Phần mở đầu 1 Lời cảm ơn 2 Giới thiệu đề tài bằng tiếng Việt 3 Giới thiệu đề tài bằng tiếng Anh 4 Mục lục 5-7 Danh sách chữ viết tắt 8 Danh sách hình 9 Danh sách bảng 10 Bảng quyết toán kinh phí đã chi 11 I- Tổng quan 12 1. Đại cương về thực vật học 12 1. Vị trí phân loại thực vật học 12 1. Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) 12 1.
Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa 13 1. Phân bố, sinh thái 13 1. Thành phần hóa học 14 1. Tác dụng dược lý 18 II- Nội dung và phương pháp 21 1.
Thực vật học của cây Bảy lá một hoa ở Kon Tum 21 1. Phương pháp nghiên cứu 21 1. Sản phẩm và nội dung cần đạt 21 2. Xác định hàm lượng saponin toàn phần trong cây Bảy lá một hoa ở Kon Tum 21 2.
Mất khối lượng do làm khô 21 2. Định tính hợp chất saponin có trong dược liệu 22 5 2. Phương pháp hóa học 22 2. Sắc kí lớp mỏng 22 2.
Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp Namba 24 2. Sản phẩm và nội dung cần đạt 24 3. Phương pháp 24 3. Sản phẩm và nội dung cần đạt 25 4.
Tách chiết hợp chất saponin steroid 25 4. Phương pháp 25 4. Sản phẩm và nội dung cần đạt 26 III- Kết quả 27 1. Thực vật học của loài Bảy lá một hoa ở Kon Tum 27 1.
Tên khoa học của cây Bảy lá một hoa ở Kon Tum 27 1. Mô tả hình thái ngoài 27 1. Sinh học và sinh thái 28 1. Giá trị sử dụng 28 1.
Khảo sát vi học 28 1. Xác định hàm lượng saponin toàn phần trong Bảy lá một hoa ở Kon Tum 36 2. Định tính hợp chất saponin 36 2. Bằng phương pháp hóa học 36 2.
Bằng sắc kí lớp mỏng 37 2. Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp NamBa 38 6 3. Chiết xuất cao tổng 38 3. Chiết xuất cao phân đoạn 39 4.
Phân lập và tinh chế hợp chất saponin steroid 40 4. Phân lập các hợp chất saponin steroid từ phân đoạn cao ethyl acetate 40 4. Biện giải cấu trúc hai hợp chất cô lập được 43 4. Hợp chất EA3.
Hợp chất EA5.3 47 IV- Kết luận và kiến nghị 51 1. Kiến nghị 52 Mục lục 1: Các phổ của hợp chất EA3.2 53 Mục lục 1: Các phổ của hợp chất EA5.3 54 Tài liệu tham khảo 55 7 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Cosy COrrelation SpectroscopY d Doublet (mũi đôi). dd Doublet-doublet (mũi đôi-đôi). DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat Glc Glucopyranosyl.
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation H2SO4 Acid sulfuric Hz/MHz Hertz / MegaHertz (đơn vị tần số). IR Infra red (quang phổ hồng ngoại) J Hằng số ghép cặp (coupling constant, phổ 1H-NMR). KOH Kali hydroxyd MeOH Methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy PĐ Phân đoạn Rf Retardation factors. STT Số thứ tự.
SKLM Sắc kí lớp mỏng t Triplet (mũi ba) TT Thuốc thử TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultraviolet, tử ngoại. 8 DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ HÌNH SỐ TÊN SƠ ĐỒ TRANG 1 Quy trình chiết dịch chấm sắc kí hợp chất saponin của loài Bảy 23 lá một hoa ở Kon Tum 2 Sơ đồ điều chế cao tổng 38 3 Sơ đồ điều chế các cao phân đoạn 39 4 Quá trình cô lập hợp chất EA3.3 41 SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1 Cây Bảy lá một hoa thu hái ở Kon Tum 27 2 Các thành phần của loài Paris yunanensis Franch 28 3 Đặc điểm vi phẩu thân rễ Bảy lá một hoa 30 4 Đặc điểm vi phẩu thân Bảy lá một hoa 32 5 Đặc điểm vi phẩu lá Bảy lá một hoa 34 6 Các cấu tử bột thân rễ Bảy lá một hoa 35 7 Sắc kí đồ SKLM định tính saponin trong loài Bảy lá một hoa 37 8 Sắc kí đồ SKLM các cao phân đoạn 40 9 Sắc kí đồ SKLM các phân đoạn tách từ cao ethyl acetate 42 10 Sắc kí đồ SKLM hợp chất EA3.2 cô lập từ phân đoạn 3 cao ethyl 42 acetate 11 Sắc kí đồ SKLM hợp chất EA5.3 cô lập từ phân đoạn 5 cao ethyl 43 acetate 9 DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1 Các phân đoạn tách từ cao ethyl acetate 26 2 Độ ẩm thân rễ Bảy lá một hoa 36 3 Kết quả định tính saponin bằng phản ứng hóa học 36 4 Kết quả định lượng saponin toàn phần có trong dược liệu 38 5 So sánh phổ 13C –NMR của EA3.2 với Sc2, stigmasterol 3-O- β- 45 D-glucopyranoside và β -sitosterol-3-O- β-D-glucopyranoside 10 BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ ĐÃ CHI Tên đề tài: “Định danh tên khoa học và phân lập hợp chất saponin steroid của loài Bảy lá một hoa ở Kon Tum (Paris. Chủ nhiệm đề tài: CN. Lâm Bích Thảo Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trẻ.
Thời gian đăng kí trong hợp đồng: 12/2012 đến 12/2013 Tổng kinh phí được duyệt: 80.000đ (Tám mươi triệu đồng) Kinh phí cấp giai đoạn 1: 74.000đ (Bảy mươi bốn triệu bảy trăm năm mươi nghìn đồng) Kinh phí cấp giai đoạn 2: 5.000đ (Năm triệu hai trăm năm mươi nghìn đồng) TT Nội dung Kinh phí Trong đó Ngân sách Nguồn khác I Kinh phí được cấp trong năm 80.000 II Kinh phí quyết toán trong năm 80.000 2 Công thuê khoán 25.000 3 Nguyên, nhiên, vật liệu, dụng cụ, 30.000 phụ tùng, văn phòng phẩm 4 Thiết bị 5 Xét duyệt, giám định, nghiệm thu 16.000 6 Hội nghị, hội thảo 7 Đánh máy tài liệu 8 Giao thông liên lạc 9 Chi phí điều hành III Tiết kiệm 5% IV Kinh phí chuyển sang năm sau 11 I- TỔNG QUAN 1. Đại cương về thực vật học [6], [7],[8],[9],[10] 1. Vị trí phân loại thực vật học Giới thực vật Ngành Mộc lan (Magnoliophyta) Lớp hành (Liliopsida) Phân lớp hành (Liliidae) Bộ củ nâu (Dioscoreales) Họ Trọng Lâu (Trilliaceae) Chi Paris Paris polyphylla Smith 1. Đặc điểm thực vật họ Trọng Lâu (Trilliaceae) Họ thực vật hạt kín một lá mầm, cây thảo, thân rễ ngắn, dày, mọc riêng rẽ, ở gốc có một số lá thoái hoá.
Lá mọc thành vòng ở đỉnh, hình mũi mác hoặc bầu dục. Hoa lưỡng tính, thuỳ bao hoa rời, số nhị bằng số thuỳ hoa, bao phấn đính gốc. Bầu trên, 1 ống. Quả mọng hoặc nang.
Phân bố trên thế giới có 4 chi, 50 loài, chủ yếu ở bắc ôn đới. Ở Việt Nam có 1 chi, 5 loài, phổ biến là Bảy lá một hoa (Paris polyphylla), cây thảo nhỏ, sống lâu năm, thân rễ ngắn chia nhiều đốt. Hoa mọc ở ngọn cành, đầu cuống dài 15 - 12 30 cm, thường có 7 lá đài như cái lá; bao phấn vàng nâu, bầu tím, 3 ngăn. Cây mọc rải rác ở Lào Cai, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình, Hà Giang.
Thân rễ có thể dùng làm thuốc chữa sốt, mụn nhọt, giảm tính độc của nọc rắn. Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa Tên thường gọi: Bảy lá một hoa, thất diệp nhất chi hoa, tảo hưu, cúa dô (H’Mông). Tên khoa học: Paris polyphylla Smith. Tên đồng nghĩa: Daiswa polyphylla (Smith) Raf.
Tên nước ngoài: Parisette, Herbe- Paris (Pháp). Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,5- 0,7m. Thân rễ mập, chia nhiều đốt, có những ngấn ngang và sẹo to. Thân thẳng đứng, cao đến 1m, không phân nhánh, màu lục hoặc hơi tím, giữa than có một tầng lá mọc vòng từ 6-8 cái, thường là 7, lá hình trứng- bầu dục hoặc mác thuôn, dài 15- 20cm, rộng 8-10cm, gốc tròn hoặc hình tim, đầu nhọn, mép nguyên, mặt dưới màu lục nhạt hoặc hơi tím đỏ; có 3 gân, cuống lá dài.
Hoa mọc đơn độc ở ngọn than, cách tầng lá khoảng 15-30cm; lá dài hình mác màu lục nom như lá; cánh hình sợi màu vàng, bằng hoặc hơi ngắn hơn lá đài; nhị nhiều, mảnh, có bao phấn màu vàng nâu; bầu màu tím đỏ có 3 ô. Quả mọng, màu tím đen; hạt to màu vàng. Mùa hoa: tháng 3-7; mùa quả: tháng 8-12. Phân bố, sinh thái Paris L.
là một chi nhỏ, hiện chỉ có khoảng 10 loài, phân bố ở vùng cận nhiệt đới hoặc ôn đới ấm Bắc bán cầu. Ở Việt Nam, có 6-7 loài, hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc và đều được dùng làm thuốc. Loài Bảy lá một hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Smith, thực ra rất hiếm gặp ở Việt Nam. Các điểm đã thu được mẫu vật gồm có Mộc Châu (Sơn La), Đồng Văn (Hà Giang), và một số điểm phân bố khác, nhưng chưa có điều kiện kiểm chứng lại chắc chắn.
Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma (Nguyễn Thị Đỏ, 1995). 13 Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn. Phần thân trên mặt đất lụi hàng năm vào cuối mùa thu. Thân rễ mang 1-2 chồi ngủ tồn tại qua đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau.
Trong tự nhiên, thường chỉ có những cây lớn với chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa quả. Bảy lá một hoa và những loài khác cùng chi là những cây thuốc thuộc diện quý hiếm ở Việt Nam. Do nạn phá rừng làm thu hẹp môi trường sống, gần đây lại bị thu gom bán qua biên giới, nguy cơ tuyệt chủng của chúng càng thêm gay gắt. Bảo tồn các loài bảy lá một hoa đang là một yêu cầu cấp thiết.
Thành phần hóa học Trên thế giới Những nghiên cứu dưới đây được thực hiện trên những đối tượng cùng chi với loài Bảy lá một hoa: Năm 1982, Sheo B.Singh và cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất spirostanol saponin, gồm polyphyllin C, D, E và F [1], 2 hợp chất furostanol saponin là polyphyllin G và H [2]. Năm 2008, Dawei Deng và cộng sự đã phân lập được 3 saponin steroid (25R)- spirost-5-ene-3β,17α-diol (pennogenin) 3-O-{O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-O-[α-L- arabinofuranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside} và (25R)-spirost-5-ene- 3β,17α-diol (pennogenin) 3-O-{O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside}; (25R)-spirost-5-ene-3β,17α-diol (pennogenin) 3-O-{O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-xylopyranosyl-(1→5)-α-L- arabinofuranosyl- (1→4)]-β-D-glucopyranoside} [6]. Năm 2009, Yu Zhao và cộng sự đã cô lập được 21 hợp chất steroid glycoside gồm: Th, dichotomin, parisaponin I, progracillin, pseudoproto-Pb, pennogenin-3-O-α- L- arabinofuranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D- glucopyranoside, Tg, Tb, pennogenin-3- O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β- D- 14 glucopyranoside, parisvientnaside A, Pa, Pb, gracillin, pennogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside, diosgenin-3-O-α-L-arabinofuranosyl- (1→4)-β-D-glucopyranoside, prosapogenin A của dioscin, reclinatoside, và loureiroside [7]. Năm 2012, Li-Ping Kang và cộng sự đã phân lập được 3 saponin steroid là parisyunnanoside G – I cùng với parisyunnanoside J, padelaoside B, pinnatasterone, và 20 – hydroxyecdyson từ loài Paris polyphylla Smith var.