Khóa luận: Đánh giá khả năng giải phóng kéo dài in vitro của vi cầu Leuprolid Acetat

Khóa luận nghiên cứu, đánh giá khả năng giải phóng kéo dài in vitro của vi cầu Leuprolid Acetat, trình bày phương pháp bào chế và kết quả thực nghiệm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Phương Liên
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Hải Yến
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Đánh Giá Khả Năng Giải Phóng Kéo Dài In Vitro Của Vi Cầu Leuprolid Acetat
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Leuprolid Acetat và ứng dụng lâm sàng

Leuprolid Acetat là một dược chất thuộc nhóm agonist GnRH (Gonadotropin Releasing Hormon), được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý liên quan đến hormon sinh dục. Công thức hóa học của leuprolid acetat cho phép nó có khả năng tương tác mạnh mẽ với các thụ thể GnRH trong cơ thể. Dược chất này được áp dụng trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt, u xơ tử cung, và các bệnh lý do hormon gây ra khác. Tuy nhiên, hạn chế chính của leuprolid acetat là thời gian bán thải ngắn, yêu cầu các liều dùng thường xuyên. Vì vậy, các dạng giải phóng kéo dài được phát triển để cải thiện tuân thủ điều trị và tăng hiệu quả lâm sàng của dược chất này.

1.1. Đặc tính dược động học của Leuprolid Acetat

Leuprolid acetat có khối lượng phân tử khoảng 1269 Da, là một peptid tổng hợp 9 axit amin. Dược chất này có thời gian bán thải rất ngắn (2-3 giờ) khi tiêm tĩnh mạch, nhưng khi tiêm bắp cơ, thời gian bán thải kéo dài đến 3 giờ. Độ sinh khả dụng toàn thân của leuprolid acetat chỉ đạt 5-10%, do đó cần phát triển các hệ thống giải phóng kéo dài để duy trì nồng độ dương tính và tăng hiệu quả điều trị, giảm tần suất tiêm.

1.2. Ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh lý

Leuprolid acetat được chỉ định trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn tiến triển, u xơ tử cung, chuyển hóa tuyến yên bất thường, và vô kinh sớm ở trẻ em. Các dạng giải phóng kéo dài như tiêm bắp cơ 1 tháng, 3 tháng, hoặc 6 tháng giúp duy trì nồng độ ổn định, nâng cao hiệu quả điều trị và tuân thủ. Dạng vi cầu PLGA là công nghệ tiên tiến cho phép kéo dài thời gian giải phóng từ 1-6 tháng tùy theo công thức bào chế.

II. Công nghệ vi cầu PLGA và cơ chế giải phóng dược chất

Vi cầu PLGA (Poly lactic-co-glycolic acid) là một hệ thống giải phóng kéo dài tiên tiến được sử dụng để nạp các dược chất peptid và protein như leuprolid acetat. PLGA là một polyme sinh phân hủy được FDA phê duyệt, có độ an toàn cao trong lâm sàng. Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA bao gồm khuếch tán ban đầu qua lớp ngoài, sau đó là phân hủy polymer tạo ra các rãnh vi mô, cho phép dược chất thoát ra từ từ. Hiệu suất nạp dược chất (EE%) và kích thước vi cầu là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng giải phóng kéo dài của hệ thống này.

2.1. Đặc tính hóa học và sinh học của PLGA

PLGA là copolymer được tổng hợp từ acid polylactic (PLA) và acid polyglycolic (PGA) với tỷ lệ khác nhau. Polyme PLGA có tính sinh phân hủy cao, phân hủy thành acid lactic và acid glycolic có thể được cơ thể chuyển hóa dễ dàng. Nhiệt độ chuyển thủy tinh (Tg) của PLGA ảnh hưởng đến độ cứng và khả năng giải phóng. Quá trình phân hủy hydrolyt của PLGA diễn ra trong 1-6 tháng tùy theo thành phần copolymer, làm vi cầu từ từ phân hủy và giải phóng dược chất.

2.2. Cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng đến giải phóng dược chất

Cơ chế giải phóng từ vi cầu PLGA diễn ra qua ba giai đoạn: (1) khuếch tán ban đầu của dược chất qua lớp polymer bên ngoài, (2) phân hủy polymer tạo ra các pore cho phép dược chất thoát ra, (3) phân hủy hoàn toàn của vi cầu. Độ xốp, hiệu suất nạp, kích thước vi cầu, và điều kiện bản ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ giải phóng và thời gian kéo dài của hệ thống.

III. Phương pháp nghiên cứu thử giải phóng in vitro

Thử giải phóng in vitro là phương pháp khoa học để đánh giá khả năng giải phóng kéo dài của vi cầu PLGA chứa leuprolid acetat. Phương pháp này sử dụng màng thẩm tích (dialysis membrane) để tách dược chất đã giải phóng khỏi vi cầu trong môi trường giải phóng mô phỏng điều kiện cơ thể. Định lượng leuprolid acetat được thực hiện bằng máy quang phổ huỳnh quang (fluorescence spectrophotometry) - phương pháp nhạy cảm cao và chính xác. Môi trường giải phóng thường là đệm salin phosphat (PBS) chứa Tween 80 0,02% để tăng độ hòa tan. Thử giải phóng điều kiện cấp tốc được thiết kế để tái tạo điều kiện in vivo, giúp dự đoán hiệu quả lâm sàng của dược phẩm.

3.1. Thiết kế thử giải phóng và lựa chọn điều kiện

Thử giải phóng in vitro được thiết kế với nhiệt độ 37°C ± 0,5°C để mô phỏng điều kiện cơ thể, pH 7,4 tương ứng với pH máu bình thường. Lựa chọn màng thẩm tích với giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) phù hợp đảm bảo chỉ dược chất đã giải phóng có thể đi qua. Thời điểm lấy mẫu được xác định dựa trên đặc tính dược động học của dược chất và dáng cong giải phóng mong đợi, thường từ 1 giờ đến 180 ngày.

3.2. Phương pháp định lượng bằng quang phổ huỳnh quang

Máy quang phổ huỳnh quang là công cụ chính xác cao để định lượng leuprolid acetat, dựa vào tính chất tự huỳnh quang của dược chất. Phương pháp thẩm định cần đảm bảo tính thích hợp hệ thống, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, và phạm vi đo lường. Tiêu chuẩn chất lượng theo Dược điển Châu Âu (EP) và FDA được áp dụng. Điều kiện đo: bước sóng kích thích 280 nm, bước sóng phát xạ 310 nm trong môi trường Tween 80 0,02%.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về vi cầu PLGA-LA đã chỉ ra rằng hiệu suất nạp dược chất (EE%), kích thước vi cầu, và độ xốp là những yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng giải phóng kéo dài. Các mẫu vi cầu đối chiếu cho thấy dáng cong giải phóng tuân theo cơ chế giải phóng hai giai đoạn: giai đoạn giải phóng ban đầu (burst release) trong 7 ngày đầu, tiếp theo là giai đoạn giải phóng ổn định kéo dài từ 7-180 ngày. Quá trình đông khô (lyophilization) ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc vi cầu và tốc độ giải phóng. Những kết quả nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển dạng thuốc giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat, hứa hẹn cải thiện hiệu quả điều trị và giảm tần suất tiêm cho bệnh nhân.

4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố bào chế trên khả năng giải phóng

Hiệu suất nạp dược chất (EE%) cao hơn dẫn đến giải phóng chậm hơn, vì dược chất được phân bố đều trong vi cầu. Kích thước vi cầu nhỏ hơn có diện tích bề mặt lớn hơn, gây giải phóng nhanh hơn. Độ xốp cao tạo con đường khuếch tán nhiều hơn, tăng tốc độ giải phóng. Quá trình đông khô cần được tối ưu hóa để bảo vệ cấu trúc vi cầu và duy trì khả năng giải phóng theo thiết kế lâm sàng.

4.2. Tiềm năng ứng dụng lâm sàng và phát triển dược phẩm

Vi cầu PLGA-LA có tiềm năng phát triển dạng thuốc giải phóng kéo dài 1-6 tháng cho leuprolid acetat, giảm tần suất tiêm từ hàng tuần xuống còn 1 lần mỗi tháng hoặc 6 tháng. Công nghệ này cải thiện tuân thủ điều trị, tăng hiệu quả lâm sàng, giảm tác dụng không mong muốn do biến động nồng độ. Nghiên cứu thêm về tối ưu hóa công thức, ổn định bảo quản, và thử nghiệm lâm sàng là cần thiết để đưa sản phẩm này vào sử dụng lâm sàng rộng rãi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Dạng thuốc tiêm vi cầu với chất mang polyme phân hủy sinh học như acid polylactic (PLA) và poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) đã được nghiên cứu và sử dụng thành công để điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Các chế phẩm này cung cấp một liều thuốc duy trì trong thời gian dài nhờ vào tốc độ phân hủy chậm của chất mang polyme. Mặc dù dạng bào chế có nhiều ưu điểm như tương thích sinh học, giảm tần suất sử dụng thuốc, tăng tuân thủ và thành công điều trị, việc đánh giá giải phóng dược chất lại là một khía cạnh đầy thách thức [44]. Thử giải phóng thuốc từ vi cầu ở điều kiện thực in vivo và in vitro có thể kéo dài hàng tuần đến hàng tháng, gây tốn thời gian, chi phí và nhân công, đặc biệt là thử nghiệm in vivo [7], [15], [40], [53].

Để xây dựng một hướng tiếp cận hiệu quả, nhanh chóng và tiết kiệm, nhiều nghiên cứu trên thế giới về thử nghiệm in vitro ở điều kiện cấp tốc cho vi cầu mang thuốc đã được thực hiện và đạt được kết quả như mong đợi [14], [41], [49]. Bằng cách điều chỉnh các thông số như nhiệt độ, pH, loại đệm,… để đẩy nhanh tốc độ phân hủy polyme, thử nghiệm in vitro ở điều kiện cấp tốc cung cấp thông tin về giải phóng thuốc trong khoảng thời gian ngắn hơn đáng kể so với điều kiện thực, thậm chí dự đoán được kết quả giải phóng thuốc ở điều kiện thực [14], [41]. Ở Việt Nam, hướng tiếp cận này khá mới mẻ, hứa hẹn nhiều nghiên cứu sâu hơn. Vì vậy, đề tài ‘’Nghiên cứu đánh giá khả năng giải phóng kéo dài in vitro của vi cầu leuprolid acetat’’ được thực hiện với các mục tiêu sau: 1.

Xây dựng được phương pháp đánh giá sự giải phóng dược chất in vitro của vi cầu leuprolid acetat - PLGA-LA ở điều kiện cấp tốc. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để đánh giá khả năng giải phóng kéo dài của vi cầu bào chế được. Đại cương về leuprolid acetat 1. Công thức hóa học Hình 1.

Công thức phân tử leuprolid acetat - Công thức phân tử: C59H84N16O12.C2H4O2 - Khối lượng phân tử: 1269,473 g/mol - Tên khoa học: 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D- leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamide acetate - Tên chung quốc tế: leuprolid acetat - Tên khác: leuprorelin acetat [43]. Tính chất vật lý - Cảm quan: bột màu trắng hoặc hơi vàng, dễ hút ẩm. - Độ tan: tan tốt trong nước và DMSO, tan tự do trong methanol và ít tan trong ethanol, khó tan trong ether và hexan. - Góc quay cực riêng: [α]20 D từ từ -38 đến -41° (dung dịch 1% kl/kl trong acid acetic của dược chất khan dạng base) [27].

Tính chất hóa học - Leuprolid acetat là muối của acid acetic và nonapeptid leuprolid có pKa lần lượt là 6,0 – 10,0 – 13,0. Dung dịch chứa 0,10 g muối leuprolid acetat trong 10 ml nước có pH nằm trong khoảng từ 5,5 đến 7,5. - Leuprolid acetat dễ dàng bị thủy phân trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh [27]. Độ ổn định Có 4 con đường chính gây phá hủy cấu trúc phân tử của leuprolid acetat như sau: thủy phân, oxy hóa, đồng phân hóa, tổng hợp.

Trong môi trường nước ở 37°C (pH = 5,0 – 5,6), tỷ lệ các sản phẩm phân hủy LA theo 4 con đường trên giảm dần theo thứ tự: thủy phân > tổng hợp > đồng phân hóa > oxy hóa, điều này không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ [22]. Tuy nhiên, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy của LA, nhiệt độ càng tăng LA càng kém ổn định [1], [22]. Trong nghiên cứu của Mehdi Rahimi và các cộng sự, LA được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 7,4 sau đó bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (-10°C, 4°C, 25°C, 37°C) trong thời gian 35 ngày, kết quả cho thấy LA ổn định nhất ở nhiệt độ 4°C. Nghiên cứu cũng đồng thời chỉ ra sự ảnh hưởng lớn của pH lên độ ổn định của LA: ở pH 2,0; 3,0; 4,0 có sự suy giảm nồng độ LA đáng kể và LA ổn định nhất ở pH 7,4 [45].

Ngoài nhiệt độ, pH, độ ổn định của LA còn bị ảnh hưởng bởi dung môi: LA ổn định trong DMSO hơn propylen hay nước trong cùng điều kiện [22], khí oxy hòa tan: oxy đẩy nhanh tốc độ phân hủy của LA [1], [22]. Một vài thông số dược động học Sau khi uống, leuprolid gần như bị bất hoạt hoàn toàn bởi các enzym đường ruột, sinh khả dụng đường uống rất thấp (<1%), do đó trong điều trị lâm sàng, thuốc được sử dụng qua đường tiêm bắp hoặc tiêm dưới da. Với liều 1 mg tiêm dưới da ở người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương nằm trong khoảng 32 – 35 µg/l sau tiêm 30 – 60 phút. Sinh khả dụng đạt 94% so với tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải khoảng 3,6 giờ và độ thanh thải của thuốc là 9,1 lít/giờ [43].

Dạng bào chế vi cầu PLGA chứa dược chất có tốc độ giải phóng LA gần như không đổi trong khoảng 1 tháng. Số liệu thử trên động vật cho thấy các vi cầu giải phóng dược chất với tốc độ không đổi là 2,8% liều ban đầu trong khoảng 1 tháng sau khi tiêm dưới da hoặc tiêm bắp. Sự giải phóng hàng loạt leuprolid nằm trên bề mặt vi cầu dẫn đến nồng độ thuốc trong máu đạt đỉnh là 13,1 và 47,4 µg/l sau 3 giờ tiêm dưới da một liều 3,75 mg và 7,5 mg. Sau đó, trong vòng 24 giờ đầu, nồng độ thuốc trong máu giảm rõ rệt và được duy trì trong khoảng từ 0,4 đến 0,6 µg/l nếu tiếp tục tiêm bắp hoặc tiêm dưới da lặp lại liều trên hàng tháng [43].

Ứng dụng trong điều trị 1. Tác dụng dược lý Leuprolid acetat là một chất có tác dụng tương tự chất chủ vận GnRH trong cơ thể. Tiêm thuốc liều duy nhất sẽ làm tăng nồng độ hormon tạo hoàng thể (LH) và hormon kích thích nang trứng (FSH) trong máu, làm cơ thể tăng tiết nhẹ các hormon sinh dục (estrogen và estradiol ở phụ nữ tiền mãn kinh hoặc testosteron và dihydrotestosteron ở nam). Tuy nhiên, khi được dùng liên tục với liều điều trị, leuprolid acetat ức chế mạnh sự giải phóng hormon gonadotropin, qua đó làm giảm nồng độ các hormon sinh dục trong cơ thể.

Vì vậy, LA được ứng dụng trong điều trị ung thư với tác dụng ức chế sự phát triển của một số khối u phụ thuộc hormon hoặc điều trị dậy thì sớm ở trẻ em [36]. Ứng dụng trong điều trị - Dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin - Ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn - Ung thư vú giai đoạn muộn của phụ nữ đang và sau mãn kinh - Bệnh lạc nội mạc tử cung, u cơ trơn tử cung [36]. Một số chế phẩm trên thị trường hiện nay Hiện nay, trên thị trường phổ biến các chế phẩm điều trị ung thư tuyến tiền liệt chứa dược chất leuprolid acetat và chất mang PLGA.1 trình bày một số hệ kiểm soát giải phóng của dược chất leuprolid acetat với tên thương mại, nhà sản xuất, đường dùng và khoảng thời gian kéo dài giải phóng của thuốc [44]. Một số dạng thuốc giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat Dạng bào chế và Thời gian kéo Tên thương mại Nhà sản xuất đường dùng dài giải phóng Lupron Depot® Takeda – Abbott Vi cầu tiêm bắp hoặc 1, 3 hoặc 4 tháng tiêm dưới da Prostap® Takeda Hệ cấy ghép sử dụng 1 hoặc 3 tháng đường tiêm Lupride Depot® Sun Pharma Vi cầu tiêm bắp 4 tuần Eligard® Sanofi – Aventis In-situ gel tiêm dưới da 1 tháng Luprogel® MediGene In-situ gel tiêm bắp 1 hoặc 3 tháng 4 1.

Tổng quan về polyme PLGA 1. Cấu trúc Poly (lactic-co-glycolic) là một trong những polyme phân hủy sinh học được sử dụng rộng rãi. PLGA là chất đồng trùng hợp, được polyme hóa từ hai monome là acid lactic và acid glycolic. Cấu trúc hóa học của PLGA a) acid lactic b) acid glycolic c) PLGA Trong cấu trúc của acid lactic có nguyên tử C bất đối.

Điều này hình thành lên cấu hình D và L của PLA, từ đó ảnh hưởng đến đặc tính vật lý của phân tử PLGA. Các PLGA khác nhau bởi tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ: PLGA 50:50 chứa 50% acid lactic và 50% acid glycolic [35]. Tính chất hóa lý PLGA tan trong nhiều dung môi khác nhau như dicloromethan, tetrahydrofuran, ethyl acetat, aceton [35]. Ở nhiệt độ sinh lý của cơ thể, PLGA tồn tại dưới dạng cấu trúc chuỗi khá cứng nhắc do có nhiệt độ chuyển thủy tinh (Tg) lớn hơn 37°C.

Điều này giúp polyme có đủ độ bền cơ học để thiết kế hệ đưa thuốc [26]. PLGA phân hủy bằng cách thủy phân liên kết este tạo ra acid lactic và acid glycolic. Vì PLA kỵ nước hơn PGA nên loại PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn sẽ ít thân nước hơn, thủy phân chậm hơn [35]. Ngược lại, polyme PLGA có khả năng hydrat hóa và thủy phân tốt hơn khi giảm mức độ kết tinh.

Polyme trên tồn tại dưới dạng tinh thể nếu chứa dưới 70% PGA hoặc được tạo thành từ L-PLA và PGA. Trong khi đó, loại PLGA tạo thành từ hỗn hợp đồng phân D,L của acid lactic là poly (D,L-lactic-co-glycolic) sẽ tồn tại dưới dạng vô định hình [26]. Quá trình phân hủy Quá trình phân hủy in vivo và in vitro của PLGA bị ảnh hưởng bởi một vài yếu tố như đặc tính của polyme (KLPT, cấu trúc hóa học, độ thân nước, sự kết tinh, Tg, …), thông số lý hóa (pH, nhiệt độ, lực ion của môi trường), cơ chế thủy phân …Quá trình phức tạp này được đề xuất với cơ chế gồm ba giai đoạn. Giai đoạn đầu có sự giảm đáng 5 kể KLPT polyme, nhưng không có sự mất khối lượng đáng kể nào cũng như sự tạo thành các sản phẩm monome tan được.

Theo sau là giai đoạn giảm nhanh KLPT polyme và sự hình thành các sản phẩm oligome và monome tan được. Cuối cùng, các monome tan được hình thành từ các mảng oligome tan, dẫn đến phân hủy hoàn toàn [35]. Một số ứng dụng PLGA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: hệ phân phối thuốc, kỹ thuật mô, thiết bị y tế và phẫu thuật [4], [9]. Trong đó, hệ phân phối thuốc là lĩnh vực thu hút sự quan tâm và đáng chú ý hơn cả.

Hiện nay, PLGA đã được FDA và EMA chấp nhận sử dụng trong các dạng thuốc khác nhau dùng trên người. Với khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào, PLGA là một trong những polyme được ứng dụng nhiều nhất trong thiết kế và phát triển các hệ kiểm soát giải phóng và vận chuyển thuốc hướng đích.