Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm Isaria japonica (còn có tên gọi khác là bông tuyết trùng thảo, giai đoạn vô tính của Cordyceps takaomontana) là một loài nấm dược liệu quý thuộc họ Cordycipitaceae. Các công trình nghiên cứu dược lý đã chứng minh loài nấm này chứa nhiều hoạt chất sinh học giá trị như Adenosine, N6-Adenosine, Beauvericin, Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol. Các hoạt chất này có tác dụng hỗ trợ tim mạch, ức chế một số dòng tế bào khối u ác tính, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn và đặc biệt là cải thiện tình trạng trầm cảm cũng như suy giảm nhận thức ở người cao tuổi.

Trong thực tế sản xuất, nấm I. japonica thường được nuôi trồng trên ký chủ côn trùng (nhộng tằm Bombyx mori) hoặc cơ chất bán rắn từ ngũ cốc. Tuy nhiên, việc sử dụng nguồn đạm từ nhộng tằm bộc lộ nhiều hạn chế:

  • Giá thành nguyên liệu cao và biến động theo mùa vụ.
  • Thành phần kitin trong vỏ nhộng có nguy cơ gây dị ứng cho người sử dụng.
  • Mùi vị tanh đặc trưng của nhộng tằm tồn dư trong sinh khối làm ảnh hưởng đến cảm quan sản phẩm.
  • Bột nhộng tằm không hòa tan hoàn toàn trong môi trường lỏng, dễ lắng đọng xuống đáy bình nuôi cấy, khiến hệ sợi nấm không hấp thu triệt để, gây lãng phí nguyên liệu.
  • Không phù hợp với phân khúc người tiêu dùng có nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng thuần chay.

Nuôi cấy lỏng tĩnh (static liquid culture) là phương pháp thu nhận sinh khối sợi nấm trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng không qua khuấy lắc. Phương pháp này cho năng suất sinh khối cao, chu kỳ nuôi cấy ngắn, hạn chế nguy cơ nhiễm khuẩn và dễ chuẩn hóa quy mô công nghiệp so với nuôi trồng quả thể bán rắn. Nhằm giải quyết các nhược điểm của bột nhộng tằm, đề tài "Khảo sát hiệu quả của một số loại đạm tự nhiên đến sự phát triển và khả năng tích lũy hàm lượng Adenosine của nấm Isaria japonica nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh" được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát hiệu quả của một số nguồn đạm tự nhiên thay thế bột nhộng tằm đến sự sinh trưởng, tạo sinh khối và khả năng tích lũy hoạt chất Adenosine trong hệ sợi nấm Isaria japonica nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Khảo sát sự phát triển, tích lũy sinh khối và hàm lượng Adenosine của nấm Isaria japonica trên 4 nguồn đạm tự nhiên khác nhau (bột đậu nành, cao chiết nấm men, cao chiết thịt bò, lòng đỏ trứng gà công nghiệp) so với đối chứng bột nhộng tằm trong môi trường lỏng tĩnh.
  2. Khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ đạm tối ưu (được lựa chọn từ nhiệm vụ 1) đến sự phát triển sinh khối và khả năng tích lũy Adenosine của hệ sợi nấm nhằm xác định công thức môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh phù hợp nhất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm Isaria japonica thuần khiết do Công ty Dược phẩm Osaka (Nhật Bản) cung cấp, lưu giữ tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh; 4 nguồn đạm khảo sát gồm cao chiết nấm men (Angel Yeast), bột đậu nành (Goce Việt Nam), cao chiết thịt bò (Titan Biotech Ltd), lòng đỏ trứng gà công nghiệp (Ba Huân) và đối chứng bột nhộng tằm (Lâm Hà, Lâm Đồng).
  • Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
  • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08/2023 đến tháng 11/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và vị trí phân loại

Theo phân loại sinh học (Sung, 2007), nấm Isaria japonica Yasuda thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Isaria. Loài này tồn tại hai giai đoạn: giai đoạn hữu tính mang tên Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa và giai đoạn vô tính là Isaria tenuipes Peck. Samson (tên đồng nghĩa: Paecilomyces tenuipes, Isaria japonica).

Hệ thống hoạt chất chính của nấm bao gồm nucleoside (Adenosine), cyclic depsipeptide (Beauvericin), polysaccharide ngoại bào (Exopolysaccharide - EPS), sterol (Ergosterol, Ergosterol peroxide), các acid amin thiết yếu và khoáng vi lượng. Trong đó, Adenosine giữ vai trò điều hòa dẫn truyền thần kinh, giãn mạch, chống thiếu máu cục bộ và bảo vệ tế bào não.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình nghiên cứu được tiến hành qua các giai đoạn thực nghiệm phòng thí nghiệm:

  1. Phục hồi và nhân dòng giống nấm:

    • Giống gốc trong ống nghiệm được cấy phục hồi trên môi trường thạch đĩa PGA (Potato Glucose Agar: 4 g tinh bột khoai tây, 20 g glucose, 20 g agar, 2 g $\text{MgSO}_4$, 1 g $\text{KH}_2\text{PO}_4$ định mức 1 L; khử trùng ở 121°C, 20 phút) qua 2–3 lần cấy truyền (thời gian ủ 15–20 ngày ở 20 ± 2°C trong tối).
    • Tăng sinh thứ cấp trong môi trường lỏng phục hồi (lòng trắng trứng gà, peptone, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{Na}_2\text{HPO}_4$, $\text{MgSO}_4$, skim milk, glucose; ủ tối 15–20 ngày ở 20 ± 2°C).
    • Cấy truyền từ môi trường lỏng sang đĩa petri PGA để tạo nguồn cấy đồng nhất (miếng thạch kích thước $0,5 \times 0,5\text{ cm}$) cho các thí nghiệm lỏng tĩnh.

  2. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy lỏng tĩnh:

    • Thí nghiệm 1 (Sàng lọc loại đạm): Bố trí đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại (mỗi lần lặp lại gồm 15 lọ thủy tinh, mỗi lọ chứa 150 mL môi trường lỏng tĩnh). Nồng độ các nguồn đạm khảo sát cố định ở mức 16,6 g/L, kết hợp sucrose 49,58 g/L, peptone 9,9 g/L, tinh bột khoai tây 4 g/L, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 1 g/L, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 1 g/L, vitamin $\text{B}_1$ 0,02 g/L. Nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn ở 20 ± 2°C trong 30 ngày.
      • ĐC: Bột nhộng tằm (16,6 g/L)
      • MT1 (NM): Cao chiết nấm men (16,6 g/L)
      • MT2 (DN): Bột đậu nành (16,6 g/L)
      • MT3 (TB): Cao chiết thịt bò (16,6 g/L)
      • MT4 (TG): Lòng đỏ trứng gà công nghiệp (16,6 g/L)
    • Thí nghiệm 2 (Tối ưu hóa nồng độ đạm): Sau khi xác định cao chiết nấm men là nguồn đạm tối ưu ở Thí nghiệm 1, tiến hành khảo sát 5 mức khối lượng cao chiết nấm men: 11,6 g/L (MT1), 16,6 g/L (MT2 - ĐC), 21,6 g/L (MT3), 26,6 g/L (MT4) và 31,6 g/L (MT5). Điều kiện nuôi cấy tương tự thí nghiệm 1 (150 mL/lọ, 30 ngày tối, nhiệt độ 20 ± 2°C).

  3. Chỉ tiêu và phương pháp thu thập dữ liệu:

    • Thời gian lan tơ: Theo dõi và ghi nhận số ngày hệ sợi nấm phát triển phủ kín hoàn toàn bề mặt dung dịch lỏng tĩnh.
    • Sinh khối tươi và sinh khối khô: Thu lớp váng sợi nấm nổi trên bề mặt sau 30 ngày, cân xác định khối lượng tươi (g/lọ). Sấy đông khô mẫu sinh khối để xác định khối lượng khô (g/lọ).
    • Hiệu suất sinh học (Biological Efficiency - BE %): Tính theo công thức Shrestha và ctv (2012): $$\text{BE } (%) = \left(\frac{\text{SDW}}{\text{MDM}}\right) \times 100$$ (Trong đó: $\text{SDW}$ là trọng lượng khô của nấm thu được trên mỗi bình; $\text{MDM}$ là khối lượng cơ chất khô ban đầu của mỗi bình).

  4. Quy trình định lượng Adenosine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

    • Xử lý mẫu: Cân chính xác 0,5 g bột sinh khối khô đã xay mịn vào ống falcon 15 mL, trích ly bằng sóng siêu âm (công suất 500W, tần số 40 kHz) trong 20 phút. Ly tâm tách bã ở 3500 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi qua giấy lọc Whatman No 1 vào bình định mức 50 mL, lặp lại chiết và định mức. Lọc qua màng lọc 0,22 µm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.
    • Điều kiện vận hành hệ thống Agilent 1260 Infinity II LC:
      • Đầu dò: DAD (Diode Array Detector)
      • Bước sóng phát hiện: 254 nm
      • Cột sắc ký (pha tĩnh): Poroshell C18
      • Pha động: 95% dung dịch đệm $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 25 mM : 5% Acetonitrile (ACN)
      • Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
      • Thể tích tiêm mẫu: 10 µL
      • Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng ($30 \pm 0,8^\circ\text{C}$)
      • Thời gian phân tích: 8 phút
    • Nồng độ Adenosine được tính dựa trên phương trình đường chuẩn xây dựng từ chất chuẩn Adenosine tinh khiết (Sigma-Aldrich) ở các nồng độ 10, 20, 30, 40 mg/L.
Thông số vận hành Giá trị thiết lập tối ưu trên HPLC
Thiết bị sắc ký Agilent 1260 Infinity II LC
Đầu dò quang phổ DAD
Cột phân tích Poroshell C18
Pha động 95% đệm $\text{KH}_2\text{PO}_4$ (25 mM) : 5% ACN
Tốc độ dòng pha động 0,8 mL/phút
Thể tích tiêm 10 µL
Bước sóng hấp thu cực đại 254 nm
Thời gian phân tích mỗi mẫu 8 phút
Nhiệt độ buồng cột $30 \pm 0,8^\circ\text{C}$
  1. Phương pháp xử lý thống kê: Dữ liệu được tổng hợp trên Microsoft Excel 2010 và phân tích phương sai 1 yếu tố (One-way ANOVA) bằng phần mềm Minitab 16. Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức được kiểm định bằng trắc nghiệm Tukey ở mức ý nghĩa $P < 0,05$ và $P < 0,01$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương 1 trình bày tổng quan về tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu nấm dược liệu Isaria japonica. Tác giả phân tích tiềm năng dược học của loài nấm này và sự cần thiết phải chuyển dịch từ phương thức nuôi trồng trên nhộng tằm tươi hoặc cơ chất bán rắn sang phương pháp lên men lỏng tĩnh. Trình bày mục tiêu tổng quát, 2 nội dung nghiên cứu thực nghiệm cụ thể và giới hạn phạm vi nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Vị trí phân loại, hình thái học thể quả và bào tử vô tính của nấm Isaria japonica.
  • Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học: Adenosine, Beauvericin, dẫn xuất Penostatin, Naturido, acid béo không bão hòa (chiếm 79%), các acid amin thiết yếu và polysaccharide ngoại bào (EPS).
  • Các phương thức nuôi cấy nhân tạo: nuôi cấy chìm ngập nước, nuôi cấy bề mặt lỏng tĩnh, nuôi cấy kết hợp lắc - tĩnh hai bước và nuôi cấy bán rắn.
  • Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm: nguồn carbon (sucrose, glucose, maltose), nguồn nitơ hữu cơ/vô cơ, tỷ lệ C/N, nhiệt độ tối ưu ($23–28^\circ\text{C}$), pH môi trường ($\approx 7,0$), độ ẩm ($70–90%$), chế độ chiếu sáng và độ sâu dung dịch nuôi cấy.
  • Tổng quan về cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng HPLC và nguyên lý trích ly bằng sóng siêu âm.
  • Đặc tính dinh dưỡng của các nguồn đạm tự nhiên: nhộng tằm (Bombyx mori), lòng đỏ trứng gà, bột đậu nành, cao chiết nấm men, cao chiết thịt bò.
  • Các nghiên cứu nuôi cấy Isaria của các tác giả trong nước (Phạm Quang Thu, Đỗ Thị Thiên Lý, Nguyễn Anh Thư, Đỗ Tiến Mạnh, Nguyễn Hoàng Sơn) và quốc tế (Ban et al., Bae et al., Supothina et al., Du et al., Yang et al.).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng giống, hóa chất, thiết bị và quy trình thực nghiệm:

  • Công thức phối chế chi tiết cho từng loại môi trường (PGA, môi trường lỏng tăng sinh, môi trường lỏng tĩnh).
  • Quy trình 3 bước phục hồi và thuần hóa nguồn giống gốc nấm.
  • Thiết kế bố trí 2 thí nghiệm đơn yếu tố (Thí nghiệm 1 khảo sát 5 loại đạm; Thí nghiệm 2 khảo sát 5 mức nồng độ cao chiết nấm men).
  • Chi tiết phương pháp xác định thời gian lan tơ, khối lượng sinh khối tươi/khô, hiệu suất sinh học (BE %).
  • Quy trình chiết xuất mẫu bằng sóng siêu âm và điều kiện vận hành định lượng Adenosine trên hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity II.
  • Các thuật toán và phần mềm thống kê ứng dụng (Minitab 16, One-way ANOVA, Tukey's test).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 công bố toàn bộ số liệu thu thập được từ thực nghiệm và đưa ra các thảo luận khoa học:

  1. Kết quả phục hồi giống: Sau 3 lần cấy chuyền trên PGA (thời gian ủ 26 ngày) và cấy tăng sinh trong môi trường lỏng (15 ngày), hệ sợi nấm I. japonica phát triển thuần khiết, sợi nấm màu trắng bông mịn, phát triển lan tỏa mạnh mẽ, đạt đường kính 5 cm sau 14 ngày trên đĩa thạch và lan kín mặt môi trường lỏng tăng sinh vào ngày thứ 12.

  2. Ảnh hưởng của các loại đạm tự nhiên (Thí nghiệm 1):

    • Thời gian lan tơ: Nghiệm thức cao chiết nấm men MT1 (NM) đạt $12,67 \pm 1,16$ ngày và bột đậu nành MT2 (DN) đạt $12,33 \pm 1,16$ ngày, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($P > 0,05$) so với đối chứng bột nhộng tằm ĐC ($11,67 \pm 0,58$ ngày). Lòng đỏ trứng gà MT4 (TG) có thời gian lan tơ kéo dài nhất ($22,33 \pm 0,58$ ngày, $P < 0,01$) do hàm lượng lipid và đạm quá cao gây ức chế hệ sợi ban đầu.
    • Hàm lượng Adenosine: Cả 4 loại đạm thay thế đều cho hàm lượng Adenosine cao hơn đối chứng bột nhộng tằm. Cao chiết nấm men đạt giá trị cao nhất ($1,79 \pm 0,01\text{ mg/g}$), cao gấp 1,79 lần so với đối chứng ĐC ($1,00 \pm 0,02\text{ mg/g}$).
    • Năng suất sinh khối: Môi trường cao chiết nấm men MT1 (NM) cho sinh khối vượt trội với khối lượng tươi $60,69 \pm 3,14\text{ g/lọ}$, khối lượng khô $5,03 \pm 0,09\text{ g/lọ}$, hiệu suất sinh khối tươi $46,30 \pm 1,53%$ và hiệu suất sinh khối khô $41,99 \pm 0,73%$, vượt trội rõ rệt so với đối chứng ĐC ($24,88\text{ g tươi/lọ}$; $3,79\text{ g khô/lọ}$; $P < 0,01$).
Nghiệm thức đạm (16,6 g/L) Thời gian lan tơ (ngày) Khối lượng tươi (g/lọ) HSSK tươi (%) Khối lượng khô (g/lọ) HSSK khô (%) Hàm lượng Adenosine (mg/g)
ĐC (Bột nhộng tằm) $11,67^{\text{a}} \pm 0,58$ $24,88^{\text{d}} \pm 0,36$ $15,36^{\text{d}} \pm 0,22$ $3,79^{\text{c}} \pm 0,07$ $31,68^{\text{c}} \pm 0,54$ $1,00^{\text{d}} \pm 0,02$
MT1 (Cao chiết nấm men) $12,67^{\text{a}} \pm 1,16$ $60,69^{\text{a}} \pm 3,14$ $46,30^{\text{a}} \pm 1,53$ $5,03^{\text{a}} \pm 0,09$ $41,99^{\text{a}} \pm 0,73$ $1,79^{\text{a}} \pm 0,01$
MT2 (Bột đậu nành) $12,33^{\text{a}} \pm 1,16$ $43,24^{\text{b}} \pm 0,20$ $26,70^{\text{b}} \pm 0,13$ $4,51^{\text{b}} \pm 0,16$ $37,67^{\text{b}} \pm 3,30$ $1,35^{\text{b}} \pm 0,13$
MT3 (Cao chiết thịt bò) $21,00^{\text{b}} \pm 1,00$ $35,68^{\text{c}} \pm 1,84$ $22,03^{\text{c}} \pm 1,14$ $4,27^{\text{b}} \pm 0,03$ $35,67^{\text{b}} \pm 0,26$ $1,32^{\text{b}} \pm 0,05$
MT4 (Lòng đỏ trứng gà) $22,33^{\text{b}} \pm 0,58$ $13,80^{\text{e}} \pm 0,10$ $8,32^{\text{e}} \pm 0,06$ $1,47^{\text{d}} \pm 0,06$ $12,27^{\text{d}} \pm 0,53$ $1,07^{\text{c}} \pm 0,03$
Giá trị P (P_value) < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

(Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái đi kèm khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,01).

  1. Ảnh hưởng của khối lượng cao chiết nấm men (Thí nghiệm 2):
    • Nghiệm thức MT1 (11,6 g/L) đạt kết quả tối ưu toàn diện: thời gian lan tơ nhanh ($13,33 \pm 1,16$ ngày, thực tế dao động 12–14 ngày), khối lượng tươi cao nhất ($65,61 \pm 1,27\text{ g/lọ}$), khối lượng khô đạt $5,24 \pm 0,22\text{ g/lọ}$, hiệu suất sinh khối khô đạt $46,63 \pm 1,96%$, và hàm lượng Adenosine đạt $1,63 \pm 0,01\text{ mg/g}$.
    • Khi tăng nồng độ cao chiết nấm men từ 11,6 g/L lên 31,6 g/L, thời gian lan tơ bị kéo dài (lên $17,67 \pm 0,58$ ngày ở MT5), sinh khối và hàm lượng Adenosine giảm dần đều (ở MT5 chỉ còn $3,87\text{ g khô/lọ}$ và $0,99\text{ mg Adenosine/g}$).
Nghiệm thức đạm NM (g/L) Thời gian lan tơ (ngày) Khối lượng tươi (g/lọ) HSSK tươi (%) Khối lượng khô (g/lọ) HSSK khô (%) Hàm lượng Adenosine (mg/g)
MT1 (11,6 g/L) $13,33^{\text{a}} \pm 1,16$ $65,61^{\text{a}} \pm 1,27$ $40,69^{\text{a}} \pm 0,79$ $5,24^{\text{a}} \pm 0,22$ $46,63^{\text{a}} \pm 1,96$ $1,63^{\text{a}} \pm 0,01$
MT2 (16,6 g/L - ĐC) $13,33^{\text{a}} \pm 1,53$ $64,23^{\text{a}} \pm 1,03$ $39,65^{\text{a}} \pm 0,64$ $5,11^{\text{a}} \pm 0,04$ $42,68^{\text{b}} \pm 0,31$ $1,62^{\text{a}} \pm 0,13$
MT3 (21,6 g/L) $15,00^{\text{b}} \pm 1,00$ $62,65^{\text{ab}} \pm 1,42$ $38,50^{\text{ab}} \pm 0,87$ $4,25^{\text{b}} \pm 0,06$ $33,44^{\text{c}} \pm 0,44$ $1,52^{\text{b}} \pm 0,04$
MT4 (26,6 g/L) $16,33^{\text{c}} \pm 0,58$ $59,62^{\text{bc}} \pm 0,77$ $36,47^{\text{bc}} \pm 0,46$ $4,00^{\text{bc}} \pm 0,15$ $29,67^{\text{d}} \pm 1,10$ $1,39^{\text{c}} \pm 0,12$
MT5 (31,6 g/L) $17,67^{\text{d}} \pm 0,58$ $53,94^{\text{c}} \pm 3,38$ $32,84^{\text{c}} \pm 2,06$ $3,87^{\text{c}} \pm 0,08$ $27,21^{\text{d}} \pm 0,63$ $0,99^{\text{d}} \pm 0,06$
Giá trị P (P_value) < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tổng kết các kết quả đạt được, đưa ra công thức môi trường chuẩn hóa tối ưu nhất cho nuôi cấy lỏng tĩnh thu nhận sinh khối giàu Adenosine của nấm Isaria japonica và đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo về Exopolysaccharide (EPS).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Xác định nguồn đạm thay thế tối ưu: Cao chiết nấm men là nguồn đạm thích hợp nhất trong 4 loại đạm tự nhiên khảo sát để thay thế hoàn toàn bột nhộng tằm. Ở nồng độ 16,6 g/L, cao chiết nấm men cho khối lượng khô ($5,03 \pm 0,09\text{ g/lọ}$) cao gấp 1,33 lần và hàm lượng Adenosine ($1,79 \pm 0,01\text{ mg/g}$) cao gấp 1,79 lần so với môi trường đối chứng bột nhộng tằm ($3,79\text{ g khô/lọ}$ và $1,00\text{ mg/g}$).
  2. Xác định nồng độ đạm và công thức môi trường tối ưu: Nồng độ cao chiết nấm men tối ưu được xác định là 11,6 g/L. Thành phần môi trường lỏng tĩnh hoàn chỉnh gồm:
    • Sucrose: 49,58 g/L
    • Cao chiết nấm men: 11,6 g/L
    • Peptone: 9,9 g/L
    • Tinh bột khoai tây: 4 g/L
    • $\text{KH}_2\text{PO}_4$: 1 g/L
    • $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$: 1 g/L
    • Vitamin $\text{B}_1$: 0,02 g/L
    • Điều kiện nuôi cấy: 150 mL dung dịch/lọ, ủ tối hoàn toàn ở $20 \pm 2^\circ\text{C}$ trong 30 ngày.
  3. Năng suất thu hoạch tại điều kiện tối ưu:
    • Thời gian lan kín tơ: 12 – 14 ngày.
    • Khối lượng sinh khối tươi: $65,61 \pm 1,27\text{ g/lọ}$ (Hiệu suất sinh khối tươi: $40,69 \pm 0,79%$).
    • Khối lượng sinh khối khô: $5,24 \pm 0,22\text{ g/lọ}$ (Hiệu suất sinh khối khô: $46,63 \pm 1,96%$).
    • Hàm lượng hoạt chất Adenosine: $1,63 \pm 0,01\text{ mg/g}$.

Đóng góp học thuật và thực tiễn

  • So với các nghiên cứu nuôi cấy bán rắn: Thời gian nuôi cấy trong nghiên cứu được rút ngắn xuống còn 30 ngày (so với 60–65 ngày trong nuôi cấy bán rắn của Pitiwittayakul et al., 2023 và Nguyễn Hoàng Sơn, 2019; hoặc 55 ngày trong nghiên cứu lỏng tĩnh của Nguyễn Anh Thư, 2019). Hàm lượng Adenosine đạt $1,63–1,79\text{ mg/g}$, cao gấp 1,81–1,98 lần so với hàm lượng Adenosine trong quả thể nuôi cấy bán rắn 65 ngày của Nguyễn Hoàng Sơn ($0,9\text{ mg/g}$) và cao gấp 2,14 lần so với sợi nấm C. takaomontana lên men bề mặt 45 ngày của Đỗ Tiến Mạnh và ctv ($0,76\text{ mg/g}$).
  • Về mặt công nghệ: Việc thay thế nhộng tằm bằng cao chiết nấm men tan hoàn toàn giúp khắc phục triệt để hiện tượng lắng cặn không tan ở đáy bình, loại bỏ nguy cơ dị ứng kitin và mùi tanh, giúp chuẩn hóa thành phần môi trường với độ lặp lại cao, tạo tiền đề thuận lợi cho việc ứng dụng sản xuất sinh khối sợi nấm Isaria japonica quy mô công nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Nghiên cứu chỉ mới thực hiện ở quy mô bình nuôi cấy phòng thí nghiệm (thể tích 150 mL/lọ) trong điều kiện lỏng tĩnh, chưa tiến hành đánh giá trên các hệ thống thiết bị lên men sinh học quy mô pilot lớn hơn.
  • Nghiên cứu chỉ tập trung phân tích chỉ tiêu hàm lượng Adenosine trong hệ sợi sinh khối, chưa mở rộng định lượng các hợp chất chuyển hóa giá trị khác như Beauvericin, Ergosterol peroxide hoặc các acid amin tự do.
  • Chưa tiến hành phân tích và thu hồi lượng polysaccharide ngoại bào (Exopolysaccharide - EPS) tiết ra trong phần dịch nuôi cấy lỏng sau khi tách lớp sinh khối sợi.

Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo đề nghị của tác giả)

  • Triển khai ứng dụng công thức môi trường lỏng tĩnh đã tối ưu vào sản xuất thử nghiệm sinh khối sợi nấm Isaria japonica ở quy mô lớn hơn.
  • Tiến hành khảo sát, tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của Exopolysaccharide (EPS) hòa tan trong dịch nuôi cấy sau thu hoạch để tận dụng toàn diện nguồn dược chất.

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho:

  • Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Vi sinh vật học, Công nghệ Dược phẩm và Nông nghiệp công nghệ cao đang thực hiện các đề tài về nuôi cấy nấm dược liệu, tối ưu hóa dinh dưỡng vi sinh vật và kỹ thuật chiết tách hoạt chất sinh học.
  • Nghiên cứu viên và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm: Tham khảo quy trình phục hồi giống nấm Isaria, phương pháp thiết kế thí nghiệm dinh dưỡng đạm, và đặc biệt là quy trình phân tích định lượng Adenosine bằng kỹ thuật HPLC với đầu dò DAD trên cột Poroshell C18.
  • Doanh nghiệp và cơ sở sản xuất nấm dược liệu: Ứng dụng trực tiếp công thức môi trường lỏng tĩnh không dùng nhộng tằm nhằm rút ngắn chu kỳ sản xuất sinh khối từ 60 ngày xuống 30 ngày, giảm giá thành nguyên liệu và phát triển các dòng sản phẩm nấm dược liệu phù hợp cho người ăn chay.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại chọn phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh thay vì nuôi trồng quả thể trên cơ chất bán rắn truyền thống?

Phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh tạo ra lớp sinh khối hệ sợi nấm nổi trên bề mặt dung dịch mà không cần đảo trộn cơ học. Phương pháp này rút ngắn thời gian nuôi cấy xuống chỉ còn 30 ngày (so với 60–65 ngày khi nuôi cấy bán rắn để thu quả thể), giảm chi phí kiểm soát điều kiện môi trường kéo dài, hạn chế rủi ro nhiễm tạp chất và dễ dàng mở rộng sang quy mô canh tác công nghiệp. Đồng thời, theo các nghiên cứu đối chiếu (Prommabana et al., 2021; Supothina et al., 2011), hàm lượng Adenosine trong hệ sợi nấm nuôi lỏng tĩnh thường cao hơn so với trong quả thể nuôi cấy bán rắn.

2. Vì sao cao chiết nấm men lại vượt trội hơn bột đậu nành, cao thịt bò và lòng đỏ trứng gà trong việc thay thế nhộng tằm?

Cao chiết nấm men là nguồn đạm hữu cơ hòa tan hoàn toàn trong nước, giàu vitamin nhóm B, khoáng chất và acid amin tự do, giúp hệ sợi nấm hấp thu nhanh chóng mà không bị lắng cặn xuống đáy bình như bột nhộng tằm. Trong khi đó, bột đậu nành là nguồn đạm thô khó hòa tan hoàn toàn; cao thịt bò có giá thành quá cao không kinh tế; còn lòng đỏ trứng gà chứa hàm lượng chất béo và đạm quá đậm đặc làm chậm quá trình bung tơ (thời gian lan kín mặt dịch lên tới hơn 22 ngày).

3. Tại sao khi tăng nồng độ cao chiết nấm men lên cao (21,6 – 31,6 g/L) thì năng suất sinh khối và hàm lượng Adenosine lại giảm?

Theo các nghiên cứu vi sinh vật học (Gao, 2000; Du et al., 2012), nhu cầu nitơ của hệ sợi nấm nhóm Đông trùng hạ thảo ở mức vừa phải. Khi hàm lượng đạm trong môi trường quá cao sẽ làm mất cân bằng tỷ lệ Carbon/Nitơ (C/N), gây ức chế sinh trưởng của hệ sợi nấm, kéo dài thời gian lan kín bề mặt môi trường (từ 13,33 ngày ở 11,6 g/L lên 17,67 ngày ở 31,6 g/L) và làm suy giảm hiệu suất tổng hợp các hợp chất chuyển hóa thứ cấp như Adenosine.

4. Tại sao tác giả chỉ định lượng Adenosine mà không phân tích Cordycepin trong nghiên cứu nấm Isaria japonica?

Dựa trên các nghiên cứu khoa học chuyên sâu trước đó (Prommabana et al., 2021; Zhang et al., 2019), hoạt chất Cordycepin chỉ xuất hiện chủ yếu ở một số loài như Cordyceps militaris hoặc Isaria cicadae, và hoàn toàn không được phát hiện trong hệ sợi hay quả thể của loài nấm Isaria japonica. Ngược lại, Adenosine là hoạt chất nucleoside đặc trưng, tích lũy với hàm lượng cao trong hệ sợi I. japonica, do đó tác giả chỉ lựa chọn Adenosine làm chỉ tiêu hóa sinh trọng tâm để đánh giá chất lượng dược liệu.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Thành Ngọc Phúc đã giải quyết thành công bài toán thay thế nguồn nguyên liệu bột nhộng tằm trong nuôi cấy nấm dược liệu Isaria japonica bằng phương pháp lỏng tĩnh 30 ngày trong tối ở 20 ± 2°C. Nghiên cứu đã xác định được cao chiết nấm men với nồng độ 11,6 g/L là nguồn đạm tối ưu nhất, kết hợp cùng sucrose 49,58 g/L, peptone 9,9 g/L, tinh bột khoai tây 4 g/L, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 1 g/L, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 1 g/L và vitamin $\text{B}_1$ 0,02 g/L. Công thức này cho năng suất sinh khối khô đạt $5,24 \pm 0,22\text{ g/lọ}$ (hiệu suất sinh học khô $46,63%$) và hàm lượng Adenosine đạt $1,63 \pm 0,01\text{ mg/g}$, vượt trội so với đối chứng bột nhộng tằm, mang lại giá trị ứng dụng thực tiễn cao cho quy trình sản xuất sinh khối nấm dược liệu công nghiệp.