Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycyl Funtumin lên phiên mã gen XIAP trên tế bào BT474

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu ảnh hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào ung thư BT474, cung cấp dữ liệu khoa học.

• Tác giả: Đỗ Thị Thanh Hoa
• Người hướng dẫn: PGS. Đỗ Hồng Quảng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Glycyl Funtumin Lên Mức Độ Phiên Mã Gen XIAP Trên Dòng Tế Bào BT474
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về gen XIAP và vai trò trong ung thư

Gen XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) là một trong những gen quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình apoptosis hoặc chết tế bào lập trình. XIAP thuộc họ protein IAP (Inhibitor of Apoptosis Proteins) và đóng vai trò then chốt trong việc ức chế các tín hiệu dẫn đến chết tế bào. Sự biểu hiện quá mức của XIAP thường được quan sát trong các tế bào ung thư, đặc biệt là trong ung thư vú dòng BT474. Điều này giúp các tế bào ung thư thoát khỏi sự kiểm soát apoptosis, từ đó tăng khả năng phát triển và chống lại các liệu pháp điều trị. Hiểu rõ cơ chế hoạt động của XIAP là chìa khóa để phát triển các chiến lược điều trị ung thư hiệu quả hơn.

1.1. Cấu trúc phân tử và chức năng của XIAP

XIAP có cấu trúc gồm ba miền BIR (Baculoviral IAP repeat) và một miền RING. Các miền BIR này cho phép XIAP liên kết với caspase-3, caspase-7 và caspase-9, từ đó ức chế hoạt động của chúng. Điều này ngăn chặn quá trình apoptosis bình thường. Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng mức độ biểu hiện gen XIAP cao có liên quan trực tiếp đến khả năng sống sót và chống chỉ định của tế bào ung thư.

1.2. Mối liên hệ giữa XIAP và ung thư vú

Trong ung thư vú, đặc biệt là dòng tế bào BT474, XIAP thường được biểu hiện ở mức độ cao. Điều này giúp tế bào ung thư tránh khỏi apoptosis do các yếu tố liệu pháp gây ra. Sự gia tăng biểu hiện XIAP liên quan đến khả năng chống thuốc và tăng khả năng di căn của các tế bào ung thư. Do đó, việc giảm mức độ phiên mã XIAP được coi là một chiến lược hữu ích trong điều trị ung thư.

II. Glycyl Funtumin Tác dụng và cơ chế tác động lên XIAP

Glycyl Funtumin là một hợp chất dược liệu có tác dụng sinh học đáng chú ý trong việc ức chế biểu hiện gen XIAP. Các nghiên cứu sơ bộ cho thấy rằng Glycyl Funtumin có khả năng làm giảm mức độ phiên mã XIAP trên dòng tế bào BT474 một cách liều lượng phụ thuộc. Hợp chất này hoạt động thông qua các cơ chế phân tử đặc thù, tương tác với các thành phần tế bào nội sinh để điều chỉnh biểu hiện gene. Điều này mở ra khả năng ứng dụng Glycyl Funtumin như một agent điều trị ung thư tiềm năng, giúp hồi phục khả năng apoptosis bình thường trong tế bào ung thư.

2.1. Cấu trúc phân tử và đặc điểm của Glycyl Funtumin

Glycyl Funtumin là một hợp chất hữu cơ với cấu trúc phân tử phức tạp chứa các nhóm glycyl đặc trưng. Cấu trúc này cho phép nó xuyên qua màng tế bào và tương tác với các thành phần nội tế bào. Tính chất sinh khả dụng cao của Glycyl Funtumin làm cho nó trở thành một ứng cử viên lý tưởng cho nghiên cứu dược lý trong vitro trên các dòng tế bào ung thư.

2.2. Cơ chế tác động lên mức độ phiên mã gen XIAP

Glycyl Funtumin ức chế biểu hiện XIAP thông qua việc inhibit các yếu tố phiên mã hoặc làm ổn định ARN messenger XIAP dẫn đến giảm mức độ phiên mã. Khi mức độ mRNA XIAP giảm, tế bào ung thư mất đi bộ đôi bảo vệ apoptosis, từ đó dễ dàng bị chết tế bào. Hiệu ứng này phụ thuộc vào liều lượng của Glycyl Funtumin, cho thấy tính chất liều lượng-phụ thuộc điển hình.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen XIAP bằng RT PCR

Real-time PCR (RT-PCR) hay còn gọi là qPCR là phương pháp tiêu chuẩn vàng để đánh giá mức độ phiên mã gen XIAP ở mức độ định lượng. Phương pháp này cho phép theo dõi biểu hiện gen thời gian thực thông qua việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang sinh ra trong quá trình khuếch đại ADN. Trong nghiên cứu này, các mẫu ARN được tách chiết từ tế bào BT474 được xử lý, sau đó tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng RT-PCR với các primer đặc thù cho gen XIAP. Độ tinh sạch ARN được xác định bằng quang phổ NanoDrop để đảm bảo chất lượng mẫu. Các kết quả được phân tích thống kê để xác định tác dụng ức chế của Glycyl Funtumin.

3.1. Quy trình tách chiết ARN và chuẩn bị mẫu

ARN được tách chiết từ tế bào BT474 sử dụng các phương pháp chuẩn để đạt độ tinh sạch cao. Độ tinh sạch ARN được xác định bằng chỉ số OD260/280 trên máy NanoDrop. Các mẫu ARN chỉ được sử dụng khi tỉ lệ OD260/280 nằm trong khoảng 1.8-2.0, đảm bảo chất lượng cho các phản ứng PCR tiếp theo. Việc bảo quản mẫu ARN ở -80°C là quan trọng để duy trì tính toàn vẹn của ARN.

3.2. Phản ứng RT PCR định lượng gen XIAP

Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện từ mẫu ARN tinh sạch sử dụng các enzyme phiên mã ngược. Sau đó, phản ứng real-time PCR được thiết lập với các primer và probe đặc thù cho gen XIAP. Giá trị Ct (Cycle threshold) được sử dụng để tính toán mức độ biểu hiện tương đối của gen XIAP. Gen housekeeping như GAPDH được sử dụng làm chuẩn bên trong để bình thường hóa kết quả.

IV. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Glycyl Funtumin trên gen XIAP

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng Glycyl Funtumin có tác dụng làm giảm mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474 theo cách liều lượng phụ thuộc. Khi tế bào BT474 được xử lý với các nồng độ khác nhau của Glycyl Funtumin (AS3: 3,0µg/mL và AS6: 6,0µg/mL), mức độ biểu hiện XIAP giảm đáng kể. Tại liều 6,0µg/mL, sự ức chế phiên mã XIAP là rõ ràng nhất, cho thấy hiệu quả ức chế mạnh. Những phát hiện này hỗ trợ giả thuyết rằng Glycyl Funtumin là một ứng cử viên hứa hẹn cho phát triển liệu pháp ung thư mới, giúp tái kích hoạt apoptosis trong tế bào ung thư.

4.1. Kết quả định lượng và phân tích biểu hiện XIAP

Giá trị Ct của gen XIAP trong tế bào điều khiển (không xử lý) thấp hơn so với các tế bào được xử lý Glycyl Funtumin, cho thấy mức độ phiên mã XIAP giảm. Phân tích thống kê bằng phương pháp ∆∆Ct cho thấy sự giảm mức độ biểu hiện XIAP là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Điều này chứng minh rằng Glycyl Funtumin có khả năng ức chế phiên mã gen XIAP hiệu quả trên dòng tế bào BT474.

4.2. Ý nghĩa lâm sàng và hướng phát triển tiếp theo

Khả năng giảm biểu hiện XIAP của Glycyl Funtumin có thể tăng độc tính của tế bào ung thư đối với liệu pháp hóa trị hoặc liệu pháp sinh học khác. Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới để phát triển thuốc kết hợp sử dụng Glycyl Funtumin với các agent điều trị ung thư khác. Các nghiên cứu in vivo trên động vật thí nghiệm được khuyến khích để xác nhận tác dụng và đánh giá độ an toàn trước khi áp dụng lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, ung thư được coi là căn bệnh đe dọa nghiêm trọng đến tình hình sức khỏe của con người khi tỷ lệ mắc ung thư đang ngày một gia tăng trên toàn thế giới. Theo dữ liệu thống kê của Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC), chỉ tính riêng trong năm 2018, đã có hơn 18 triệu ca bệnh ung thư mới mắc và đáng kinh ngạc hơn nữa, hơn 9,5 triệu người chết vì căn bệnh ung thư trên toàn cầu. Việt Nam với tổng số dân khoảng hơn 96 triệu dân, trong năm 2018, có đến có đến 114871 người chết vì căn bệnh ung thư và chưa dừng lại ở đó, 164671 ca mới được chẩn đoán ung thư trên cả nước [40]. Đứng trước gánh nặng do bệnh ung thư đặt ra, việc tiếp tục đẩy mạnh hoạt động nghiên cứu các thuốc, hoạt chất có tác dụng trong điều trị ung thư là hết sức cần thiết.

Trong đó, glycyl funtumin là hoạt chất chính trong biệt dược Aslem – thuốc tiêm có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào hiện đang sử dụng với chỉ định hỗ trợ điều trị ung thư. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra glycyl funtumin có khả năng ức chế sự phiên mã gen survivin tại nồng độ thích hợp. Nghiên cứu của Lê Hà Phương (2016) cho thấy sau 48 giờ, ở mức nồng độ 6,0μg/mL, glycyl funtumin ức chế 40% sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào ung thư vú BT474 [4]. Ngoài ra, nghiên cứu của PGS.

Trong đó, survivin cùng với 7 protein khác bao gồm: XIAP, NAIP, cIAP-1, cIAP-2, Apollon, ML-IAP, ILP-2 đều thuộc nhóm các protein ức chế sự chết tế bào theo chu trình (IAPs) có vai trò đặc biệt quan trong trong sự hình thành khối u. Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu trước đây, có thể thấy việc nghiên cứu mở rộng, làm rõ cơ chế và thử nghiệm ảnh hưởng của glycyl funtumin trên nhóm IAPs, chỉ dấu sinh học quan trọng trong ung thư cần được tiếp tục tiến hành. Vì những lý do nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474” với mục tiêu: “Đánh giá ảnh hưởng của glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen XIAP trên dòng tế bào BT474” 1 CHƢƠNG 1. Tổng quan về XIAP XIAP là một protein thuộc nhóm các protein ức chế và đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sự chết theo chu trình của tế bào (Apoptosis) gọi là IAPs.

Apoptosis là sự tự chết theo chu trình của tế bào (programmed cell death - PCD) xảy ra trong các sinh vật đa bào, có ảnh hưởng không chỉ đến sự phát triển, tính toàn vẹn của các sinh vật đa bào mà bên cạnh đó, những bất thường liên quan đến quá trình apoptosis có thể dẫn đến sự hình thành khối u, tự miễn dịch và các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng khác. Ở động vật có vú, apoptosis có thể được kích hoạt bởi ba con đường khác nhau: (1) con đường ngoại sinh, thông qua các tín hiệu ngoại bào liên kết với các thụ thể trên màng tế bào và kích hoạt caspase-8 để gây ra cơ chế tự hủy tế bào; (2) con đường nội sinh, liên quan đến tín hiệu bên trong tế bào thông qua ty thể, được bắt đầu bởi stress tế bào dẫn đến kích hoạt caspase-9; hoặc (3) con đường granzym B, thông qua protease granzym B gây độc tế bào [11, 20]. Apoptosis, giống như bất kỳ chu trình sinh học nào, chịu sự điều khiển, có thể kích hoạt hoặc ức chế, bởi nhiều yếu tố hóa học. Trong đó, các chất ức chế apoptosis là nhóm các protein chủ yếu hoạt động theo con đường nội sinh, ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào; điển hình bao gồm họ Bcl-2, chất ức chế viral Crma, và họ IAPs.

IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins - nhóm các protein ức chế quá trình Apoptosis) được tìm thấy ở hầu hết các tế bào động vật có xương sống từ bậc thấp đến bậc cao. Cho đến nay, có 8 protein trong nhóm đã được xác định ở người bao gồm: NAIP (còn được gọi là BIRC-1), cIAP-1 (hay HIAP-2/MIHB/BIRC-2), cIAP-2 (hay HIAP-1/MIHC/BIRC-3), XIAP (hILP/MIHA/BIRC-4), survivin (TIAP/BIRC-5), Apollon (Bruce/BIRC-6), ML-IAP (KIAP/livin/BIRC-7) và ILP-2 (BIRC-8). Các protein thuộc nhóm IAPs có chức năng sinh lý điều chỉnh sự chết tế bào theo chu trình và đồng thời giữ vai trò quan trọng quyết định số phận của tế bào trong việc đáp ứng với các tín hiệu bất thường của gen. Do đó, các protein này, nếu có rối loạn về mặt chức năng, có thể dẫn tới sự hình thành và phát triển của khối u, phát sinh ung thư hoặc sự kháng thuốc.

Cấu trúc phân tử Ở người, gen XIAP có chiều dài 54256 cặp nucleotid chứa 6 đoạn exon nằm trên 2 nhiễm sắc thể X ở vị trí Xq25 (hình 1.1) mã hóa cho một protein cùng tên – protein XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) hay còn gọi là IAP3 hay BIRC4. Protein XIAP gồm 497 acid amin, nằm trong tế bào chất và được xem là protein có hoạt tính ức chế caspase mạnh nhất trong số các protein đã biết trong họ IAPs hiện nay [10, 22, 25]. Vị trí của gen XIAP trên nhiễm sắc thể X ở người Dù khác nhau về cấu trúc, tất cả 8 protein thuộc nhóm IAPs hiện nay đều có một phần cấu trúc cơ bản, gọi là chuỗi lặp BIR (baculovirus IAP repeat), chứa khoảng 70 amino acid ở đầu tận cùng N đặc trưng cho nhóm. Mỗi IAP, tùy theo cấu trúc, có thể chứa từ một đến ba miền BIR, có vai trò quyết định hoạt tính ức chế apoptosis.

Miền BIR có phần lõi cấu tạo từ Cystein và Histidin với cấu trúc 3 vòng xoắn alpha nhỏ (CX2 CX16 HX6 C); có vai trò ức chế hoạt động của caspase thông qua một liên kết với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspase. Ngoài vùng BIR, một số IAP của virus, động vật có vú và côn trùng còn có một cấu trúc dạng vòng xoắn alpha ở đầu tận cùng C liên quan đến hoạt động ubiquitin-ligase [12, 14, 24]. Sơ đồ cấu trúc phân tử các protein họ IAPs [22] Protein XIAP gồm 3 miền BIR (BIR1, BIR2, BIR3) ở đầu tận cùng N, 1 miền UBA (ubiquitin associated domain) và 1 miền RING (really interesting new genes) ở đầu tận cùng C (hình 1. Trong khi 3 miền BIR quyết định vai trò ức chế trực tiếp 3 caspase thì miền UBA và miền RING lại liên quan đến chức năng liên kết với E3- ubiquitin [22, 25, 41].

Cấu trúc phân tử protein XIAP [41] 1. Chức năng sinh học của XIAP XIAP là protein đa chức năng, trong đó, chức năng sinh học quan trọng bao gồm: ức chế quá trình apoptosis, vận chuyển nhiễm sắc thể trong phân bào, điều hòa cân bằng nội môi và có vai trò trong sự vận chuyển tín hiệu trong tế bào. mARN XIAP đã được quan sát thấy ở tất cả các mô ở người trưởng thành và cả ở thai nhi, ngoại trừ bạch cầu máu ngoại biên [14, 18]. Điều này cho thấy vai trò đặc biệt quan trọng và có tầm ảnh hưởng rộng trên nhiều tế bào khác nhau.1 Vai trò ức chế sự chết tế bào theo chu trình Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chu trình đã được lập trình trong gen, là một phần trong hoạt động sống của tế bào đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài hoà trong thời gian phát triển phôi thai, bảo vệ cơ thể và thay thế mô ở những cơ thể trưởng thành [8].

Trường hợp bệnh lí, những tế bào không được cung cấp máu sẽ trương lên, nứt, rách màng và gây vỡ tế bào dẫn tới thực bào hoặc tế bào bị teo lại, màng tế bào trở nên sần sùi và nhân thường kết đặc. Apoptosis được khởi đầu bởi cytochrom C thông qua liên kết với cardiolipin ở màng trong ty thể, thông qua một chuỗi phản ứng, kích hoạt các caspase - một nhóm các protease cystein – trong đó, có caspase-3 và caspase-7 làm nhiệm vụ tiêu diệt tế bào bằng cách ức chế và phân hủy những enzym nhân đôi và enzym sửa chữa ADN; hoạt hoá những enzym cắt ADN thành những mảnh nhỏ và phá vỡ cấu trúc protein trong nhân; dẫn tới quá trình thực bào và sự thay thế bằng một tế bào mới sau vài giờ [9] (hình 1. Cơ chế ức chế apoptosis của XIAP bằng cách ức chế caspase-3,7,9 IAPs nói chung đều có khả năng ức chế apoptosis, tuy nhiên, XIAP được xem là protein có hoạt tính ức chế caspase mạnh nhất họ IAPs hiện nay và XIAP được chứng minh là ức chế cả con đường nội sinh và ngoại sinh của apoptosis [26, 31, 34]. Cơ chế gây ức chế Apoptosis của XIAP được cho là do XIAP có khả năng ức chế trực tiếp caspase-3,7,9; trong đó, caspase 9 là caspase khơi mào, caspase 3,7 là các caspase phản ứng.

Caspase có vai trò tối quan trọng đối với sự chết theo chu trình của tế bào. Caspase khơi mào có chức năng “cắt gọt” các caspase phản ứng (đang ở dạng bất hoạt) qua đó hoạt hóa chúng, nhờ đó hàm lượng caspase hoạt hóa trong tế bào tăng lên rất nhanh. Khi được hoạt hóa, caspase phản ứng tiếp tục “cắt gọt” các protein khác trong tế bào, khởi đầu cho quá trình Apoptosis. Vì vậy, khi XIAP liên kết trực tiếp với caspase-9 tại miền BIR-3 và bất hoạt caspase-9 bằng cách giữ nó ở trạng thái monomer, không hoạt động; đồng thời ức chế caspase-3,7 do liên kết với chúng tại miền BIR-2, từ đó gây ức chế chu trình apoptosis [14, 31, 36].

Ngoài ra, XIAP có miền UBA và miền RING ở đầu tận cùng C cho phép tạo liên kết với E3-ubiquitin. Từ đó, phức hợp này thông qua hoạt động của proteasomes, xúc tác cho phản ứng phân hủy caspase 3 và caspase 7, làm ức chế apoptosis [8, 11]. Trong một cơ chế khác, XIAP ức chế apoptosis bằng cách gắn với protein pro- apoptotic được gọi là Secondary Mitochondria - derived Activator of Caspase (SMAC/DIABLO) - là protein được giải phóng từ ty thể để kích hoạt caspase-9. Hoạt tính ubiquitin của XIAP cho phép các lysosom vào trong ty thể và làm thoái hóa SMAC/DIABLO [11].

Sida Qin và cộng sự đã chứng minh sự biểu hiện quá mức của XIAP gây ức chế SMAC/DIABLO thông qua hoạt tính ubiquin dẫn tới ngăn chặn quá trình apoptosis trong ung thư phổi tế bào nhỏ (NSCLC) [32].2 XIAP trong sự dẫn truyền tín hiệu trong tế bào Một số IAP đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu. Các con đường truyền tín hiệu bị ảnh hưởng bởi IAP bao gồm yếu tố hạt nhân kappa B (NF-kB) và stress kinase (JNK), protein kinase hoạt hóa p38 (MAPK), thụ thể protein BMP như BMP typ I [27].