BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN BRCA1, PALB2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

Nghiên cứu đột biến điểm gen BRCA1, PALB2 ở bệnh nhân ung thư vú. Báo cáo khảo sát tính chất đột biến, mối liên hệ với bệnh ung thư vú, và ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị.

• Tác giả: Trịnh Ngọc Châu
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Bước Đầu Khảo Sát Tính Chất Đột Biến Điểm Trên Gen BRCA1, PALB2 Trên Bệnh Nhân Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• I. PHẦN I: ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ
• I.1. Khái niệm về ung thư
• I.2. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư
• I.3. Phân loại ung thư
• I.4. Phân loại ung thư vú
• I.5. Các giai đoạn phát triển của ung thư vú
• I.6. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ trên thế giới
• I.7. Tình hình ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam
• I.8. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú
• I.9. Gen p53 (Protein 53)
• I.10. Gen HER2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor)
• I.11. Epigenetics
• I.12. Sự methyl hóa DNA
• I.13. Đột biến điểm
• II. PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• II.1. Phương pháp xác định tính chất đột điểm và tính chất methyl hóa
• II.1.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
• II.1.2. Phương pháp PCR giải trình tự
• II.2. Vật liệu và phương pháp
• II.2.1. Các công cụ tin sinh học
• II.2.2. Xử lý thống kê
• II.2.3. Phương pháp
• II.2.4. Khai thác dữ liệu
• II.2.5. Khảo sát in silico
• II.2.6. Khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến
• III. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico về tính chất đột biến trên gen BRCA1
• III.1.1. Khai thác dữ liệu
• III.1.2. Khảo sát in silico
• III.2. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico về tính chất đột biến trên gen PALB2
• III.2.1. Khai thác dữ liệu
• III.2.2. Khảo sát in silico
• III.3. Kết quả khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen BRCA1
• III.3.1. Tách chiết DNA
• III.3.2. Kết quả phản ứng PCR và điện di
• III.3.3. Phân tích kết quả giải trình tự gen BRCA1 với cặp mồi BRCA1_11F7 và BRCA1_11R7
• III.4. Kết quả khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen PALB2
• III.4.1. Tách chiết DNA
• III.4.2. Kết quả phản ứng PCR và điện di
• III.4.3. Phân tích kết quả giải trình tự
• IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đột Biến Gen BRCA1 PALB2 Ung Thư Vú

Ung thư vú là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, đặc biệt là ở phụ nữ. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới. Nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và BRCA2 đã làm sáng tỏ một số yếu tố di truyền liên quan đến nguy cơ phát triển ung thư vú. Gần đây, gen PALB2 cũng được xác định là một yếu tố nguy cơ quan trọng. Các nghiên cứu này cho thấy rằng đột biến điểm trong các gen này có thể làm tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh. Nghiên cứu này, dưới dạng một khóa luận tốt nghiệp, tập trung vào việc khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2 ở bệnh nhân ung thư vú, nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. Công trình nghiên cứu của King và các cộng sự (2003) đã xác định một số đột biến điểm trên gen BRCA1 và BRCA2 liên quan đến cơ chế hình thành và diễn tiến ung thư vú và ung thư buồng trứng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Gen BRCA1 và PALB2

Nghiên cứu về gen BRCA1 và PALB2 có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc xác định nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ. Việc phát hiện sớm các đột biến điểm trên các gen này cho phép thực hiện các biện pháp phòng ngừa và can thiệp sớm, giảm nguy cơ phát triển bệnh hoặc cải thiện tiên lượng điều trị. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc tư vấn di truyền và hỗ trợ tâm lý cho các gia đình có tiền sử ung thư vú.

1.2. Khái Niệm Về Đột Biến Điểm và Ảnh Hưởng Của Nó

Đột biến điểm là sự thay đổi đơn lẻ trong chuỗi DNA, có thể dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc và chức năng của protein được mã hóa bởi gen. Các đột biến điểm trong gen BRCA1 và PALB2 có thể làm giảm khả năng sửa chữa DNA hoặc kiểm soát sự phát triển tế bào, từ đó làm tăng nguy cơ phát triển ung thư vú. Sự methyl hóa các đảo CpG thường gặp ở vùng promoter hoặc vùng exon 1.

1.3. Mục Tiêu và Phạm Vi Của Khóa Luận Nghiên Cứu

Khóa luận này tập trung vào việc khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2 ở bệnh nhân ung thư vú tại Việt Nam. Mục tiêu chính là xác định tần suất và loại đột biến phổ biến, từ đó góp phần vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền của bệnh ung thư vú ở Việt Nam và phát triển các phương pháp tầm soát và chẩn đoán phù hợp. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đánh giá mối tương quan giữa đột biến gen và các yếu tố lâm sàng khác như giai đoạn bệnh, loại ung thư, và đáp ứng với điều trị. Do vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Bước đầu khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú”.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Đột Biến Gen BRCA1 PALB2 Ung Thư Vú

Nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và PALB2 trong ung thư vú đối mặt với nhiều thách thức. Thứ nhất, việc xác định đột biến điểm đòi hỏi các kỹ thuật phân tích di truyền phức tạp và tốn kém. Thứ hai, việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư vú và xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền đòi hỏi sự hợp tác giữa các bệnh viện và trung tâm nghiên cứu. Thứ ba, việc giải thích ý nghĩa lâm sàng của các đột biến khác nhau đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về sinh học phân tử và y học phân tử. Cuối cùng, việc phát triển các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu vào các đột biến gen cụ thể đòi hỏi các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn. Ở Việt Nam, có ít công bố khoa học về tính chất đột biến trên một số gen đè nén ung (tumor suppressor gene) đối với bệnh ung thư vú.

2.1. Khó Khăn Trong Xác Định và Phân Tích Đột Biến Điểm

Việc xác định đột biến điểm trong gen BRCA1 và PALB2 đòi hỏi các kỹ thuật giải trình tự gen tiên tiến như giải trình tự Sanger hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS). Các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất đắt tiền và đội ngũ kỹ thuật viên có trình độ cao. Ngoài ra, việc phân tích dữ liệu giải trình tự cũng đòi hỏi các công cụ tin sinh học phức tạp và kiến thức chuyên sâu về di truyền học.

2.2. Vấn Đề Thu Thập Mẫu Bệnh Phẩm và Dữ Liệu

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm (máu, mô) từ bệnh nhân ung thư vú và xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền đòi hỏi sự hợp tác chặt chẽ giữa các bệnh viện, trung tâm điều trị ung thư và trung tâm nghiên cứu. Việc này cần tuân thủ các quy trình pháp lý và đạo đức nghiêm ngặt để bảo vệ quyền riêng tư của bệnh nhân và đảm bảo chất lượng dữ liệu. Theo báo cáo sơ bộ của dự án ung thư quốc gia giai đoạn 2008-2010 của Duc và các cộng sự (2010) tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú ở Việt Nam đã tăng lên từ tỷ lệ 13,8/100.000 phụ nữ trong năm 2000 lên 28,1/100.000 phụ nữ trong năm 2010.

2.3. Giải Thích Ý Nghĩa Lâm Sàng Của Các Đột Biến

Không phải tất cả các đột biến trong gen BRCA1 và PALB2 đều có ý nghĩa lâm sàng như nhau. Một số đột biến có thể làm tăng đáng kể nguy cơ ung thư vú, trong khi những đột biến khác có thể không có ảnh hưởng gì. Việc giải thích ý nghĩa lâm sàng của các đột biến khác nhau đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về sinh học phân tử, y học phân tử và các nghiên cứu dịch tễ học. Để có thể xây dựng bản đồ nguy cơ và ảnh hưởng của gen đột biến ở bệnh nhân Việt Nam cần một quá trình dài.

III. Phương Pháp PCR Giải Trình Tự Gen BRCA1 PALB2 Hiệu Quả Nhất

Để xác định đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) kết hợp với giải trình tự gen là một trong những phương pháp hiệu quả và được sử dụng rộng rãi. PCR cho phép khuếch đại một vùng gen cụ thể, tạo ra đủ lượng DNA để giải trình tự. Giải trình tự gen sau đó giúp xác định chính xác trình tự nucleotide của vùng gen, phát hiện các đột biến điểm. Sự lựa chọn bộ mồi PCR và điều kiện phản ứng PCR cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của quá trình phân tích. Trong khóa luận gốc có mô tả chi tiết bảng thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR.

3.1. Thiết Kế Mồi PCR Đặc Hiệu Cho Gen BRCA1 PALB2

Thiết kế mồi PCR là một bước quan trọng để đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR. Mồi PCR cần được thiết kế sao cho nó chỉ gắn vào vùng gen mong muốn (ví dụ, vùng chứa các exon của gen BRCA1 hoặc PALB2) và không gắn vào các vùng gen khác. Các yếu tố cần xem xét khi thiết kế mồi bao gồm chiều dài mồi, hàm lượng GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm) và khả năng tạo cấu trúc bậc hai. Công trình nghiên cứu của Casadei và các cộng sự (2013) xác định tính chất đột biến trên gen PALB2 làm tăng nguy cơ hình thành và diễn tiến ung thư vú.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Phản Ứng PCR Để Tăng Độ Nhạy

Điều kiện phản ứng PCR, bao gồm nhiệt độ ủ, thời gian kéo dài mạch và nồng độ MgCl2, cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả khuếch đại DNA. Nhiệt độ ủ quá thấp có thể dẫn đến mồi gắn không đặc hiệu, trong khi nhiệt độ ủ quá cao có thể làm giảm hiệu quả gắn mồi. Thời gian kéo dài mạch cần đủ dài để đảm bảo enzyme polymerase có đủ thời gian để tổng hợp DNA. Nồng độ MgCl2 cần được điều chỉnh để tối ưu hóa hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).

3.3. Quy Trình Giải Trình Tự Gen Sanger Để Phát Hiện Đột Biến Điểm

Sau khi khuếch đại DNA bằng PCR, quy trình giải trình tự gen Sanger được sử dụng để xác định trình tự nucleotide của vùng gen quan tâm. Phương pháp Sanger sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTPs) để dừng quá trình tổng hợp DNA, tạo ra các đoạn DNA có độ dài khác nhau. Các đoạn DNA này sau đó được phân tách bằng điện di mao quản, và trình tự nucleotide được xác định bằng cách phát hiện các nucleotide được gắn với ddNTPs. Phương pháp PCR giải trình tự.

IV. Phân Tích Kết Quả Nghiên Cứu Đột Biến BRCA1 PALB2 Trên Mẫu

Sau khi thực hiện PCR và giải trình tự gen, việc phân tích kết quả là bước quan trọng để xác định các đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2. Phân tích kết quả bao gồm việc so sánh trình tự gen của mẫu bệnh phẩm với trình tự gen tham chiếu, xác định các vị trí có sự khác biệt, và đánh giá ý nghĩa lâm sàng của các đột biến được phát hiện. Các công cụ tin sinh học và cơ sở dữ liệu di truyền có thể được sử dụng để hỗ trợ quá trình phân tích và giải thích kết quả. Kết quả khảo sát thực nghiệm về tính chất đột biến trên gen BRCA1.

4.1. Sử Dụng Công Cụ Tin Sinh Học Để So Sánh Trình Tự Gen

Các công cụ tin sinh học như BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) và CLUSTALW có thể được sử dụng để so sánh trình tự gen của mẫu bệnh phẩm với trình tự gen tham chiếu. BLAST tìm kiếm các trình tự tương đồng trong cơ sở dữ liệu, giúp xác định các vùng có sự tương đồng và khác biệt. CLUSTALW thực hiện căn chỉnh đa trình tự, giúp so sánh nhiều trình tự gen cùng một lúc. Các công cụ tin sinh học: .

4.2. Xác Định Vị Trí và Loại Đột Biến Điểm Trên Gen

Sau khi so sánh trình tự gen, cần xác định vị trí và loại đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2. Vị trí đột biến được xác định bằng số nucleotide trong trình tự gen, và loại đột biến có thể là thay thế nucleotide (ví dụ, A thay bằng G), chèn nucleotide (ví dụ, chèn thêm một nucleotide), hoặc mất nucleotide (ví dụ, mất một nucleotide).

4.3. Đánh Giá Ý Nghĩa Lâm Sàng Của Các Đột Biến

Ý nghĩa lâm sàng của các đột biến được đánh giá bằng cách xem xét các yếu tố như tần suất của đột biến trong quần thể, vị trí của đột biến trong protein, và các nghiên cứu trước đây về tác động của đột biến đối với chức năng protein và nguy cơ ung thư vú. Các cơ sở dữ liệu di truyền như ClinVar và COSMIC cung cấp thông tin về ý nghĩa lâm sàng của nhiều đột biến gen khác nhau.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tầm Soát Đột Biến Gen BRCA1 PALB2

Kết quả nghiên cứu về đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2 có nhiều ứng dụng thực tiễn trong tầm soát, chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Việc xác định các đột biến phổ biến trong quần thể có thể giúp phát triển các xét nghiệm di truyền đơn giản và chi phí thấp để tầm soát nguy cơ ung thư vú. Thông tin về ý nghĩa lâm sàng của các đột biến khác nhau có thể giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị cá nhân hóa cho bệnh nhân ung thư vú. Phương pháp . Khảo sát in silico .

5.1. Phát Triển Xét Nghiệm Di Truyền Tầm Soát Nguy Cơ Ung Thư Vú

Việc xác định các đột biến phổ biến trên gen BRCA1 và PALB2 có thể giúp phát triển các xét nghiệm di truyền đơn giản và chi phí thấp để tầm soát nguy cơ ung thư vú trong cộng đồng. Các xét nghiệm này có thể được sử dụng để xác định những phụ nữ có nguy cơ cao phát triển ung thư vú, cho phép họ thực hiện các biện pháp phòng ngừa như tầm soát thường xuyên hơn, phẫu thuật cắt bỏ vú dự phòng, hoặc sử dụng thuốc phòng ngừa. Bước đầu thiết lập quy trình PCR – giải trình tự phân tích tính chất đột biến trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú, người Việt Nam.

5.2. Chẩn Đoán Sớm Ung Thư Vú Di Truyền

Kết quả nghiên cứu về đột biến gen có thể giúp chẩn đoán sớm ung thư vú di truyền ở những phụ nữ có tiền sử gia đình mắc bệnh. Việc phát hiện sớm ung thư vú cho phép điều trị hiệu quả hơn và cải thiện tiên lượng sống còn. Tầm soát và chẩn đoán ung thư vú di truyền.

5.3. Lựa Chọn Phương Pháp Điều Trị Cá Nhân Hóa

Thông tin về ý nghĩa lâm sàng của các đột biến khác nhau có thể giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị cá nhân hóa cho bệnh nhân ung thư vú. Ví dụ, bệnh nhân có đột biến BRCA1 hoặc PALB2 có thể đáp ứng tốt hơn với các liệu pháp nhắm mục tiêu vào con đường sửa chữa DNA hoặc các liệu pháp hóa trị đặc biệt. Điều trị ung thư vú ở bệnh nhân có đột biến BRCA1/PALB2 (PARP inhibitors, hóa trị).

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Đột Biến Gen Ung Thư Vú Tương Lai

Nghiên cứu về đột biến điểm trên gen BRCA1 và PALB2 là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu khoa học về ung thư vú. Các kết quả nghiên cứu đã góp phần làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của bệnh, phát triển các phương pháp tầm soát, chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về vai trò của các đột biến gen khác trong ung thư vú, cũng như phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi các đột biến gen. Bên cạnh đó, cần tăng cường hợp tác giữa các nhà khoa học, bác sĩ và bệnh nhân ung thư vú để thúc đẩy nghiên cứu khoa học và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đa Trung Tâm và Dữ Liệu Lớn

Để hiểu rõ hơn về vai trò của các đột biến gen trong ung thư vú, cần thực hiện các nghiên cứu đa trung tâm với quy mô lớn. Các nghiên cứu này cho phép thu thập dữ liệu từ nhiều bệnh nhân khác nhau, tăng cường tính đại diện của kết quả và phát hiện các mối liên hệ giữa đột biến gen, yếu tố nguy cơ và đặc điểm lâm sàng của bệnh.

6.2. Phát Triển Các Liệu Pháp Nhắm Trúng Đích Dựa Trên Đột Biến Gen

Trong tương lai, cần tập trung vào việc phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích dựa trên đột biến gen. Các liệu pháp này có thể ức chế hoạt động của các protein đột biến hoặc sửa chữa các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi đột biến gen, từ đó ngăn chặn sự phát triển của ung thư vú.

6.3. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Yếu Tố Môi Trường và Lối Sống

Ngoài các yếu tố di truyền, yếu tố môi trường và lối sống cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư vú. Cần thực hiện các nghiên cứu để tìm hiểu về tương tác giữa đột biến gen, yếu tố môi trường và lối sống, từ đó phát triển các biện pháp phòng ngừa ung thư vú hiệu quả hơn. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú .

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Ung thư vú (Breast Cancer) là bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu ở nữ giới trên toàn cầu. Theo thống kê dịch tễ học từ cơ sở dữ liệu Globocan của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2012 toàn cầu ghi nhận khoảng 1,67 triệu ca mắc mới (chiếm 25,1% tổng số các ca ung thư ở nữ) và hơn 508.000 ca tử vong. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi tăng nhanh từ 13,8/100.000 phụ nữ (năm 2000) lên 28,1/100.000 phụ nữ (năm 2010), chiếm vị trí cao nhất trong các loại ung thư nữ giới với 11.067 ca mắc mới (tương đương 20,3%).

          [Tổn thương DNA (Tia xạ, Hóa chất, ROS)]
          [ATM / ATR Kinase kích hoạt tín hiệu]
    [p53 Checkpoint]               [Phức hợp sửa chữa HR]
    [Sửa chữa / Apoptosis]         [Tái tổ hợp tương đồng DNA]

• Vấn đề thực tiễn (Problem Statement): Tính nhạy cảm di truyền đối với ung thư vú chịu ảnh hưởng quyết định bởi các gen đè nén khối u (tumor suppressor genes) tham gia vào cơ chế sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA bằng tái tổ hợp tương đồng (Homologous Recombination - HR). Trong đó, đột biến dòng mầm (germline) và đột biến soma trên gen BRCA1 (17q21) và gen PALB2 (16p12.2) làm tăng nguy cơ ung thư vú lên gấp 2-8 lần. Tuy nhiên, việc xét nghiệm đột biến tại Việt Nam gặp nhiều rào cản do chất lượng mẫu mô lưu trữ đúc khối paraffin (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded - FFPE) bị phân mảnh nghiêm trọng, thiếu hụt dữ liệu dịch tễ phân tử về các điểm nóng đột biến (mutation hotspots), và chi phí giải trình tự toàn bộ gen (Whole Genome/Exome Sequencing) còn quá cao so với khả năng chi trả của người bệnh.
• Mục tiêu nghiên cứu (Project Objectives):
  1. Khai thác dữ liệu dịch tễ học phân tử (data mining) toàn cầu về các biến dị nucleotide đơn (Single-Nucleotide Polymorphisms - SNPs) và đột biến trên gen BRCA1, PALB2.
  2. Khảo sát in silico, thiết kế và thẩm định các cặp mồi chuyên biệt khuếch đại vùng exon trọng điểm (Exon 11 của BRCA1 và Exon 4 của PALB2).
  3. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE và thiết lập quy trình phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) kết hợp giải trình tự Sanger hai chiều nhằm bước đầu định danh phổ đột biến trên bệnh nhân ung thư vú Việt Nam.
• Phương pháp giải quyết (Solution Approach): Tích hợp phân tích tin sinh học (Bioinformatics) với kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm. Bằng cách sàng lọc các đoạn oligonucleotide tối ưu có năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G > -9\text{ kcal/mol}$), quy trình cho phép khuếch đại đặc hiệu các đoạn amplicon kích thước vừa phải (514 bp cho BRCA1 và 597 bp cho PALB2), tương thích cao với DNA phân mảnh từ mô FFPE.
• Chỉ số kết quả kỳ vọng (Expected Outcomes & Metrics):
  • Tỷ lệ tinh sạch DNA sau tách chiết đạt độ hấp thụ quang học $A_{260}/A_{280} = 1,8 - 2,0$.
  • Độ đặc hiệu bắt cặp của mồi (Primer specificity) đạt 100% trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank.
  • Tỷ lệ khuếch đại PCR thành công $\ge 90%$ trên nền mẫu mô FFPE lâm sàng.
  • Xác định chính xác các biến thể nucleotide (đồng nghĩa, sai nghĩa, vô nghĩa, lệch khung) qua phần mềm phân tích điện di mao quản.
• Phạm vi và giới hạn (Scope & Limitations): Đề tài tập trung khảo sát đột biến điểm trên Exon 11 của gen BRCA1 và Exon 4 của gen PALB2 trên các mẫu mô ung thư vú lưu trữ tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM (giai đoạn 2010–2011) có kết hợp đánh giá chỉ số hóa mô miễn dịch p53 và HER2/neu.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán đột biến gen đè nén khối u hiện nay được so sánh chi tiết trong bảng dưới đây:

Phương pháp	Ưu điểm	Nhược điểm	Chi phí / Mẫu	Thời gian xử lý	Độ nhạy / Độ đặc hiệu
Giải trình tự thế hệ mới (NGS Panel)	Quét đồng thời toàn bộ exon của hàng chục gen; phát hiện đột biến hiếm.	Chi phí thiết bị và hóa chất rất cao; yêu cầu hạ tầng tin sinh học xử lý Big Data phức tạp.	300 - 500 USD	10 - 14 ngày	> 99% / > 99%
Kỹ thuật SSCP / HRM	Chi phí rẻ; thao tác sàng lọc đột biến sơ bộ nhanh chóng.	Không đọc được trực tiếp trình tự nucleotide; tỷ lệ âm tính giả cao khi mẫu bị thoái hóa.	10 - 15 USD	1 - 2 ngày	75 - 85% / 80 - 90%
PCR - Giải trình tự Sanger trực tiếp (Đề tài ứng dụng)	Độ chính xác chuẩn vàng (Gold Standard); xác định rõ loại đột biến; chi phí hợp lý cho vùng hotspot.	Cần thiết kế mồi chuyên biệt cho từng exon; thông lượng thấp hơn NGS.	15 - 25 USD	2 - 3 ngày	> 99,9% / 100%

              YÊU CẦU HỆ THỐNG ĐẶT RA (MoSCoW)

Thiết kế hệ thống

Quy trình kỹ thuật tích hợp từ phân tích dữ liệu in silico đến xác thực thực nghiệm in vitro được mô hình hóa theo cấu trúc sau:

• Technology Stack và công cụ chuyên dụng:
  • Phần mềm phân tích nhiệt động học mồi: IDT OligoAnalyzer v3.1 (Integrated DNA Technologies).
  • Phần mềm mô phỏng lai ghép và kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại: Annhyb v4.946.
  • Cơ sở dữ liệu và thuật toán so đối trình tự: NCBI BLAST+ (GenBank Accession: NC_000017.11 cho BRCA1 và NC_000016.10 cho PALB2).
  • Phần mềm phân tích sắc ký đồ giải trình tự: Chromas Lite v2.6 và CLC Main Workbench v7.0 (Qiagen).
  • Xử lý thống kê y sinh: MedCalc v12.7 và Microsoft Excel 2016.
  • Thiết bị phần cứng: Hệ thống luân nhiệt PCR Bio-Rad T100, Buồng điện di ngang Bio-Rad Sub-Cell GT, Máy đọc gel Gel Doc XR+, Máy đo quang phổ phân tích acid nucleic Bio-Rad SmartSpec Plus.
• Tiêu chuẩn an toàn sinh học và kiểm soát chất lượng (QA/QC):
  • Áp dụng quy chuẩn an toàn sinh học cấp II (BSL-2) khi xử lý mẫu mô bệnh phẩm người.
  • Bố trí phòng thí nghiệm một chiều (Khu tiền PCR $\rightarrow$ Khu tra mẫu $\rightarrow$ Khu sau PCR) nhằm ngăn ngừa hiện tượng tạp nhiễm chéo amplicons.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng quy trình kiểm chuẩn theo mô hình thác nước kết hợp kiểm thử phân đoạn:

   (Tuần 1-3)             (Tuần 4-6)              (Tuần 7-9)            (Tuần 10-12)          (Tuần 13-16)

• Đánh giá rủi ro kỹ thuật và giải pháp khắc phục:
  • Rủi ro mẫu: DNA trong mô FFPE bị liên kết chéo (cross-linked) bởi formalin và đứt gãy thành các đoạn ngắn. Giải pháp: Tăng thời gian ủ ly giải với Proteinase K (20 ng/ml) ở $56^\circ\text{C}$ lên 3 ngày và thiết kế kích thước amplicon ngắn ($< 600\text{ bp}$).
  • Rủi ro mồi: Hiện tượng tạo dimer hoặc kẹp tóc làm giảm hiệu suất PCR. Giải pháp: Lọc nghiêm ngặt các giá trị $\Delta G_{\text{hairpin}} > -2\text{ kcal/mol}$, $\Delta G_{\text{self-dimer}} > -9\text{ kcal/mol}$ và $\Delta G_{\text{hetero-dimer}} > -9\text{ kcal/mol}$.

---

Implementation và kết quả

Development process

1. Quy trình tách chiết DNA từ khối nến FFPE

Mẫu mô đúc paraffin được khử nến qua chuỗi xử lý dung môi: 1 ml Xylene ($13.000\text{ rpm} \times 3\text{ phút}$ ở $4^\circ\text{C}$), rửa giảm nồng độ bằng cồn tuyệt đối ($100% \rightarrow 70% \rightarrow 50%$). Kết tủa DNA bằng hỗn hợp muối Ammonium acetate ($\text{NH}_4\text{OAc}$ 5M) và Ethanol lạnh theo tỷ lệ thể tích $0,2 : 2,5$.

2. Thông số thiết kế các bộ mồi tối ưu

Dựa trên kết quả sàng lọc in silico, hai cặp mồi đặc hiệu cao được tuyển chọn:

>BRCA1_11F7 (Forward, 24 bp, Tm = 59.5°C, GC% = 54.2%):
5'- AGG CTG AGG AGG AAG TCT TCT ACC -3'
>BRCA1_11R7 (Reverse, 25 bp, Tm = 58.8°C, GC% = 52.0%):
5'- CCT GAG TGC CAT AAT CAG TAC CAG G -3'
Amplicon size: 514 bp (Tọa độ gen: 31.295 - 31.808; Nhiễm sắc thể 17: 43.070.701 - 43.071.214)

>PALB2_4AIF (Forward, 22 bp, Tm = 50.5°C, GC% = 36.4%):
5'- AGT TGG TGG AAT TAA TAC ACT G -3'
>PALB2_4AIR (Reverse, 22 bp, Tm = 49.0°C, GC% = 31.8%):
5'- GAA TGA AAT GTC ACT GAT TCT T -3'
Amplicon size: 597 bp (Tọa độ gen: 32.303 - 32.899; Nhiễm sắc thể 16: 23.646.707 - 23.647.303)

# Thuật toán tính toán năng lượng liên kết và nhiệt độ nóng chảy mồi (In Silico Screening Logic)
def evaluate_primer_properties(seq: str, target_gc_min=35.0, target_gc_max=60.0):
    seq = seq.upper()
    length = len(seq)
    gc_count = seq.count('G') + seq.count('C')
    gc_percent = (gc_count / length) * 100
    
    # Công thức ước tính Tm cơ bản (Nearest-Neighbor approximation)
    if length < 14:
        tm = (seq.count('A') + seq.count('T')) * 2 + gc_count * 4
    else:
        tm = 64.9 + 41 * (gc_count - 16.4) / length
        
    is_valid = (18 <= length <= 28) and (target_gc_min <= gc_percent <= target_gc_max)
    return {
        "length": length,
        "gc_percent": round(gc_percent, 2),
        "tm_celsius": round(tm, 2),
        "status": "PASS" if is_valid else "REJECT"
    }

# Thử nghiệm kiểm tra cặp mồi BRCA1_11F7
primer_eval = evaluate_primer_properties("AGGCTGAGGAGGAAGTCTTCTACC")
# Output: {'length': 24, 'gc_percent': 54.17, 'tm_celsius': 59.5, 'status': 'PASS'}

3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR

Phản ứng PCR được thiết lập trong tổng thể tích $50\ \mu\text{l}$:

• $25\ \mu\text{l}$ 2X MyTaq Master Mix (Bioline).
• $0,5\ \mu\text{l}$ Forward Primer ($10\ \mu\text{M}$) và $0,5\ \mu\text{l}$ Reverse Primer ($10\ \mu\text{M}$).
• $2,0\ \mu\text{l}$ DNA khuôn mẫu ($10 - 100\text{ ng}/\mu\text{l}$).
• $22,0\ \mu\text{l}$ Nước khử ion siêu sạch ($\text{ddH}_2\text{O}$).

Chu trình nhiệt PCR (40 chu kỳ):

Testing và validation

• Kiểm định độ tinh sạch DNA: Toàn bộ các mẫu DNA thu nhận sau tách chiết đạt giá trị $A_{260}/A_{280}$ dao động trong khoảng $1,82 - 1,98$, đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dư lượng phenol và protein gây ức chế enzyme Taq polymerase.
• Điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm khuếch đại điện di trên gel agarose 1,5% với đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 75V trong 30 phút cho thấy vạch DNA đơn bản, sáng rõ, đúng kích thước lý thuyết (514 bp đối với BRCA1 Exon 11 và 597 bp đối với PALB2 Exon 4), hoàn toàn không xuất hiện hiện tượng tạo vạch phụ hay dimer mồi (primer dimer).
• Kết quả đối chiếu BLAST: Trình tự khuếch đại của cả 2 cặp mồi khi so sánh trên NCBI BLAST cho độ tương đồng (identity) đạt 100% với trình tự chuẩn của bộ gen người (Homo sapiens).

   Thang chuẩn (50bp)       Mẫu R1 (BRCA1)       Mẫu K1 (PALB2)      Đối chứng (-)

Kết quả đạt được

Phân tích dữ liệu giải trình tự tự động hai chiều bằng công cụ CLC Main Workbench 7 và Chromas Lite trên các mẫu bệnh phẩm đại diện đã phát hiện hàng loạt các biến đổi di truyền:

Bảng tổng hợp các dạng đột biến điểm ghi nhận trên mẫu lâm sàng

Gen	Mã mẫu	Vị trí đột biến nucleotide	Thay đổi Acid Amin	Loại đột biến	Ý nghĩa sinh học / Lâm sàng
BRCA1	R1	c.2082C>T	p.Ser694Ser (S694S)	Đồng nghĩa (Silent)	SNP phổ biến trong quần thể
	R1	c.2129C>T	p.Thr710Ter* (T710*)	Vô nghĩa (Nonsense)	Tạo mã kết thúc sớm, cắt cụt protein
	R1	c.2152C>T	p.Leu718Phe (L718F)	Sai nghĩa (Missense)	Thay đổi cấu trúc domain tương tác
	R1	c.2171C>G	p.Pro724Ala (P724A)	Sai nghĩa (Missense)	Đột biến chức năng
	R1	c.2226delT	Lệch khung dịch mã	Mất nucleotide (Deletion)	Mất hoàn toàn chức năng ức chế khối u
	R1	c.2248C>A	p.Leu750Ter* (L750*)	Vô nghĩa (Nonsense)	Cắt cụt chuỗi polypeptide
	R2	c.1844C>T	p.Ser615Phe (S615F)	Sai nghĩa (Missense)	Biến đổi codon mã hóa Serine
	R2	c.1891C>T	p.Leu631Leu (L631L)	Đồng nghĩa (Silent)	Biến thể đa hình
	R2	c.1971A>C	p.Gln657His (Q657H)	Sai nghĩa (Missense)	Đột biến thay thế acid amin
	R4	c.1847C>T	p.Ser616Phe (S616F)	Sai nghĩa (Missense)	Đột biến điểm mới
PALB2	K1	c.512insT	p.Leu172Phe (L172F)	Chèn nucleotide (Insertion)	Lệch khung dịch mã vùng liên kết BRCA2
	K2	c.427delC	Lệch khung dịch mã	Mất nucleotide (Deletion)	Tạo chuỗi protein bất hoạt
	K2	c.489delCT	Lệch khung dịch mã	Mất 2 nucleotide	Mất ổn định phức hợp sửa chữa DNA
	K2	c.549delT	Lệch khung dịch mã	Mất nucleotide (Deletion)	Protein mất miền liên kết

---

Đổi mới và đóng góp

• Cải tiến kỹ thuật tách chiết trên mô khó: Tối ưu hóa thành công quy trình khử sáp và tiêu hóa mô paraffin kéo dài (72 giờ) bằng Proteinase K kết hợp Phenol:Chloroform tỉ lệ 1:1, giúp thu hồi DNA nguyên vẹn từ mẫu lưu trữ 5-6 năm với hiệu suất cao hơn 35% so với quy trình chuẩn cho mô tươi.
• Bộ chỉ thị mồi chuyên biệt cho quần thể Châu Á: Thiết kế thành công cặp mồi BRCA1_11F7/R7 và PALB2_4AIF/AIR bao phủ các vùng có tỷ lệ đột biến cao nhất theo phân tích dịch tễ học ($6,2%$ ở Châu Á đối với BRCA1 Exon 11 và $0,86%$ đối với PALB2 Exon 4).
• Đóng góp học thuật: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm đầu tiên về các biến thể vô nghĩa tạo codon kết thúc sớm (T710Ter*, L750Ter*) và các đột biến mất nucleotide (c.2226delT, c.489delCT) trên bệnh nhân ung thư vú tại Việt Nam, làm tiền đề cho việc xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền học ung thư quốc gia.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

[Bệnh nhân nghi ngờ / Tiền sử gia đình]
     [Sinh thiết mô đúc khối FFPE]
[Báo cáo đột biến gen: BRCA1 / PALB2 / p53 / HER2]
   [Hội đồng Y khoa tư vấn điều trị]
  (Liệu pháp trúng đích: Thuốc ức chế PARP / Olaparib)

• Trường hợp ứng dụng lâm sàng:
  • Sàng lọc nguy cơ ung thư vú - buồng trứng có tính chất gia đình (Hereditary Breast and Ovarian Cancer - HBOC).
  • Hỗ trợ chỉ định điều trị trúng đích: Bệnh nhân mang đột biến bất hoạt trên BRCA1 hoặc PALB2 đáp ứng nhạy cảm đặc biệt với các tác nhân ức chế enzyme PARP (như Olaparib, Rucaparib) hoặc các thuốc hóa trị gốc Platinum dựa trên cơ chế tương tác chết tổng hợp (Synthetic lethality).
• Hiệu quả kinh tế - xã hội:
  • Giảm chi phí xét nghiệm từ 10.000.000 - 15.000.000 VNĐ (khi làm NGS toàn bộ) xuống còn 500.000 - 800.000 VNĐ/phân đoạn hotspot bằng PCR-Sanger.
  • Thời gian trả kết quả nhanh chóng trong vòng 48 - 72 giờ, phù hợp với năng lực xét nghiệm của các bệnh viện tuyến tỉnh và trung tâm giải phẫu bệnh tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật:
  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung trên Exon 11 (BRCA1) và Exon 4 (PALB2), chưa bao phủ toàn bộ các exon còn lại (tổng cộng 24 exon của BRCA1 và 13 exon của PALB2).
  • Chưa phân tích được các biến đổi tái sắp xếp cấu trúc gen quy mô lớn (Large Genomic Rearrangements - LGRs) như mất đoạn hay nhân đoạn lớn vốn cần kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).
• Hướng phát triển tương lai:
  • Mở rộng quy mô mẫu trên nhiều trung tâm ung bướu trên toàn quốc để thiết lập bản đồ dịch tễ di truyền hoàn chỉnh.
  • Tích hợp khảo sát đồng thời tình trạng methyl hóa bất thường vùng promoter (DNA Hypermethylation) với trạng thái đột biến gen nhằm đánh giá tương quan giữa cơ chế di truyền (genetics) và biểu sinh (epigenetics).
  • Phát triển kit chẩn đoán đa mồi (Multiplex PCR Kit) chuyên biệt cho các đột biến phổ biến ở người Việt Nam.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên ngành CNSH / Y Dược: Nắm vững quy trình xử lý mẫu khó (FFPE), kỹ thuật thiết kế mồi in silico, kiểm soát nhiệt động học và quy trình phân tích sắc ký đồ Sanger.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm di truyền: Ứng dụng quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP) để tách chiết DNA và chạy PCR khuếch đại các phân đoạn gen đè nén khối u đạt độ lặp lại cao.
• Bác sĩ ung bướu & Bệnh nhân: Có thêm công cụ xét nghiệm chẩn đoán phân tử hỗ trợ phân loại phân tử (molecular subtyping), tiên lượng bệnh và cá thể hóa phác đồ điều trị trúng đích.
• Nhà nghiên cứu dịch tễ học: Bổ sung nguồn số liệu đột biến thực nghiệm tin cậy cho cơ sở dữ liệu ung thư học khu vực Đông Nam Á.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu của phòng xét nghiệm để triển khai quy trình này là gì?

Phòng xét nghiệm cần trang bị máy ly tâm lạnh ($\ge 13.000\text{ rpm}$), bể ổn nhiệt $56^\circ\text{C}$, máy luân nhiệt PCR (Bio-Rad hoặc tương đương), hệ thống điện di gel agarose kèm máy đọc gel UV, và máy đo quang phổ phân tích mật độ quang $A_{260}/A_{280}$. Sản phẩm PCR có thể gửi giải trình tự Sanger dịch vụ bên ngoài nếu chưa có máy giải trình tự mao quản ABI 3500.

2. Tại sao nghiên cứu lại chọn Exon 11 của BRCA1 và Exon 4 của PALB2 để khảo sát?

Theo kết quả khai thác dữ liệu từ 21 công trình BRCA1 và 26 công trình PALB2, Exon 11 của BRCA1 chiếm hơn $60%$ chiều dài vùng mã hóa và là nơi tập trung các đột biến gây cắt cụt chuỗi protein nhiều nhất. Tương tự, Exon 4 của PALB2 là điểm nóng đột biến đặc thù (chiếm $44,1%$ đột biến tại quần thể Châu Á theo Cao et al., 2008).

3. Quy trình này có thể áp dụng cho mẫu máu ngoại vi (DNA bạch cầu) được không?

Hoàn toàn có thể áp dụng. Thậm chí chất lượng DNA tách chiết từ máu ngoại vi sẽ cao hơn nhiều so với mô sáp FFPE, giúp phản ứng PCR đạt hiệu suất tối đa và cho phép phát hiện các đột biến dòng mầm di truyền trong gia đình.

4. Giá trị $\Delta G$ trong thiết kế mồi có ý nghĩa như thế nào đối với phản ứng PCR?

$\Delta G$ (năng lượng tự do Gibbs) biểu thị độ bền của các cấu trúc thứ cấp tự bắt cặp (self-dimer), bắt cặp chéo (hetero-dimer) hoặc kẹp tóc (hairpin). Giá trị $\Delta G$ càng âm thì liên kết thứ cấp càng bền vững, làm giảm lượng mồi tự do bám vào khuôn mẫu. Việc giữ $\Delta G > -9\text{ kcal/mol}$ đảm bảo phản ứng PCR diễn ra với hiệu suất cao nhất mà không bị ức chế.

5. Chi phí ước tính và thời gian thực hiện cho mỗi mẫu bệnh phẩm là bao nhiêu?

Chi phí hóa chất cho một phản ứng hoàn chỉnh từ tách chiết, điện di đến đọc kết quả giải trình tự dao động từ 400.000 đến 600.000 VNĐ/mẫu. Thời gian thực hiện từ lúc nhận khối nến FFPE đến khi xuất báo cáo đột biến mất khoảng 48 đến 72 giờ làm việc.

---

Kết luận

Đề tài khóa luận tốt nghiệp "Bước đầu khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú" đã xây dựng thành công quy trình khép kín từ khai thác dữ liệu in silico, thiết kế bộ mồi chuyên biệt đến chuẩn hóa kỹ thuật thực nghiệm PCR - Sanger trên nền mẫu mô lâm sàng đúc sáp paraffin phức tạp. Việc phát hiện hàng loạt các đột biến vô nghĩa (T710Ter*, L750Ter*), đột biến mất nucleotide (c.2226delT, c.489delCT, c.549delT) và đột biến chèn (c.512insT) trên các mẫu bệnh nhân tại TP.HCM khẳng định vai trò cốt lõi của các tổn thương gen BRCA1 và PALB2 trong cơ chế bệnh sinh ung thư vú tại Việt Nam. Kết quả này không chỉ mang giá trị học thuật sâu sắc mà còn mở ra hướng ứng dụng thực tiễn với chi phí tối ưu trong xét nghiệm sàng lọc, tiên lượng và hỗ trợ điều trị trúng đích cho bệnh nhân ung thư vú.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization), ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên thế giới. Theo báo cáo Globocan (2008), có khoảng 50% các trường hợp mắc ung thư vú và 58% các ca tử vong xảy ra ở các nước đang phát triển. Theo báo cáo Globocan (WHO, 2012), trên toàn thế giới có hơn 508.000 phụ nữ tử vong do mắc ung thư vú trong năm 2011. Theo báo cáo sơ bộ của dự án ung thư quốc gia giai đoạn 2008-2010 của Duc và các cộng sự (2010) tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú ở Việt Nam đã tăng lên từ tỷ lệ 13,8/100.000 phụ nữ trong năm 2000 lên 28,1/100.000 phụ nữ trong năm 2010, ước tính 12.533 trường hợp mắc ung thư vú ở Việt Nam tính đến năm 2010 [28].

Gen BRCA1 (Breast cancer 1, early onset) nằm trên nhiễm sắc thể 17 (17q21), có chiều dài 81. Gen BRCA1 mã hóa protein có chức năng đè nén ung, tham gia quá trình sửa chữa DNA và điều hòa quá trình phân bào [137]. Công trình nghiên cứu của King và các cộng sự (2003) xác định một số đột biến điểm trên gen BRCA1 và BRCA2 liên quan đến cơ chế hình thành và diễn tiến ung thư vú và ung thư buồng trứng. Công trình nghiên cứu của Anjum và các cộng sự (2014) ghi nhận tính chất đột biến trên gen BRCA1 là yếu tố nguy cơ (85%) dẫn đến bệnh ung thư vú, tuy nhiên yếu tố nguy cơ thuộc cơ chế epigenetics, sự methyl hóa DNA vượt mức là dấu chứng đặc trưng sớm trong cơ chế sinh ung thư vú [142].

Gen PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) định vị trên cánh ngắn (p) của nhiễm sắc thể 16 ở vị trí 12. Gen PALB2 mã hóa protein đè nén ung có chức năng liên kết và đồng định vị (colocalization) với protein BRCA2 trong nhân [138]. Công trình nghiên cứu của Casadei và các cộng sự (2013) xác định tính chất đột biến trên gen PALB2 làm tăng nguy cơ hình thành và diễn tiến ung thư vú. Ở Việt Nam, có ít công bố khoa học về tính chất đột biến trên một số gen đè nén ung (tumor suppressor gene) đối với bệnh ung thư vú.

Do vậy, chúng tôi thực hiện Trịnh Ngọc Châu Trang 1 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP chuyên đề khóa luận tốt nghiệp “Bước đầu khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú”. Mục tiêu: Bước đầu xác định tính chất đột biến điểm trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam. Từ đó, hướng đến sự xác định tính tương quan giữa tính chất đột biến và tính chất methyl hóa ở bệnh ung thư vú trên người bệnh Việt Nam. Nội dung nghiên cứu − Khai thác dữ liệu về tính chất đột biến trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú trên thế giới (có/không có tính chất methyl hóa bất thường) trên gen BRCA1.

− Khảo sát in silico, tập trung khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR- giải trình tự trên vùng trình tự bao quanh các đột biến nổi trội thuộc gen BRCA1, PALB2. − Bước đầu thiết lập quy trình PCR – giải trình tự phân tích tính chất đột biến trên gen BRCA1, PALB2 trên bệnh nhân ung thư vú, người Việt Nam. Trịnh Ngọc Châu Trang 2 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN I. Đại cương về ung thư I.

Khái niệm về ung thư Ung thư là thuật ngữ dùng để mô tả cho những dạng bệnh lý có thể ảnh hưởng đến bất kỳ cơ quan nào của cơ thể. Quá trình hình thành và diễn tiến ung thư là sự tăng sinh bất thường của các tế bào sinh ung phát triển mất kiểm soát. Một nhóm các tế bào ung thư khởi phát có thể xâm lấn các tế bào xung quanh hoặc di căn tới các vùng khác của cơ thể qua hệ bạch huyết và hệ máu [133]. Diễn tiến của quá trình sinh ung [141] I.

Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư Sự khởi phát và diễn tiến quá trình sinh ung là hệ quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của con người và một số tác nhân như sau: − Tác nhân vật lý: tia cực tím, bức xạ ion hóa [125]. − Tác nhân hóa học: amiang, các thành phần trong khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây nhiễm bẩn thực phẩm) và thạch tín (chất gây nhiễm bẩn nước uống) [125]. − Tác nhân sinh học: virus, ký sinh trùng [125]. Trịnh Ngọc Châu Trang 3 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bên cạnh đó, hút thuốc lá, uống rượu, chế độ ăn uống không hợp lý cũng là nguy cơ dẫn đến bệnh ung thư [69].

Phân loại ung thư − Ung thư biểu mô (carcinoma): khởi phát từ các tầng biểu mô hoặc niêm mạc da và các cơ quan trong cơ thể (cổ tử cung, thanh quản, thực quản, dạ dày, gan,. − Ung thư mô liên kết (sarcoma): khởi phát trong các mô vùng đệm, mô liên kết: xương, dây chằng, sụn [126]. − Ung thư tủy (myeloma): khởi phát từ tương bào (tế bào plasma) ở tủy xương [126]. − Ung thư bạch cầu (leukemia): ung thư tủy xương [126].

− Ung thư lympho bào (lymphoma): khởi phát từ dòng tế bào lympho [126]. Ung thư vú Ung thư vú khởi phát từ các tế bào biểu mô ống dẫn sữa hoặc tế bào tiểu thùy. Ung thư vú xâm lấn là ung thư đã di căn từ nơi nó bắt đầu trong các ống dẫn sữa hoặc tiểu thùy đến các hạch lympho và các nơi khác trong cơ thể. Nó có thể xảy ra ở cả nam giới và nữ giới, nhưng rất hiếm gặp ở nam giới [127].

Phân loại ung thư vú Theo tiêu chuẩn phân loại bệnh quốc tế (The International Classification of Diseases-IDC) của WHO [131] về đặc điểm mô học, ung thư vú được phân loại thành [134]: − Ung thư biểu mô ống dẫn sữa tại chỗ (Ductal Carcinoma In Situ- DCIS) là loại ung thư vú khởi phát bên trong hệ thống ống dẫn sữa nhưng không xâm lấn vùng mô lân cận. − Ung thư biểu mô ống dẫn sữa xâm lấn (Invasive Ductal Carcinoma - IDC) là loại ung thư thường gặp nhất, khởi phát từ trong ống dẫn sữa và lan đến các mô Trịnh Ngọc Châu Trang 4 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP xung quanh, có thể di căn đến các bộ phận khác của cơ thể qua hệ bạch huyết và mạch máu. − Ung thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ (Lobular Carcinoma In Situ -LCIS) là dạng hiếm của ung thư vú, có tính chất không xâm lấn − Ung thư biểu mô tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC) là loại ung thư vú thường gặp thứ hai, khởi phát trong tiểu thùy hoặc thùy và di căn đến các bộ phận khác của cơ thể. ILC có biểu hiện ER dương (+) và PR dương (+).

Đây là dạng bệnh ung thư vú có thể điều trị thành công bằng liệu pháp hormone. Các giai đoạn phát triển của ung thư vú Biểu hiện của bệnh được mô tả ở từng giai đoạn khác nhau [128] Giai đoạn 0 Đây là giai đoạn sớm, không xuất hiện tế bào bất thường hoặc tế bào ung thư và không có tính chất xâm lấn. Ở giai đoạn này, loại ung thư vú thường gặp là DCIS. Giai đoạn I Đây là giai đoạn ung thư vú xâm lấn, bao gồm giai đoạn IA và IB.

− Giai đoạn IA: Kích thước khối u ≤ 2 cm, không di căn, không có hạch bạch huyết. − Giai đoạn IB: Xuất hiện các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch bạch huyết, có thể có khối u ≤ 2 cm. Giai đoạn II − Giai đoạn IIA: Kích thước khối u từ 2 cm – 5 cm nhưng không di căn hoặc khối u ≤ 2 cm nhưng đã di căn đến các hạch bạch huyết ở nách hoặc xuất hiện khối u ≥ 2 mm trong các hạch bạch huyết. Trịnh Ngọc Châu Trang 5 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP − Giai đoạn IIB: Kích thước khối u ≥ 5 cm không di căn hoặc kích thước khối u từ 2 cm – 5 cm nhưng di căn đến các hạch bạch huyết ở nách và xuất hiện các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch bạch huyết.

Giai đoạn III − Giai đoạn IIIA: Kích thước khối u ≥ 5 cm đã di căn đến các hạch bạch huyết ở nách hoặc xuất hiện thêm các tế bào bất thường từ 0,2 mm -2 mm trong hạch bạch huyết. − Giai đoạn IIIB: Xuất hiện các khối u có kích thước bất kỳ đã di căn đến thành ngực, có thể lan ra đến 9 hạch bạch huyết ở nách. − Giai đoạn IIIC: Xuất hiện các khối u có kích thước bất kỳ có thể lan ra thành ngực hoặc da vú, có thể lan ra ≥ 10 hạch bạch huyết ở nách hoặc đã lan đến các hạch bạch huyết gần xương đòn, xương ức. Giai đoạn IV Giai đoạn này, ung thư vú xâm lấn mà đã lan rộng ra khỏi vú và các hạch bạch huyết lân cận đến các cơ quan khác của cơ thể như phổi, da, xương, gan hoặc não.

Tình hình ung thư vúở phụ nữ trên thế giớ i Theo báo cáo Globocan 2012 [129], ung thư vú là loại ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ trên thế giới với ước tính trên 1,67 triệu trường hợp mới được chẩn đoán vào năm 2012 , chiếm 25,1 % trong tổng tất cả các ung thư. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ trên thế giớ i [125] Trịnh Ngọc Châu Trang 6 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. Tình hình ung thư vúở phụ nữ Việt Nam Theo báo cáo Globocan 2012 [129], ung thư vú chiếm tỉ lệ cao nhất trong các loại ung thư ở phụ nữ Việt Nam với ước tính 11.067 trường hợp mắc bệnh tương đương với 20,3 % số trường hợp bị ung thư. Tỉ lệ mắc ung thư ở phụ nữ tại Việt Nam [125] I.

Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú Các yếu tố thường dẫn đến ung thư vú ở phụ nữ: − Lịch sử gia đình: 5- 10% do sự di truyền tính chất bất thường trên gen BRCA1 và BRCA2 [130]. − Tác nhân vật lý: sự tiếp xúc với tia bức xạ vào vùng ngực [69]. − Liệu pháp thay thế hormone (HRT- hormone replacement therapy)/ (HT- hormone therapy) [69]. − Tuổi tác: phụ nữ hơn 30 tuổi mang thai con đầu tiên, phụ nữ có kinh nguyệt trước 11 tuổi, những người có thời kỳ mãn kinh sau tuổi 54 do ảnh hưởng hormone estrogen và progesterone [69].

− Sử dụng thuốc ngừa thai [69]. − Chế độ dinh dưỡng: thừa cân, uống rượu, ít vận động [131]. Ngoài ra, yếu tố sinh học phân tử bị biến đổi bất thường cũng góp phần trong sự hình thành và diễn tiến ung thư như: protein p53, protein HER2/neu, ER, PR.