HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP CHẤT CORDYCEPIN Hà Nội, tháng 02 năm 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN GIỐNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) GIÀU HỢP CHẤT CORDYCEPIN Sinh viên thực hiện : Nguyễn Anh Tuấn Mã sinh viên : 645341 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thanh Hảo Địa điểm thực hiện : Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm Hà Nội, tháng 02 năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước Học viện và Hội đồng.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Anh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được giúp đỡ, động viên tích cực từ các cá nhân, tập thể. Trong thời gian thực tập tại Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm – Học viên Nông nghiệp Việt Nam tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo tận tình của các Thầy, cô và cán bộ tại viện thí nghiệm. Cùng với sự cố gắng, nỗ lực của bản thân và những bài học kinh nghiệm tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các Thầy, Cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên ngành, kỹ năng làm việc trong phòng thí nghiệm và những bài học quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thanh Hảo đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Mặc dù đã cố gắng hoàn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình, năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp của quý thầy cô và các bạn để tôi có thể hoàn thành khóa luận được tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Anh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.
ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát. Mục tiêu cụ thể.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris. Phân loại nấm Cordyceps militaris. Đặc điểm sinh học của Cordyceps militaris. Giá trị dược liệu của Cordyceps militaris.
Đặc điểm sinh sản nấm Cordyceps militaris. Chọn giống nấm bằng phương pháp lai đơn bào tử. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chọn giống. Quy trình chọn giống nấm bằng phương pháp lai bào tử đơn .4 KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO.
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng/cơ chất. Ảnh hưởng của nguồn carbon. Ảnh hưởng của nguồn nito. Ảnh hưởng của nguồn khoáng chất.
Ảnh hưởng của các thành phần bổ sung. Ảnh hưởng của axit béo và dầu thực vật. Ảnh hưởng của hormon sinh trưởng. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy.
Ảnh hưởng của nhiệt độ. Tình hình nghiên cứu của nấm Cordyceps militaris. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam.
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp phân lập bào tử đơn bội. Nghiên cứu thu bào tử đơn bội từ nấm đông trùng hạ thảo. Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp Teik-khiang Goh.
Nghiên cứu phân lập bào tử theo phương pháp của Zhang. Nghiên cứu nhân nhanh bào tử đơn bội. Nghiên cứu lai bào tử đơn dòng tạo dòng hữu tính và cảm ứng hình thành stroma. Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và hình thái các tổ hợp lai thu được31 2.
Xác định hàm lượng Cordycepin có trong các tổ hợp lai nghiên cứu. Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Nghiên cứu phân lập bào tử từ 3 chủng nấm nghiên cứu.
Nghiên cứu khả năng lai của bào tử đơn bội. Đánh giá đặc điểm hình thái, sinh trưởng và khả năng tích lũy cordycepin của các tổ hợp lai. Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường rắn. Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường lỏng.
Đánh giá đặc điểm hình thái quả thể của các tổ hợp lai. Xác định hàm lượng cordycepin các tổ hợp lai thu được. Đặc điểm của tổ hợp lai tiềm năng được tuyển chọn. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
48 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 49 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các chất có hoạt tính sinh học trong nấm C. Danh sách các đơn vị cung cấp nguồn giống C.
Hiệu quả phân lập bào tử bằng 3 phương pháp khác nhau. Ưu nhược điểm của các phương pháp phân lập bào tử. Kết quả lai của 3 bào tử đơn bội trên môi trường PDA, gạo lứt, gạo lứt và nhộng (-) tổ hợp lai không hình thành quả thể, (+) tổ hợp lai có hình thành quả thể. Đường kính khuẩn lạc và khối lượng sinh khối khô của các tổ hợp lai thu được trong môi trường dịch thể.
Đặc điểm hình thái quả thể của các tổ hợp lai. Đặc điểm lựa chọn tổ hợp lai. 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. militaris được thu nhận ngoài tự nhiên.
Mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử của nấm C. Các dạng bào tử của nấm C. Ảnh 3 chủng giống bố mẹ. Biểu đồ phân lập bào tử nấm đông trùng hạ thảo bằng 3 phương pháp khác nhau.
Đặc điểm hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường PDA. Đặc điểm hình thái của 3 tổ hợp lai trên môi trường gạo lứt và nhộng vào thời kì bắt đầu nhú sợi. Biểu đồ đường kính khuẩn lạc và khối lượng sinh khối khô của các tổ hợp lai thu được trong môi trường dịch thể. Hệ sợi các tổ hợp lai trên môi trường nuôi cấy PDA.
Hình ảnh 3 tổ hợp lai đã phát triển đầy đủ. Hình ảnh quả thể của 3 tổ hợp lai. Hàm lượng cordycepin của 3 tổ hợp lai (mg/100g). 45 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CÁC KÝ HIỆU Mb mega base pair kb kilo base pair CHỮ VIẾT TẮT CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide EDTA Ethylene diamine tetraacetic ac NCBI National Center for Biotechnology MT Môi trường PDA Potato - D-Glucose – Agar PD Potato - D-Glucose WA Water – Agar SD/S Spore drop/shooting C.
militaris Cordyceps militaris Stroma Quả thể nấm 1 Tóm tắt đề tài Từ 3 mấu nấm đông trùng hạ thảo lấy từ 3 cơ sở nghiên cứu : Đại học khoa học tự nhiên, Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm xét nghiệm ADN NAVOGEN. Sau khi nghiên cứu lai 3 giống nấm với nhau, thu được 3 chủ con lai có hàm lượng cordycepin cao. Trong đó con lai giữa 2 chủng nấm của Đại học khoa học tự nhiên và viện di truyển nông nghiệp Việt Nam mang lại con lại với lượng cordycepin cao, tốc độ sinh trưởng 0,84cm/ngày. Hàm lượng cordycepin thu được trên 50cm2 hũ nuôi là 8,67mg/hũ.
Đặc điểm của con lai có màu cam đậm, đầu tròn phình ra ở đình, thân stroma thẳng số lượng stroma là 72±00, đường kính khuẩn lạc nhỏ và có khối lượng sinh khố khô cao. Ngoài ra, còn đánh giá được phương pháp phân lập tối ưu nhất là phương pháp của Zhang, phương pháp này giúp chúng ta có thể khống chế và chọn lựa những bào tử bào tử tốt nhất, phương pháp này còn giúp cho tổ hợp lai ít bị nhiêm vi sinh vật gây hại cho sự phát triển của con lai. Chọn ra được môi trường tối ưu để tiến hành lai bào tử đơn ở nấm C. militaris có chứa 20g gạo lứt, 4g nhộng tằm và 64ml dịch (20g sucrose, 20g peptone, 1g MgSO4.7H2O; 0,5g KH2PO4 pha trong 1l nước cất).
Tính cấp thiết của đề tài Cordyceps là chi nấm có nhiều hoạt chất dược liệu quý hiếm với hoạt tính sinh học cao (Che, Z.M và cộng sự. Đến nay, đã có hơn 400 loài Cordyceps được tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có 36 loài được đưa vào khai thác, nuôi trồng (Sengupta và cộng sự. Trong số đó, Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh mang dược liệu quý và sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc và một số nước Châu Á (Zheng và cộng sự. militaris có nhiều hoạt chất chống oxi hóa bao gồm cordypolisaccarid, adenine, 3’-amino-3’-deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, cordycepic acid và D-mannitol có hiệu quả trong việc phòng chống bệnh tiêu hóa, tim mạch, hen suyễn, tiểu đường (Zheng và cộng sự.
Ngoài ra, nhóm chất polysaccharide được chiết xuất từ hệ sợi nấm C. militaris giúp ngăn ngừa và tăng khả năng hạ đường huyết thông qua các cơ chất liên quan đến glucose, glicose -6-phosphate dehydrogenase (Yokoyama và cộng sự. Với đặc tính dược liệu có nhiều hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, C. militaris ngày càng được nuôi trồng và phát triển nhanh chóng với quy mô lớn.
Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam quá trình chọn giống các loại nấm ăn, nấm dược liệu và C. militaris chủ yếu thông qua sinh sản vô tính để nuôi cấy, nhân giống và bảo tồn. Trong quá trình phát triển C. militaris sinh sản lượng lớn bào tử vô tính có cùng đặc điểm di truyền.
Khi các bào tử này phát triển hình thành quả thể, chúng kết hợp vật liệu di truyền với nhau và các vật liệu di truyền cùng di truyền từ mẫu nấm mẹ, đều này vô tình làm giống nấm C. militaris dễ bị thoái hóa. 1 Trên thế giới, các giống nấm C. militaris mới có thể được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến với tác nhân UV, hóa học kết hợp với chọn lọc (Yokoyama và cộng sự;.
Dựa vào phương pháp này, có thể tạo ra những tính trạng hoàn toàn mới, tuy nhiên, hiệu suất thu được những tính trạng này tương đối thấp và kỹ thuật thực hiện tương đối khó khăn (Park và cộng sự.