Luận văn ThS. Võ Thị Phương: Sàng lọc đột biến gen ND6, MT-TK gây bệnh ty thể

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen nd6 và mt tk liên quan đến bệnh ty thể, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Võ Thị Phương
• Người hướng dẫn: Pgs. Nguyễn Thị Hồng Vân
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Cấu trúc và chức năng ty thể trong nghiên cứu đột biến gen

Ty thể là những cơ quan tế bào có vai trò vô cùng quan trọng trong việc sản xuất năng lượng cho các tế bào sống. Mỗi ty thể chứa một bộ gen riêng biệt được gọi là DNA ty thể (mtDNA), khác hoàn toàn với DNA nhân. Nghiên cứu về đột biến gen ND6 và MT-TK đã mở ra những hiểu biết sâu sắc về cơ chế di truyền và các bệnh liên quan. Ty thể có cấu trúc đặc biệt với màng ngoài và màng trong, tạo ra những "nhà máy" năng lượng của tế bào. Những đột biến điểm gen trên DNA ty thể có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người, đặc biệt là các bệnh ty thể di truyền.

1.1. Cấu trúc của ty thể và DNA ty thể

Ty thể sở hữu cấu trúc đặc biệt với hai lớp màng phospholipid. Bên trong chứa DNA ty thể (mtDNA) hình tròn, không có histone bảo vệ như DNA nhân. mtDNA mã hóa 37 gen bao gồm 13 gen protein, 22 gen tRNA và 2 gen rRNA. Gen ND6 mã hóa protein NADH dehydrogenase subunit 6, còn gen MT-TK mã hóa tRNA lysine. Những gen này đóng vai trò thiết yếu trong chuỗi thở và sản xuất ATP.

1.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của DNA ty thể

DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ, nghĩa là con em chỉ nhận DNA ty thể từ mẹ. Đặc điểm này tạo nên mô hình di truyền độc đáo trong nghiên cứu bệnh ty thể. Một tế bào có thể chứa hàng ngàn ty thể với nhiều bản sao mtDNA. Hiện tượng heteroplasmy xảy ra khi một tế bào chứa cả allele bình thường và đột biến, gây ảnh hưởng không đồng nhất tới các mô khác nhau.

II. Các đột biến điểm gen ND6 và MT TK liên quan đến bệnh ty thể

Đột biến gen ND6 và đột biến MT-TK là những thay đổi nucleotide nhất định trên DNA ty thể gây ra các bệnh di truyền nguy hiểm. Trong nghiên cứu của Võ Thị Phương tại Đại học Quốc gia Hà Nội, các đột biến điểm được xác định bao gồm T14484C trên gen ND6 và A8344G, T8356C, G8363A trên gen MT-TK. Đột biến T14484C liên quan đến hội chứng LHON (Leber's hereditary optic neuropathy) gây mù hoàn toàn. Đột biến A8344G trên MT-TK gây ra hội chứng MERRF với triệu chứng động kinh, suy giảm cơ và các sợi cơ đỏ rải rác. Sàng lọc các đột biến này rất quan trọng cho chẩn đoán sớm và can thiệp y tế kịp thời.

2.1. Đột biến T14484C trên gen ND6 gây hội chứng LHON

Đột biến T14484C ở vị trí 14484 của gen ND6 là nguyên nhân chính gây ra hội chứng LHON (Leber hereditary optic neuropathy). Bệnh này khiến bệnh nhân bị mất thị lực đột ngột, thường xảy ra ở tuổi thanh niên. Đột biến làm ảnh hưởng đến hoạt động của phức hợp I trong chuỗi thở ty thể, dẫn đến thiếu năng lượng ở tế bào thần kinh quang học. Những bệnh nhân mang đột biến này cần được sàng lọc sớm để có kế hoạch chăm sóc phù hợp.

2.2. Đột biến A8344G trên gen MT TK gây hội chứng MERRF

Đột biến A8344G nằm trên gen MT-TK mã hóa tRNA lysine, gây ra hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers). Bệnh nhân biểu hiện động kinh co giật, mất cân bằng, yếu cơ và các sợi cơ đỏ rải rác dưới kính hiển vi. Đột biến làm suy giảm khả năng tổng hợp protein trong ty thể, ảnh hưởng chủ yếu đến các mô có nhu cầu năng lượng cao như cơ và thần kinh. Sàng lọc đột biến A8344G giúp phát hiện bệnh sớm.

III. Phương pháp tạo đột biến điểm định hướng và sàng lọc

Để nghiên cứu các đột biến gen ND6 và MT-TK, các nhà khoa học sử dụng phương pháp tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các mẫu tiêu bản chứa những đột biến cần nghiên cứu. Kỹ thuật chính bao gồm phương pháp Kunkel, sử dụng PCR truyền thống và PCR đảo (Inverse PCR). Các mồi tạo đột biến được thiết kế chứa vị trí đột biến cần tạo ra. Sau đó, sản phẩm được đóng vòng bằng T4-ligase và biến nạp vào tế bào E. coli khả biến. Phương pháp này cho phép tạo chính xác các đột biến điểm mà không thay đổi cấu trúc gen khác, tạo điều kiện thuận lợi cho sàng lọc và phát hiện các đột biến trong bệnh nhân.

3.1. Kỹ thuật PCR và thiết kế mồi tạo đột biến

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là nền tảng cho việc tạo đột biến điểm và nhân bản gen ty thể. Để tạo các đột biến ND6 và MT-TK, các mồi được thiết kế sao cho chứa chính xác vị trí đột biến mong muốn như T14484C, A8344G, T8356C, G8363A. PCR plasmid sử dụng những mồi này amplify toàn bộ plasmid chứa gen cần đột biến. Sự chính xác của mồi là yếu tố quyết định thành công của phương pháp này.

3.2. Biến nạp plasmid và sàng lọc khuẩn lạc mang đột biến

Plasmid chứa đột biến được đóng vòng bằng T4-ligase tạo thành vòng khép kín. Sau đó, được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt. Các khuẩn lạc được nuôi cấy và sàng lọc bằng PCR-RFLP để kiểm tra sự có mặt của đột biến mong muốn. Khuẩn lạc mang đột biến được tách chiết plasmid để sử dụng làm đối chứng dương trong các phản ứng sàng lọc bệnh nhân.

IV. Phương pháp phát hiện đột biến và ứng dụng lâm sàng

Để sàng lọc và phát hiện các đột biến gen ND6 và MT-TK ở bệnh nhân, các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp phân tích hiệu quả. Phương pháp PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là kỹ thuật đơn giản, dựa trên việc sử dụng enzyme cắt giới hạn để phát hiện các đột biến điểm. Phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) phát hiện các thay đổi trong hình dạng của sợi đơn ADN do đột biến gây ra. Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp chính xác nhất, xác định chính xác vị trí và loại đột biến. Những phương pháp này cho phép sàng lọc các đột biến bệnh ty thể trên 128 mẫu bệnh phẩm, giúp bác sĩ chẩn đoán và can thiệp sớm cho bệnh nhân.

4.1. Phương pháp PCR RFLP phát hiện đột biến ty thể

Phương pháp PCR-RFLP kết hợp PCR và enzyme cắt giới hạn để phát hiện đột biến trên gen ND6 và MT-TK. Đầu tiên, gen ty thể cần kiểm tra được nhân bản bằng PCR tạo ra các đoạn ADN dài 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 nucleotide. Sau đó, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme cắt giới hạn đặc hiệu. Các đột biến điểm thay đổi vị trí cắt của enzyme, tạo ra mô hình cắt khác nhau có thể điện di trên gel để phát hiện.

4.2. Giải trình tự gen và ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Giải trình tự gen (DNA sequencing) xác định chính xác trình tự nucleotide của gen ND6 và MT-TK từ bệnh nhân. Phương pháp này cho phép phát hiện tất cả các đột biến bất kỳ, không chỉ những đột biến được biết trước. Kết quả giải trình tự so sánh với gen tham chiếu bình thường để xác định đột biến. Ứng dụng lâm sàng của phương pháp này rất lớn, giúp xác định chính xác bệnh ty thể, hướng dẫn điều trị và tư vấn di truyền cho gia đình.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP. Ngoài ra, ty thể còn có vai trò trong quá trình tạo hemoglobin, tổng hợp các purine và pyrimidine, viên gạch cấu trúc giúp xây dựng ADN và ARN, tham gia vào quá trình chết theo lập trình (Apoptosis - Programmed cell death) của tế bào và nhiều quá trình trao đổi chất khác. Để thực hiện hết được các vai trò của mình và đảm bảo về nhu cầu năng lượng nhằm duy trì sự sống và hỗ trợ sự tăng trưởng, ty thể phải thực hiện các quá trình trao đổi chất với tần suất cao.

Các phản ứng trao đổi chất này giải phóng nhiều sản phẩm có tính ứng ôxy hóa, đồng thời với sự tác động thêm của một số yếu tố khác là nguyên nhân gây ra sự tổn thương cho ty thể, đặc biệt là ADN ty thể. Các đột biến trong hệ gen ty thể là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là bệnh cơ não ở người, các bệnh này có thể là nguyên nhân kéo theo nhiều bệnh khác nghiêm trọng hơn, ảnh hưởng rất nhiều tới đời sống con người. Trong số các gen ty thể, gen MT-TK và ND6 được quan tâm nghiên cứu bởi sự đột biến gen MT-TK được khẳng định liên quan đến nhiều bệnh ty thể khác nhau, với các hội chứng bao gồm tiểu đường và điếc di truyền theo dòng mẹ (mateARNlly inherited diabetes and deafness – MIDD), hội chứng động kinh giật cơ với các sợi cơ đỏ rách nham nhở (myoclonic epilepsy with ragged-red fibers – MERRF), hội chứng não giật cơ, tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes -MELAS). Còn gen ND6 được coi là “điểm nóng” đột biến của hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy).

Các đột biến trên hai gen này phần lớn là các đột biến điểm thay thế đồng hoán hay dị hoán. Các đột biến thay thế nucleotit có thể được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật phân tích ADN khác nhau, trong đó RFLP-PCR là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp, giúp sàng lọc nhanh đột biến ở các mẫu bệnh phẩm mà không cần quá nhiều thiết bị phức tạp. Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng RFLP-PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến là cần thiết được tạo ra. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo 1 đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh ty thể” nhằm tạo ra một số đối chứng dương mang đột biến cần xác định cho các phản ứng sàng lọc các đột biến trên gen ND6 và trên gen MT-TK.

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học – Khoa Sinh học và phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN. 2 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ngƣời 1. Cấu trúc của ty thể Cơ thể con người là một thể thống nhất, bao gồm rất nhiều cơ quan, hệ cơ quan khác nhau.

Mỗi cơ quan đảm nhận một nhiệm vụ riêng, nhưng tất cả đều được cấu tạo bằng các tế bào, nên tế bào được coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Ty thểlàmột trong những bào quan có mặt trong tất cả các tế bào nhân thực. Vai trò chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào. Ty thể bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX.

Năm 1857, nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kolliker lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào cơ. Năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương pháp nhuộm fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi quang học[13]. Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng và kích thước khác nhau.

Ty thể có khả năng thay đổi kích thước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào [13]. Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng. Số lượng của ty thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào đó, có thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ [13].

Cấu trúc của ty thể [61] Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, tương tự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền tạo thành các mào răng lược [8; 19]. Màng ngoài ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và lipid chiếm khoảng 40%.

Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các chất với khối lượng phân tử lớn đến 10 kDa và các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngược lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [8]. Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lượng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol và phospholipid là 1/53.

Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na +, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử 4 (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotit translocase (ANT)[8; 19].

Cấu trúc màng trong của ty thể [33] Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H + từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện tử cơ động cho chuỗi hô hấp. Sự giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis). Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể.

Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể [8; 19]. Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi tạo ra hai ty thể mới. Trước tiên, hệ gen ty thể được sao chép để tăng số lượng bản sao. Sau đó, màng trong thắt lại rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra.

Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [13]. Chức năng của ty thể Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng cho tế bào bằng cách oxy hóa các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng toàn bộ năng lượng dưới dạng ATP 5 (hình 1. Các phản ứng này được xúc tác bởi các phức hợp của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở màng trong của ty thể [17; 23].

Nguồn tạo ra năng lượng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein được lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất này được oxy hóa để tạo ra các chất khử giàu năng lượng, sau đó các đương lượng khử được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng liên kết phosphate cao năng trong ATP thông qua con đường hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [62] ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào [18; 33].

Do đó, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh ra năng lượng để cung cấp cho tế bào và cơ thể bị chậm lại, thậm chí bị ngừng lại hoàn toàn. Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó sự tổn thương của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và cơ quan. Triệu chứng của bệnh ty thể không giống nhau, bởi vì người bệnh có thể có một hỗn hợp ty thể bình thường lẫn ty thể đột biến với sự phân bố riêng trong cơ thể. Đôi khi, số ty thể bình thường đủ để bù đắp cho những ty thể bị đột biến [19].

Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể 1. Hệ gen ty thể Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. Hệ gen của ty thể người được Clayton mô tả lần đầu tiên vào năm 1976. Đến năm 1981, Anderson đã công bố trình tự và cấu trúc của hệ gen ty thể người [5; 8].

ADN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đôi, có kích thước 16.569 bp, bao gồm 37 gen (bảng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rARN, 22 phân tử tARN và 13 phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp.