Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu dna phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật realtime pcr nhằm dự báo, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật
• Loại tài liệu: Luận văn

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ DNA PHÔI THAI TỰ DO LƯU HÀNH TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ
• 1.1. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do
• 1.1.1. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do từ những tế bào thai có nhân lưu hành trong tuần hoàn mẹ
• 1.1.2. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do từ rau thai
• 1.1.3. Nguồn gốc từ sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA phôi thai tự do giữa mẹ và thai
• 1.2. Kích thước của DNA phôi thai tự do
• 1.3. Thời gian bán hủy t/2 của DNA phôi thai tự do
• 1.4. Tình hình nghiên cứu DNA phôi thai tự do ở nước ngoài và ở Việt Nam
• 1.4.1. Ở nước ngoài
• 1.4.1.1. DNA phôi thai tự do và tiền sản giật
• 1.4.1.2. Một số ứng dụng lâm sàng khác của DNA phôi thai tự do

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ

Nghiên cứu về DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ đã mở ra một hướng đi mới trong việc dự báo và chẩn đoán tiền sản giật. Tiền sản giật là một tình trạng nghiêm trọng có thể gây ra nhiều biến chứng cho cả mẹ và thai nhi. Việc phát hiện sớm và chính xác tình trạng này là rất quan trọng để giảm thiểu rủi ro. Nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ có thể tăng cao trước khi có triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật, từ đó giúp các bác sĩ có thể can thiệp kịp thời.

1.1. Nguồn gốc và cơ chế của DNA phôi thai tự do

DNA phôi thai tự do được giải phóng vào huyết tương thai phụ từ các tế bào thai chết theo chương trình. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ DNA phôi thai tự do có thể tăng cao trong các trường hợp thai phụ có nguy cơ tiền sản giật. Điều này gợi ý rằng có thể có một mối liên hệ giữa nồng độ DNA phôi thai và tình trạng sức khỏe của thai phụ.

1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu DNA phôi thai

Việc nghiên cứu DNA phôi thai tự do không chỉ giúp phát hiện sớm tiền sản giật mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như chẩn đoán thai lệch bội. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như Realtime PCR đã được áp dụng để định lượng DNA phôi thai, mở ra cơ hội cho các phương pháp chẩn đoán không xâm lấn.

II. Vấn đề và thách thức trong việc dự báo tiền sản giật

Tiền sản giật là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho mẹ và thai nhi. Tình trạng này thường khó phát hiện sớm và có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng. Các phương pháp hiện tại chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng như huyết áp cao và protein niệu, nhưng không đủ chính xác. Việc phát hiện DNA phôi thai tự do trong huyết tương có thể là một giải pháp tiềm năng để cải thiện khả năng dự báo.

2.1. Những khó khăn trong chẩn đoán tiền sản giật

Chẩn đoán tiền sản giật hiện tại chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, điều này có thể dẫn đến việc bỏ sót các trường hợp nguy hiểm. Nhiều thai phụ không có triệu chứng rõ ràng nhưng vẫn có nguy cơ cao. Việc phát hiện DNA phôi thai tự do có thể giúp cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán.

2.2. Tác động của tiền sản giật đến sức khỏe mẹ và thai nhi

Tiền sản giật có thể gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng cho cả mẹ và thai nhi, bao gồm sản giật, rau bong non, và suy thai. Việc phát hiện sớm và can thiệp kịp thời là rất quan trọng để giảm thiểu rủi ro cho cả hai. Nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do có thể là một chỉ số quan trọng trong việc dự báo tình trạng này.

III. Phương pháp nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng DNA phôi thai một cách chính xác và không xâm lấn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ DNA phôi thai tự do tăng cao trước khi có triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật, từ đó mở ra cơ hội cho việc sàng lọc và dự báo sớm.

3.1. Kỹ thuật Realtime PCR trong nghiên cứu DNA phôi thai

Realtime PCR là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép định lượng DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ chính xác cao, giúp phát hiện nồng độ DNA phôi thai ngay từ những tuần đầu của thai kỳ.

3.2. Đánh giá nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật có sự khác biệt rõ rệt. Việc đánh giá nồng độ này có thể giúp các bác sĩ dự đoán và theo dõi tình trạng sức khỏe của thai phụ một cách hiệu quả hơn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu DNA phôi thai tự do

Nghiên cứu về DNA phôi thai tự do không chỉ có giá trị trong việc dự báo tiền sản giật mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như chẩn đoán thai lệch bội. Việc phát hiện sớm và chính xác tình trạng này có thể giúp giảm thiểu rủi ro cho cả mẹ và thai nhi. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ DNA phôi thai tự do có thể tăng cao trước khi có triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật.

4.1. Dự báo tiền sản giật qua nồng độ DNA phôi thai

Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ có thể là một chỉ số quan trọng trong việc dự báo tiền sản giật. Nghiên cứu cho thấy nồng độ này tăng cao trước khi có triệu chứng lâm sàng, từ đó giúp các bác sĩ có thể can thiệp kịp thời.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán thai lệch bội

Việc phát hiện DNA phôi thai tự do cũng có thể ứng dụng trong chẩn đoán thai lệch bội, giúp giảm thiểu rủi ro cho thai phụ. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ DNA phôi thai tự do có thể tăng cao trong các trường hợp thai lệch bội, từ đó giúp các bác sĩ có thể đưa ra quyết định chính xác hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu DNA phôi thai tự do

Nghiên cứu về DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc dự báo và chẩn đoán tiền sản giật. Việc phát hiện sớm và chính xác tình trạng này có thể giúp giảm thiểu rủi ro cho cả mẹ và thai nhi. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học, đặc biệt trong lĩnh vực sản khoa.

5.1. Triển vọng nghiên cứu DNA phôi thai trong y học

Nghiên cứu về DNA phôi thai tự do có thể mở ra nhiều hướng đi mới trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh lý liên quan đến thai kỳ. Việc phát hiện sớm và chính xác tình trạng sức khỏe của thai phụ sẽ giúp nâng cao chất lượng cuộc sống cho cả mẹ và thai nhi.

5.2. Tương lai của chẩn đoán không xâm lấn

Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, chẩn đoán không xâm lấn sẽ ngày càng trở nên phổ biến và chính xác hơn. Nghiên cứu về DNA phôi thai tự do sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện các phương pháp chẩn đoán và theo dõi sức khỏe thai phụ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ DNA PHÔI THAI TỰ DO LƯU HÀNH TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ 1. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do Mặc dù DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ đã được biết đến với nhiều ứng dụng tiềm năng nhưng cơ chế sinh học lại còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Có khả năng một trong những nguồn gốc của DNA phôi thai tuần hoàn là các tế bào thai có nhân trong máu mẹ [12].

Nghiên cứu của Sekizawa và CS (2000) thấy rằng có một lượng lớn tế bào thai có nhân chết theo chương trình và có thể giải phóng DNA phôi thai vào huyết tương thai phụ [13]. Đó cũng là lý do mà số lượng tế bào thai và nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bị tiền sản giật hoặc có nguy cơ sinh con lệch bội đều tăng cao bất thường [14],[15],[16]. Theo Lo và CS (1999), DNA phôi thai tự do được giải phóng ở các thời kỳ khác nhau không chỉ theo một cách hoặc từ một nguồn gốc [14]. Có nhiều giả thuyết về nguồn gốc mô học của DNA phôi thai tuần hoàn thai phụ, trong đó có 3 khả năng: từ những tế bào thai có nhân lưu hành trong vòng tuần hoàn mẹ, từ rau thai và sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA.

Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do từ những tế bào thai có nhân lưu hành trong tuần hoàn mẹ Theo Rudin và CS (1997) hàng ngày có sự phân chia 1011–1012 tế bào và một lượng tương đương sẽ mất đi để duy trì sự cân bằng mô, do vậy có khoảng 1–10g DNA có thể bị thải trừ mỗi ngày và có mặt trong huyết tương [17]. Còn Bianchi và CS (1997) tiến hành kỹ thuật PCR định lượng dựa trên các tế bào nguyên vẹn trong máu thai phụ đã phát hiện được khoảng 1 tế bào thai có nhân/1ml máu toàn phần của thai phụ mang thai bình thường. Từ đó, tác giả LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 cho rằng các tế bào thai có nhân trong tuần hoàn thai phụ có thể là nguồn gốc mô học thích hợp của DNA phôi thai tự do [12]. Căn cứ vào nghiên cứu của Fournie và CS (1993) và Sekizawa và CS (2000), Bianchi và CS (2004) cho rằng DNA phôi thai tự do được giải phóng vào máu mẹ là do tác động của hệ thống miễn dịch của mẹ đối với các tế bào thai chết theo chương trình [13],[18],[19].

Các tế bào và các acid nucleic của thai trong tuần hoàn thai phụ đều tăng trong các biến chứng thai nghén như tiền sản giật và thai lệch bội, điều này cho phép nghĩ rằng giữa chúng có thể tồn tại một mối liên quan nào đó. Để tìm hiểu về mối liên quan giữa các tế bào hồng cầu có nhân của thai với nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ, Zhong và CS (2002) đã sử dụng máu toàn phần của các thai phụ mang thai nam (gồm: nhóm bình thường và nhóm có nguy cơ tiền sản giật, đẻ non), tiến hành đồng thời 2 phương pháp: lai tại chỗ huỳnh quang để đếm số tế bào thai và kỹ thuật PCR xác định nồng độ DNA phôi thai tự do [20]. Kết quả cho thấy không có mối liên quan giữa các tế bào thai và DNA phôi thai tự do trong các trường hợp này. Điều đó gợi ý rằng, các tế bào hồng cầu có nhân của thai không phải là nguồn gốc của DNA phôi thai tự do trong máu thai phụ có nguy cơ đẻ non, vì trong nhóm này lượng DNA phôi thai tự do tăng một cách có ý nghĩa mà không có sự tăng tương ứng của các tế bào hồng cầu có nhân của thai.

Angert và CS (2003) đã giả sử rằng sau khi lấy máu vào ống nghiệm, các tế bào thai chết theo chương trình sẽ tan rã hết trong ống nghiệm và giải phóng DNA của chúng; hoặc các tế bào thai bị tan rã sau khi tiếp xúc với hệ thống miễn dịch của mẹ và dẫn đến giải phóng DNA phôi thai nhiều hơn; sau đó tiến hành nghiên cứu các mẫu huyết tương thai phụ được lấy 2 lần vào 2 thời điểm khác nhau là 3 tháng đầu và 3 tháng cuối rồi định lượng DNA trên nhiễm sắc thể (NST) Y - dấu ấn của thai và DNA β-globin - dấu ấn của DNA của cả thai LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 và mẹ ở các thời điểm trong vòng 24 giờ. Kết quả là các thời điểm trong vòng 24 giờ ở cả 2 giai đoạn của thai kỳ đều không có sự tăng DNA phôi thai trong ống nghiệm [21]. Như vậy, những tế bào huyết học của thai ở trong ống nghiệm không phải là nguồn gốc duy nhất và quan trọng nhất của DNA phôi thai tự do. Nguồn gốc của DNA phôi thai tự do từ rau thai Rau thai là nguồn gốc hợp lý của DNA phôi thai tự do vì kích thước của nó cũng như các tế bào hoạt động phong phú.

Rất nhiều nghiên cứu đã thấy rằng có mối liên hệ giữa nồng độ DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn mẹ với tuổi thai [13],[22],[23]. Sekizawa và CS (2003) nghiên cứu ở 15 thai phụ (hình thức đẻ là mổ lấy thai) có cùng tuổi thai trong đó gồm 5 thai phụ tiền sản giật và 10 thai phụ bình thường, tác giả đã phân tích các cặp mẫu huyết tương của mẹ và huyết tương của con (lấy từ máu dây rốn của con), sử dụng 7 dấu ấn khác nhau trên các NST 13, 18 và 21 để phân biệt DNA phôi thai tự do với DNA mẹ. Kết quả cho thấy nồng độ trung bình của DNA phôi thai trong huyết tương ở dây rốn (trung vị 0.4%) thấp hơn đáng kể so với DNA trong huyết tương mẹ (14.3 - 64%) với p = 0,007; từ đó, tác giả khẳng định rằng DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai phụ có nguồn gốc từ rau thai [24]. Với mục đích để chứng minh giả thuyết DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương của thai phụ có nguồn gốc chủ yếu từ rau thai, nghiên cứu năm 2007 tiến hành trên hai nhóm: nhóm 1 gồm 15 thai phụ bình thường ở tuần thứ 11 của thai kỳ (11 thai phụ mang thai nam và 04 thai phụ mang thai nữ) và nhóm 2 gồm 9 thai phụ ở tuần thứ 8 của thai kỳ được chẩn đoán là mang thai không phôi (có túi thai nhưng không có phôi thai), trong thực tế, nồng độ DNA phôi thai tự do có xu hướng cao hơn tập trung ở nhóm thai phụ mang thai không phôi, có lẽ ở những thai phụ này thì quá trình các tế bào rau thai chết theo LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 chương trình tăng cao hơn.

Kết quả này ủng hộ giả thuyết rằng rau thai là nguồn chính của các DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ [8]. Nguồn gốc từ sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA phôi thai tự do giữa mẹ và thai Nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau cho thấy có thể phát hiện được DNA phôi thai tự do trong một số dịch cơ thể khác nhau của mẹ bao gồm dịch ối, nước tiểu, dịch não tủy [25],[26],[27]. Và nồng độ DNA phôi thai tự do trong dịch ối cao gấp 100 - 200 lần so với trong huyết tương thai phụ [28]. Với một số lượng lớn DNA phôi thai tự do trong dịch ối liệu có làm gia tăng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương của thai phụ, tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy không có sự tương quan giữa nồng độ DNA phôi thai tự do trong dịch ối và DNA phôi thai tự do trong huyết tương của thai phụ.

Zhong và CS (2006) cũng đã nghiên cứu về mối tương quan của nồng độ của DNA phôi thai tự do trong dịch ối và trong huyết tương thai phụ mang thai dị tật bằng kỹ thuật Realtime PCR, kết quả cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong nước ối trung bình là 3978 copy/ml nước ối và trong huyết tương là 96,6 copy/ml huyết tương của thai phụ, tuy nhiên, không có sự tương quan đáng kể giữa nồng độ DNA phôi thai tự do trong dịch ối và huyết tương của thai phụ. Như vậy, màng ối không góp phần vào sự hiện diện của DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ [27]. Một nghiên cứu định lượng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương, trong dịch ối và trong khoang màng ối ở thai phụ tuần thứ 7 - 9, kết quả nồng độ DNA phôi thai tự do trong dịch ối cao nhất, trong khoang màng ối thấp hơn và trong huyết tương thai phụ là thấp nhất [29]. Một số tác giả cho rằng kích thước của DNA phôi thai tự do trong tuần hoàn thai phụ 100 - 300bp, tương đương khoảng 30 - 90kDa, càng khẳng định DNA phôi thai tự do trong dịch ối không thể trao đổi trực tiếp với tuần hoàn thai phụ.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 Như vậy, sự có mặt của DNA phôi thai tự do trong dịch ối và trong tuần hoàn là quá trình trao đổi trực tiếp từ thai vào dịch ối và từ thai vào tuần hoàn mẹ. Điều này cho phép nghĩ đến sự trao đổi trực tiếp của các phân tử DNA phôi thai tự do qua rau thai hoặc qua dịch ối. Có thể cho rằng phần lớn DNA phôi thai tự do trong tuần hoàn thai phụ có nguồn gốc từ rau thai, một ngoại lệ có nguồn gốc từ các tế bào thai có nhân trong tuần hoàn thai phụ và có khả năng từ chính thai thông qua trao đổi trực tiếp. Kích thước của DNA phôi thai tự do Để phân biệt DNA phôi thai tự do hay DNA có nguồn gốc từ thai phụ lưu hành trong tuần hoàn thai phụ, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành.

và CS đã nghiên cứu để xác định sự phân bố về kích thước của DNA lưu hành trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe với cặp mồi của gen leptin (gồm 1 mồi xuôi và 9 mồi ngược với kích thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng là 105bp, 145bp, 201bp, 280bp, 356bp, 449bp, 576bp, 697bp, 798bp), đồng thời với cặp mồi của gen SRY xác định sự phân bố kích thước của DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ (gồm 1 mồi xuôi và 6 mồi ngược với kích thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng là: 107bp, 137bp, 193bp, 313bp, 392bp, 524bp). Kết quả cho thấy: 57% DNA của người mẹ có kích thước > 201bp; hầu hết kích thước của DNA phôi thai tự do ngắn ≤ 193bp, 20% kích thước > 193bp, 0% kích thước > 313bp và ngắn hơn DNA có nguồn gốc từ của mẹ [30].