Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại Bình Phước (2014-2015)

• Tác giả: Nguyễn Thị Trà
• Người hướng dẫn: TS. Trương Văn Hạnh
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Độc vật học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại Bình Phước (2014-2015)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Bình Phước

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Tình hình ký sinh trùng sốt rét P. falciparum kháng thuốc trên thế giới và Việt Nam
• 1.2.1. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparum trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparum tại Việt Nam
• 1.3. Đặc điểm gen K13 của P. falciparum liên quan đến kháng artemisinin
• 1.4. Cơ sở khoa học chọn gen K13 là chỉ thị phân tử kháng artemisinin
• 1.5. Cấu trúc gen K13 của P. falciparum. Các nghiên cứu về đa hình đột biến gen K13 trên thế giới và Việt Nam
• 1.6. Các phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc
• 1.6.1. Phương pháp in vivo
• 1.6.2. Phương pháp in vitro
• 1.6.3. Phương pháp phân tử
• 1.6.4. Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Thời gian nghiên cứu
• 2.5. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6.2. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu
• 2.6.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.6.4. Thu thập mẫu
• 2.6.5. Tách chiết ADN bằng bộ sinh phẩm DNA micro test của hãng Qiagen
• 2.6.6. Kỹ thuật PCR xác định 4 loài ký sinh trùng sốt rét trên người
• 2.6.7. Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P. falciparum
• 2.6.8. Kỹ thuật giải trình tự ADN phát hiện đột biến gen K13
• 2.6.9. Xử lý số liệu nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả xác định các đột biến gen K13 của P. falciparum phân lập từ bệnh nhân sốt rét tại Bình Phước
• 3.2. Kết quả xác định loài ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR lồng
• 3.3. Kết quả xác định kiểu gen của P. falciparum bằng kỹ thuật PCR lồng
• 3.4. Kết quả phân tích đột biến gen K13 bằng kỹ thuật giải trình tự ADN
• 3.5. Đánh giá mối tương quan giữa đột biến gen K13 với kết quả theo dõi ký sinh trùng sốt rét trên bệnh nhân ngày D3
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến kháng artemisinin trên gen K13

Nghiên cứu về đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại Bình Phước trong giai đoạn 2014-2015 là một chủ đề quan trọng. Sốt rét vẫn là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất, đặc biệt là ở các khu vực có tỷ lệ mắc cao như Việt Nam. Việc xác định các đột biến gen K13 giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc của ký sinh trùng, từ đó có thể phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Tình hình sốt rét tại Việt Nam và Bình Phước

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ mắc sốt rét cao, đặc biệt là tại Bình Phước. Theo báo cáo của WHO, số ca mắc sốt rét tại Việt Nam đã giảm nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc kiểm soát bệnh. Tỉnh Bình Phước được ghi nhận là nơi có Plasmodium falciparum kháng artemisinin, điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho các nghiên cứu sâu hơn.

1.2. Đặc điểm của gen K13 và vai trò trong kháng thuốc

Gen K13 được xác định là gen quan trọng liên quan đến kháng artemisinin. Các đột biến tại gen này có thể ảnh hưởng đến khả năng sống sót của ký sinh trùng trong điều kiện điều trị bằng artemisinin. Nghiên cứu về gen K13 không chỉ giúp xác định các đột biến mà còn cung cấp thông tin cần thiết cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

II. Vấn đề kháng thuốc sốt rét và thách thức tại Bình Phước

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị sốt rét. Plasmodium falciparum đã phát triển khả năng kháng với nhiều loại thuốc, đặc biệt là artemisinin. Tình hình kháng thuốc tại Bình Phước đang trở nên nghiêm trọng, đòi hỏi các biện pháp can thiệp kịp thời.

2.1. Tình hình kháng artemisinin tại Bình Phước

Tại Bình Phước, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ kháng artemisinin của Plasmodium falciparum đang gia tăng. Việc phát hiện sớm các đột biến gen K13 là rất quan trọng để có thể điều chỉnh các phác đồ điều trị phù hợp.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thuốc

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển kháng thuốc, bao gồm điều kiện môi trường, thói quen sử dụng thuốc và sự di chuyển của người dân. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp xây dựng các chiến lược phòng chống hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến gen K13 tại Bình Phước

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để xác định các đột biến trên gen K13 của Plasmodium falciparum. Các kỹ thuật như giải trình tự gen và PCR được áp dụng để phân tích mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân sốt rét tại Bình Phước.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen là phương pháp chính được sử dụng để xác định các đột biến tại gen K13. Kỹ thuật này cho phép phát hiện chính xác các biến thể gen, từ đó đánh giá khả năng kháng thuốc của ký sinh trùng.

3.2. Phân tích mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các bệnh nhân mắc sốt rét tại Bình Phước. Việc phân tích mẫu giúp xác định tỷ lệ nhiễm và các đột biến gen K13, từ đó đưa ra các kết luận về tình hình kháng thuốc tại địa phương.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến gen K13 ở bệnh nhân sốt rét tại Bình Phước là đáng kể. Những phát hiện này có thể được ứng dụng trong việc giám sát và điều chỉnh các phác đồ điều trị sốt rét tại địa phương.

4.1. Tỷ lệ đột biến gen K13

Nghiên cứu đã xác định được nhiều vị trí đột biến trên gen K13, cho thấy sự gia tăng khả năng kháng artemisinin của Plasmodium falciparum. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải theo dõi thường xuyên tình hình kháng thuốc.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để cải thiện các phác đồ điều trị sốt rét tại Bình Phước. Việc áp dụng các biện pháp can thiệp kịp thời sẽ giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của Plasmodium falciparum tại Bình Phước đã cung cấp những thông tin quý giá. Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và giám sát sự kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét. Việc hiểu rõ các đột biến gen sẽ giúp cải thiện hiệu quả điều trị.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn. Đồng thời, việc giám sát tình hình kháng thuốc cần được thực hiện thường xuyên để đảm bảo sức khỏe cộng đồng.

## Tổng quan nghiên cứu

Sốt rét là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, ảnh hưởng đến khoảng 3,3 tỷ người trên toàn cầu, trong đó có khoảng 1,2 tỷ người có nguy cơ mắc sốt rét cao. Tại Việt Nam, năm 2014 ghi nhận 27.868 trường hợp mắc sốt rét với 6 ca tử vong, chủ yếu tập trung ở các vùng biên giới miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Plasmodium falciparum là loài ký sinh trùng sốt rét phổ biến và gây tử vong cao nhất. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng P. falciparum kháng thuốc, đặc biệt là kháng artemisinin - thuốc điều trị chủ lực hiện nay, đã làm gia tăng thách thức trong công tác phòng chống sốt rét.

Nghiên cứu nhằm xác định các đột biến gen K13 liên quan đến kháng artemisinin của P. falciparum tại vùng sốt rét lưu hành nặng tỉnh Bình Phước trong giai đoạn 2014-2015. Mục tiêu cụ thể là xác định vị trí và tần suất các đột biến điểm trên gen K13, đồng thời đánh giá mối tương quan giữa đột biến gen K13 với tỷ lệ ký sinh trùng dương tính kéo dài trên bệnh nhân ngày thứ 3 sau điều trị. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc giám sát và kiểm soát sự lan rộng của ký sinh trùng kháng thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và chính sách phòng chống sốt rét quốc gia.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Lý thuyết về kháng thuốc sốt rét:** Kháng thuốc của P. falciparum là nguyên nhân chính làm giảm hiệu quả điều trị sốt rét, đặc biệt với các thuốc như chloroquine, sulfadoxin-pyrimethamin và artemisinin. Kháng thuốc được xác định qua các phương pháp in vivo, in vitro và phân tử.
- **Mô hình gen K13 và kháng artemisinin:** Gen K13 (PF3D7_1343700) mã hóa protein Kelch 13 propeller domain, có vai trò quan trọng trong cơ chế kháng artemisinin. Các đột biến điểm trên gen này liên quan chặt chẽ đến khả năng sống sót của ký sinh trùng dưới áp lực thuốc.
- **Khái niệm chính:**
  - Đột biến gen K13: Các biến đổi nucleotide đơn (SNPs) trên gen K13 liên quan đến kháng thuốc.
  - Tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ngày D3: Chỉ số đánh giá hiệu quả điều trị và dấu hiệu kháng thuốc.
  - Phương pháp PCR lồng và giải trình tự gen Sanger: Kỹ thuật phân tử để phát hiện và xác định đột biến gen.
  - Kiểu gen msp2: Đa hình gen dùng để phân loại các dòng gen P. falciparum.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu:** Mẫu máu của 65 bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn P. falciparum tại 3 xã thuộc tỉnh Bình Phước, thu thập trong năm 2014-2015.
- **Phương pháp chọn mẫu:** Chọn có chủ đích hai nhóm mẫu ngày D0 (trước điều trị) và ngày D3 (72 giờ sau điều trị), loại trừ các mẫu nhiễm phối hợp nhiều loài ký sinh trùng.
- **Phương pháp phân tích:**
  - Xác định loài ký sinh trùng bằng kỹ thuật PCR lồng.
  - Phân tích kiểu gen P. falciparum dựa trên locus msp2 bằng PCR lồng.
  - Nhân bản và giải trình tự gen K13 bằng kỹ thuật PCR lồng và phương pháp Sanger.
  - Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Bioedit và thống kê EPI-INFO.
- **Timeline nghiên cứu:** Tiến hành từ năm 2014 đến 2015, bao gồm thu thập mẫu, phân tích phòng thí nghiệm và xử lý số liệu.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- Tất cả 65 mẫu (100%) được xác định nhiễm đơn P. falciparum bằng kỹ thuật PCR lồng.
- Phân tích kiểu gen msp2 cho thấy 76,92% mẫu nhiễm đơn kiểu gen (IC hoặc FC), 23,08% mẫu nhiễm phối hợp hai kiểu gen, với tỷ lệ nhiễm phối hợp ngày D0 cao hơn ngày D3 (32,36% so với 11,90%, p<0,001).
- Đoạn gen K13 được nhân bản thành công với kích thước 849 bp ở tất cả các mẫu.
- Giải trình tự gen K13 cho thấy trình tự nucleotit có độ đồng nhất 100% với chủng chuẩn 3D7.
- Phân tích đột biến gen K13 phát hiện các vị trí đột biến liên quan đến kháng artemisinin như 493H, 539T, 543T và 580Y với tần suất khác nhau.
- Tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ngày D3 có mối tương quan chặt chẽ với sự hiện diện các đột biến gen K13, cho thấy đột biến gen là dấu hiệu phân tử quan trọng của kháng thuốc.

### Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định sự hiện diện của các đột biến gen K13 liên quan đến kháng artemisinin tại vùng sốt rét lưu hành nặng tỉnh Bình Phước, phù hợp với các báo cáo tại khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông. Tỷ lệ nhiễm phối hợp kiểu gen giảm sau điều trị phản ánh hiệu quả của phác đồ điều trị phối hợp DHA-PPQ, tuy nhiên sự gia tăng tỷ lệ dương tính ký sinh trùng ngày D3 cảnh báo nguy cơ kháng thuốc đang gia tăng. So sánh với các nghiên cứu tại Cam-pu-chia, Thái Lan và Mi-an-ma, các đột biến gen K13 được xác định có vai trò quyết định trong cơ chế kháng thuốc, đồng thời là công cụ giám sát hiệu quả. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tần suất đột biến gen và bảng so sánh tỷ lệ dương tính ký sinh trùng ngày D3 giữa các nhóm mẫu.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Tăng cường giám sát phân tử:** Thực hiện thường xuyên phân tích đột biến gen K13 tại các vùng sốt rét lưu hành để phát hiện sớm sự lan rộng của ký sinh trùng kháng thuốc, mục tiêu giảm tỷ lệ dương tính ngày D3 dưới 10% trong vòng 2 năm, do Viện Sốt rét-KST-CTTƯ chủ trì.
- **Cập nhật chính sách điều trị:** Xem xét điều chỉnh phác đồ điều trị khi tỷ lệ thất bại điều trị vượt quá 10%, ưu tiên sử dụng thuốc phối hợp mới có hiệu quả cao, thực hiện trong vòng 1 năm.
- **Nâng cao năng lực phòng thí nghiệm:** Đầu tư trang thiết bị và đào tạo kỹ thuật PCR, giải trình tự gen cho các trung tâm y tế tuyến tỉnh, đảm bảo phân tích mẫu nhanh và chính xác.
- **Tuyên truyền và giáo dục cộng đồng:** Nâng cao nhận thức về phòng chống sốt rét và tuân thủ điều trị, giảm nguy cơ tái nhiễm và phát triển kháng thuốc, triển khai liên tục tại các vùng nguy cơ cao.
- **Hợp tác quốc tế:** Tham gia các mạng lưới giám sát kháng thuốc khu vực để chia sẻ dữ liệu và phối hợp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Nhà nghiên cứu và học giả:** Cung cấp dữ liệu khoa học về cơ chế kháng thuốc sốt rét, hỗ trợ phát triển các nghiên cứu tiếp theo về gen K13 và kháng artemisinin.
- **Cán bộ y tế và quản lý chương trình sốt rét:** Là tài liệu tham khảo để xây dựng chính sách điều trị, giám sát và kiểm soát sốt rét hiệu quả tại các vùng lưu hành.
- **Sinh viên và học viên cao học ngành Sinh học, Y học nhiệt đới:** Học tập phương pháp nghiên cứu phân tử, kỹ thuật PCR và giải trình tự gen trong nghiên cứu dịch tễ học.
- **Các tổ chức quốc tế và cơ quan y tế công cộng:** Hỗ trợ đánh giá tình hình kháng thuốc sốt rét, lập kế hoạch can thiệp và hỗ trợ kỹ thuật tại Việt Nam và khu vực.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Gen K13 có vai trò gì trong kháng artemisinin?**  
   Gen K13 mã hóa protein Kelch 13 propeller domain, các đột biến điểm trên gen này liên quan trực tiếp đến khả năng kháng artemisinin của P. falciparum, ảnh hưởng đến thời gian làm sạch ký sinh trùng sau điều trị.

2. **Tại sao tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ngày D3 quan trọng?**  
   Tỷ lệ này phản ánh hiệu quả điều trị và là dấu hiệu cảnh báo sự xuất hiện của ký sinh trùng kháng thuốc, khi vượt quá 10% cần xem xét thay đổi phác đồ điều trị.

3. **Phương pháp PCR lồng và giải trình tự gen Sanger được sử dụng như thế nào?**  
   PCR lồng giúp nhân bản chính xác đoạn gen mục tiêu, sau đó giải trình tự Sanger xác định trình tự nucleotide để phát hiện các đột biến gen liên quan đến kháng thuốc.

4. **Tại sao cần giám sát đột biến gen K13 thường xuyên?**  
   Giám sát giúp phát hiện sớm sự lan rộng của các chủng ký sinh trùng kháng thuốc, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời, tránh thất bại điều trị và bùng phát dịch.

5. **Các đột biến gen K13 phổ biến nhất là gì?**  
   Các vị trí đột biến 493H, 539T, 543T và 580Y được xác định là có liên quan kháng artemisinin và lưu hành phổ biến tại khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông.

## Kết luận

- Xác định thành công các đột biến gen K13 liên quan đến kháng artemisinin trên P. falciparum tại tỉnh Bình Phước năm 2014-2015.  
- Tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ngày D3 có mối tương quan chặt chẽ với sự hiện diện đột biến gen K13.  
- Kỹ thuật PCR lồng và giải trình tự gen Sanger là công cụ hiệu quả trong giám sát kháng thuốc sốt rét.  
- Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế kháng thuốc và hỗ trợ xây dựng chính sách điều trị phù hợp.  
- Đề xuất tăng cường giám sát phân tử, cập nhật phác đồ điều trị và nâng cao năng lực phòng thí nghiệm trong vòng 1-2 năm tới để kiểm soát hiệu quả kháng thuốc.

**Hành động tiếp theo:** Khuyến khích các cơ quan y tế và nghiên cứu tiếp tục triển khai giám sát gen K13 rộng rãi, đồng thời phát triển các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc và các biện pháp can thiệp hiệu quả.