hạt gạo lứt (HG) lại cho hiệu quả tích lũy hàm lượng polysaccharide cao nhất, đạt 0,74%.

5. Công thức cơ chất nuôi trồng nào giúp tơ nấm lan kín bịch phôi nhanh nhất và hàm lượng polysaccharide đạt bao nhiêu?
Công thức cơ chất BC gồm 90% mạt cưa cao su + 5% cám gạo + 5% bắp xay giúp tơ nấm lan đầy 100% bịch phôi trong thời gian ngắn nhất là 33 ngày, đồng thời đạt hàm lượng polysaccharide cao nhất trong các nghiệm thức nuôi trồng với tỷ lệ 0,84%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lư Thanh Hiền đã khảo sát thành công ảnh hưởng của các công thức môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng hệ sợi và hàm lượng hoạt chất sinh học của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus) qua 3 cấp nhân giống. Nghiên cứu đã xác định được môi trường thạch Raper (hoặc PDA), môi trường hạt lúa/gạo lứt và cơ chất mùn cưa cao su bổ sung 5% cám gạo cùng 5% bắp xay là các môi trường tối ưu cho từng giai đoạn sinh trưởng. Kết quả thực nghiệm khẳng định tơ nấm thượng hoàng có khả năng tích lũy hàm lượng polysaccharide cao (từ 0,74% đến 0,84%) và tổng hợp triterpen ổn định, mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng sinh khối hệ sợi thay thế quả thể trong sản xuất dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG POLYSACCHARIDES VÀ TRITERPEN TRONG CÁC TIẾN TRÌNH NHÂN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG Phellinus linteus LƢ THANH HIỀN AN GIANG, THÁNG 5 NĂM 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG POLYSACCHARIDES VÀ TRITERPEN TRONG CÁC TIẾN TRÌNH NHÂN SINH KHỐI NẤM THƢỢNG HOÀNG Phellinus linteus LƢ THANH HIỀN MÃ SỐ SV: DSH182628 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS. HỒ THỊ THU BA AN GIANG, THÁNG 5 NĂM 2022 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề cƣơng khóa luận “ Xác định hàm lƣợng polysaccharides và triterpen trong các tiến trình nhân sinh khối nấm thƣợng hoàng Phellinus linteus”, do sinh viên Lƣ Thanh Hiền thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hồ Thị Thu Ba. Tác giả đã báo cáo đề cƣơng nghiên cứu và đƣợc Hội đồng khoa học và Đào tạo thông qua ngày……………………………………………………….

Phản biên 1 Phản biện 2 TS. Đoàn Thị Minh Nguyệt ThS. Văn Viễn Lƣơng Cán bộ hƣớng dẫn TS. Hồ Thị Thu Ba i LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình học tập, em cảm thấy rất tự hào và vinh hạnh vì là một sinh viên thuộc ngành Công nghệ Sinh học thuộc khoa Nông nghiệp – Tài nguyên – Thiên nhiên của trƣờng đại học An giang đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.

Trƣớc tiên cho tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng đại học An Giang và các giảng viên bộ môn ngành Công nghệ Sinh học đã dạy dỗ giúp đỡ em trong quá trình học tập 4 năm vừa qua. Tiếp theo em xin cảm ơn sâu sắc đến cô TS. Hồ Thị Thu Ba, ngƣời đã hƣớng đẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận, cô rất quan tâm, tận tình hƣớng đẫn giúp trao dồi thêm nhiều kiến thức. Tôi cảm ơn cô rất nhiều, tôi chúc cô dòi dào sức khỏe và thành công trên con đƣờng giảng dạy.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn tập thể lớp DH19SH, đã giúp đỡ em trong suốt 4 năm học vừa qua.Cùng trải qua những buổi học căng thăng, hay vui đùa. Cùng trải qua những kỉ niệm đẹp chuyến đi thực tế. Chúc các bạn tập thể DH19SH luôn khỏe mạnh và thành công trên con đƣờng sự nghiệp trong tƣơng lai.năm 2022 Ngƣời thực hiện Lƣ Thanh Hiền ii LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng.

Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ nghiên cứu khác ………,ngày….tháng……năm 2022 Ngƣời thực hiện Lƣ Thanh Hiền iii TÓM TẮT Nghiên cứu “Xác định hàm lƣợng polysaccharides và triterpen trong các quá trình nhân sinh khối nấm thƣợng hoàng Phellinus linteus”. đƣợc thực hiện nhằm khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của tơ nấm thƣợng hoàng (Phenllinus linteus) cũng nhƣ sự hiện diện polysaccharide và triterpen trong tơ nấm qua các giai đoạn nhân giống. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tơ nấm lan nhanh nhất trên môi trƣờng phân lập Rapper (4,15 cm) sau 7 ngày cấy nấm. Đối với môi trƣờng hạt sau 7 ngày cấy nấm, sử dung hạt lúa (6,01 cm) để cấy sang môi trƣờng nuôi trồng.

Tơ nấm lan đầy bịch phôi với thời gian ngắn nhất đối với cơ chất trồng mạt cƣa cao su 90% + 5% cám gạo + 5% bắp xây ( 33 ngày).