CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh truyền nhiễm do Escherichia coli (E. coli) là bệnh quan trọng, phổ biến trên gia cầm và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi (Kikuyasu Nakamura, 2000; Ewers et al., 2003; Nolan et al. Bệnh làm tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và tăng tỷ lệ gia cầm loại thải (Barnes et al.
Bệnh có thể được điều trị bằng kháng sinh, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh thiếu thận trọng ở người và vật nuôi có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh (Helmy et al. coli có tính linh hoạt di truyền và khả năng thích ứng nhanh với môi trường nên nó dễ hình thành nhiều cơ chế đề kháng với kháng sinh. coli có mặt khắp nơi trong đường tiêu hóa của động vật máu nóng nên được xem là vi khuẩn chỉ thị để theo dõi tình trạng đề kháng kháng sinh ở động vật (bao gồm cả gia cầm) (European Food Safety Authority, 2019; Anjum et al. Đề kháng kháng sinh được xem là vấn đề nghiêm trọng, đe dọa đến sức khỏe toàn cầu.
Theo báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), đề kháng kháng sinh là nguyên nhân hàng đầu khiến hơn 25.000 người ở Châu Âu và thậm chí hơn 700.000 người trên thế giới đã chết mỗi năm do nhiễm trùng mà không thể điều trị được bằng kháng sinh, do vi khuẩn kháng thuốc. Các tiên lượng cho biết hậu quả sẽ còn tồi tệ hơn, nếu tình trạng đề kháng kháng sinh vẫn tiến triển như hiện tại thì đến năm 2050, đề kháng kháng sinh sẽ gây ra khoảng 10 triệu ca tử vong mỗi năm, vượt qua cả ung thư - là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới hiện nay (O’Neill, 2014; Kraker et al. Một số nghiên cứu gần đây về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ở Việt Nam cho thấy mức độ sử dụng kháng sinh rất cao (lượng kháng sinh sử dụng tính theo đầu gia cầm cao gấp 6 lần so với mức ghi nhận được ở một số nước châu Âu); trong đó có đến 84% kháng sinh được sử dụng để phục vụ cho mục đích phòng bệnh (Carrique Mas et al. Trong một khảo sát tại tỉnh Tiền Giang cho thấy có đến 72% số trại chăn nuôi sử dụng ít nhất một loại kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho gà.
Đặc biệt, một số loại kháng sinh quan trọng trong điều trị bệnh cho con người cũng được dùng trong chăn nuôi (Nguyen Van Cuong et al. Tại thành phố Hồ Chí Minh, có đến 32,6% cơ sở nuôi gà thịt sử dụng kháng sinh không hợp lý và 44,5% các cơ sở không ngừng sử dụng thuốc kháng sinh trước khi giết thịt đúng theo quy định (Võ Thị Trà An và ctv. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý sẽ tạo ra các sản phẩm chăn nuôi không đảm bảo an toàn cho người sử dụng, dễ dẫn đến sự phát sinh và phát triển tính kháng thuốc của vi khuẩn (Asokan & Kasimanickam, 2013). Ngoài ra, một số chủng E.
coli lưu trú trên gia cầm còn là nguồn gen tiềm ẩn đề kháng kháng sinh có thể lây truyền sang người (Lutful Kabir, 2010; Kheiri & Akhtari, 2016). 1 Hiện nay, có nhiều giải pháp thay thế kháng sinh như: probiotic, prebiotic, axít hữu cơ, tinh dầu, enzyme, chất kích thích miễn dịch và phytogenic (phytobiotic) bao gồm các loại thảo mộc, tinh dầu thực vật. được bổ sung vào trong thức ăn gia cầm ngày càng phổ biến và đóng vai trò cải thiện lượng ăn vào, tăng hệ số chuyển hóa thức ăn, cải thiện khả năng miễn dịch, cũng như khả năng hấp thu dưỡng chất và khả năng kháng khuẩn,. giúp giảm thiểu tình trạng lạm dụng kháng sinh, đồng thời góp phần mang lại hiệu quả trong điều trị bệnh E.
coli và các bệnh nhiễm khuẩn cho gia cầm (Mohamed et al. Trong hệ tiêu hóa của động vật, các loài vi sinh vật và các chủng vi khuẩn hội sinh thường xuyên bị tác động bởi kháng sinh trong quá trình sản xuất; quần thể vi sinh vật luôn có sự tương tác qua lại với nhau trong hệ thống tiêu hóa. Vì vậy, cơ chế tác động, kiểu gen và kiểu hình đề kháng kháng sinh diễn biến rất phức tạp, không chỉ dựa trên một hoặc một vài chủng vi khuẩn. Sự tương tác của các vi sinh vật và kháng sinh ở động vật còn nhiều vấn đề cần được sáng tỏ do sự đa dạng về liều lượng, đường dùng và dược lực học của từng loại kháng sinh thay đổi tùy theo vật chủ, khiến cho bức tranh về đề kháng kháng sinh trở nên phức tạp hơn (Luo et al.
Các nghiên cứu trước đây thường chỉ khảo sát sự đề kháng của một vài chủng vi khuẩn riêng lẻ, trong khi sự đề kháng kháng sinh ở cấp độ quần thể chưa được nghiên cứu. Ngoài ra, các nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn theo thời gian, đặc biệt là E. coli trên các loài vật nuôi, cũng như trên gia cầm còn rất ít. Vấn đề đặt ra là sau thời gian sử dụng kháng sinh hay các sản phẩm thay thế kháng sinh có gây ra sự đề kháng ở vi khuẩn hoặc làm giảm tính đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli và thử nghiệm sản phẩm thay thế kháng sinh trong phòng, trị bệnh Escherichia coli trên gà tại tỉnh Đồng Tháp”. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của hệ vi sinh vật đường ruột thông qua sự hiện diện của các gen đề kháng ở vi khuẩn trên gà và chuột, khảo sát hiệu quả của một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli cho gà cũng như tiềm năng thay thế kháng sinh trong chăn nuôi. 2 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát hiện Vi khuẩn E.
coli được phân lập lần đầu tiên từ phân trẻ em vào năm 1885 bởi nhà khoa học Theodore Escherich (1857-1911), vi khuẩn được xếp loại vào ngành Proteobacteria, lớp Gamma proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài Escherichia coli (Scheutz & Strockbine, 2005). Trên gia cầm, E. coli được Lignieres phân lập lần đầu tiên từ tim, gan và lách của gà chết vào năm 1894. Từ năm 1894 đến năm 1922, bệnh được phát hiện trên gà gô trắng, bồ câu, thiên nga, gà tây, chim cút.
Ngoài ra, bệnh nhiễm trùng máu do E. coli trên những gà chết có triệu chứng giống như bệnh tụ huyết trùng đã được báo cáo lần đầu vào năm 1907. (Barnes et al. Lignieres cho rằng trong những điều kiện nhất định, E.
coli thường trú trong ruột rời khỏi ruột trở nên có độc lực và gây bệnh nhiễm trùng máu ở gà đẻ, đặc biệt nếu sức đề kháng của gà bị giảm do đói, khát, lạnh hoặc môi trường chăn nuôi thiếu thông thoáng. coli gây bệnh viêm ruột trên gà đã được mô tả và phân lập. coli được mô tả và phân lập ở nhiều bệnh tích khác nhau như: bệnh u hạt, viêm túi khí, viêm khớp, viêm da, viêm cuống rốn, viêm mắt, viêm phúc mạc và viêm ống dẫn trứng (Barnes et al.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2-3 μm x 0,6 μm.
coli có hình cầu đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong các môi trường nuôi cấy khác nhau, vi khuẩn dài 4-8 μm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng cũng có một số không di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt (Hirsh, 2004).
coli phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trên môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 18-44oC, pH từ 7,2-7,4. coli lên men carbohydrate và thường sinh khí. Thời gian tăng sinh và số lượng E. coli trong thời gian phát triển có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy.
coli phát triển tốt trên các môi trường MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB) hình thành nên các khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các vi khuẩn khác. Trên môi trường MC vi khuẩn E. coli lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, không nhầy, viền gọn được bao quanh vòng đục, kích thước từ 2-3 mm; những vi khuẩn E. coli không lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc có màu nhạt.
Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi bóng, màu tím sẫm, có ánh kim (Barnes et al. Ngoài ra, vi khuẩn E. coli có thể được nuôi cấy trên môi trường Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) có chứa chất BCIG (5-bromo-4-chloro-3- 3 indolyl-D-glucuronic axít) hay còn gọi với tên khác là X-glucuronide, sự xuất hiện của enzyme β-D-Glucuronidase do E.
coli tạo ra sẽ cắt đứt liên kết giữa 5-bromo-4-chloro-3- indolyle (chrompohore) và D-glucuronide. Dưới tác nhân oxy hóa, các phân tử chrompohore phản ứng với nhau tạo thành dichloro-dibromo indigo, chính những phân tử dichloro-dibromo indigo này tạo nên màu xanh lá đặc trưng của khuẩn lạc E.3 Đặc tính sinh hóa Một số thử nghiệm sinh hóa phổ biến dùng để định danh E. coli được thực hiện như: thử nghiệm Indole (I) dương tính; Methyl Red (MR) dương tính; Voges – Proskauer âm tính (Mion et al., 2016); không sử dụng citrate (Ci); không sinh H2S, di động, lên men đường lactose, glucose, sinh khí trên môi trường Kligler Iron Agar (Mac Faddin, 2000). Thử nghiệm Indol: những vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng phân giải tryptophan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol.
Indol khi kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s sẽ tạo thành hợp chất muối dimethulammonium có màu đỏ, kết quả phản ứng Indole dương tính. Thử nghiệm MR: các vi khuẩn đường ruột thường có khả năng lên men đường glucose tạo thành axít pyruvic. Axít pyruvic lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại axít hữu cơ khác như: axít acetic, axít lactic, axít succinic, làm cho pH của môi trường nuôi cấy vi khuẩn hạ thấp xuống dưới 4,5. Chất chỉ thị MR giúp nhận biết độ pH của môi trường nuôi cấy sau khi vi khuẩn lên men glucose.
Khi nhỏ chất chỉ thị MR vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chất chỉ thị MR vẫn giữ màu đỏ là phản ứng dương tính, chất chỉ thị MR chuyển sang màu vàng là phản ứng âm tính.