Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobaccilus pleuropneumoniae pasteurella multocida và streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nông nghiệp nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobaccilus, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong

• Tác giả: Đỗ Tất Đạt
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Trích yếu luận án
• 1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu chung
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. Tổng quan tài liệu
• 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh
• 2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh
• 2.3. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi ở lợn
• 2.3.1. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn
• 2.4. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh viêm phổi ở lợn
• 2.4.1. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 2.5. Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn
• 2.5.1. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn
• 2.6. Các chất bổ trợ thường dùng trong sản xuất vacxin
• 2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin
• 2.6.2. Muối khoáng
• 2.6.3. Chất nhũ tương
• 2.6.4. Các chất cao phân tử
• 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra
• 3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. Kết quả và thảo luận
• 4.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra
• 4.1.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra
• 4.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 4.1.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra
• 4.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra
• 4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra
• 4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra
• 4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra
• 4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra
• 4.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra
• 4.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm
• 4.3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A.
• 4.3.4. Kết quả xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn
• 4.3.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn
• 4.3.6. Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn
• Kết luận và đề nghị
• Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm sốt, khó thở, ho, hắt hơi và bỏ ăn. Bệnh tích đại thể cho thấy viêm dính phổi, thành ngực và sự xuất hiện của bọt khí nhầy lẫn máu trong khí quản. Viêm phổi ở lợn do các vi khuẩn này gây ra thường dẫn đến tử vong nhanh chóng, đặc biệt ở lợn sau cai sữa.

1.1. Triệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh bao gồm sốt cao, khó thở, ho khan và hắt hơi liên tục. Lợn thường bỏ ăn và có biểu hiện suy nhược nhanh chóng. Viêm phổi ở lợn do Actinobacillus pleuropneumoniae còn gây ra hiện tượng viêm dính phổi và thành ngực, làm giảm khả năng hô hấp.

1.2. Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đại thể cho thấy phổi bị viêm dính, thành ngực có hiện tượng xuất huyết và bọt khí nhầy lẫn máu trong khí quản. Pasteurella multocida gây viêm phổi thùy, trong khi Streptococcus suis gây viêm màng não và viêm khớp. Các bệnh tích này là cơ sở để chẩn đoán và điều trị bệnh.

II. Hiệu quả vacxin phòng bệnh

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả vacxin trong việc phòng ngừa viêm phổi ở lợn do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis. Vacxin phòng bệnh được sản xuất dưới dạng đa giá vô hoạt nhũ dầu, đạt hiệu quả cao trong việc tạo miễn dịch cho lợn. Kết quả cho thấy vacxin giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở lợn.

2.1. Quy trình sản xuất vacxin

Quy trình sản xuất vacxin phòng bệnh bao gồm các bước: sản xuất kháng nguyên từ Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis, pha trộn với nhũ dầu IMS để tạo bán thành phẩm. Bán thành phẩm được kiểm nghiệm về độ vô trùng, an toàn và hiệu lực trước khi đưa vào sử dụng.

2.2. Hiệu quả phòng ngừa

Hiệu quả phòng ngừa của vacxin được đánh giá thông qua khả năng tạo kháng thể và giảm tỷ lệ mắc bệnh. Lợn được tiêm vacxin từ 21 ngày tuổi cho thấy khả năng miễn dịch cao, giảm đáng kể các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể. Vacxin cũng được khuyến cáo sử dụng cho lợn nái chửa và lợn đực giống để tăng cường miễn dịch.

III. Ứng dụng thực tiễn và ý nghĩa

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng bệnh viêm phổi ở lợn, giúp giảm thiệt hại kinh tế trong ngành chăn nuôi. Vacxin phòng bệnh được sản xuất từ nghiên cứu này có thể áp dụng rộng rãi tại các trang trại chăn nuôi lợn ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần vào việc phát triển các loại vacxin đa giá hiệu quả cao trong tương lai.

3.1. Ứng dụng trong chăn nuôi

Vacxin phòng bệnh được áp dụng tại các trang trại chăn nuôi lợn, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Lợn được tiêm vacxin từ 21 ngày tuổi cho thấy sức khỏe ổn định và tăng trưởng tốt. Việc sử dụng vacxin cũng giúp giảm chi phí điều trị và nâng cao năng suất chăn nuôi.

3.2. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về đặc điểm bệnh lý và cơ chế gây bệnh của Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis. Kết quả nghiên cứu cũng mở ra hướng phát triển các loại vacxin đa giá hiệu quả cao, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi lợn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh đường hô hấp ở lợn là một trong những nhóm bệnh truyền nhiễm gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi tại Việt Nam và trên thế giới. Sau biến cố dịch tả lợn châu Phi năm 2019–2020, tổng đàn lợn của Việt Nam vẫn duy trì ở quy mô khoảng 20 triệu con (Tổng cục Thống kê, 2020), song các bệnh truyền nhiễm kế phát trên đường hô hấp thuộc hội chứng rối loạn hô hấp phức hợp (PRDC) vẫn diễn biến phức tạp. Trong số các tác nhân vi khuẩn gây bệnh, ba loài vi khuẩn gồm Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis là những căn nguyên chủ yếu gây viêm phổi, viêm màng phổi, nhiễm trùng huyết và tỷ lệ chết cao ở lợn mọi lứa tuổi, đặc biệt là giai đoạn sau cai sữa.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả luận án chỉ ra xuất phát từ thực tiễn phòng chống bệnh tại thực địa. Các loại vacxin thương mại nhập ngoại hiện hành (như Porcilis, M+PAC, Bayovac SuiShot, Coglapix, Hyogen) có giá thành cao và các chủng vi khuẩn sử dụng sản xuất chưa hoàn toàn phù hợp với các serotype đang lưu hành tại các trang trại chăn nuôi ở Việt Nam. Ở trong nước, vacxin đa giá vô hoạt phòng ba loại vi khuẩn trên trước đây chủ yếu sử dụng chất bổ trợ keo phèn (nhôm hydroxit), kế thừa từ dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước năm 2014 do Công ty Cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất. Tuy nhiên, vacxin bổ trợ keo phèn bộc lộ hạn chế về hiệu lực bảo hộ, mức độ đáp ứng miễn dịch và thời gian duy trì kháng thể bảo hộ chưa dài. Tại thời điểm nghiên cứu, Việt Nam chưa có vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu kết hợp đồng thời ba loài vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định rõ ràng thành hai cấp độ:

1. Mục tiêu chung: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Mục tiêu 1: Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.
   • Mục tiêu 2: Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của công trình bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu: Bộ giống vi khuẩn giống gốc (Master seed) gồm A. pleuropneumoniae (các serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (các serotype A, D) và S. suis (serotype 2) lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin - Công ty CP thuốc thú y Marphavet; lợn mắc bệnh viêm phổi và lợn thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm.
• Phạm vi nội dung: Đánh giá đặc tính vi sinh vật học, sinh hóa, cấu trúc kháng nguyên, các gen quy định độc lực và độc tính của các chủng vi khuẩn giống; xây dựng quy trình nuôi cấy lên men sục khí, bất hoạt, tạo nhũ với chất bổ trợ Montanide IMS, kiểm nghiệm an toàn, hiệu lực và phác đồ sử dụng vacxin.
• Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin và nhà máy sản xuất vacxin đạt tiêu chuẩn GMP-WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet, cùng một số cơ sở chăn nuôi lợn tại thực địa.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về ba mầm bệnh vi khuẩn đường hô hấp ở lợn cũng như công nghệ chất bổ trợ vacxin:

Về Actinobacillus pleuropneumoniae, bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison và cs. ghi nhận năm 1957, sau đó Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính tại Argentina dưới tên gọi Haemophilus pleuropneumoniae. Dựa trên phân tích DNA, Pohl và cs. đã xếp vi khuẩn vào chi Actinobacillus. Vi khuẩn có 15 serotype phân bố theo vùng địa lý; trong đó các serotype 1, 5, 9, 11 và 12 có độc lực cao, còn serotype 3 và 6 có độc lực thấp. Frey và cs. (1993) đã chứng minh ba ngoại độc tố thuộc họ RTX (ApxI, ApxII, ApxIII) được mã hóa bởi cụm gen apx (apxIC, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD) là yếu tố độc lực chính phá hủy đại thực bào phế nang và tế bào nội mô. Về thiệt hại kinh tế, Krejci và cs. ghi nhận tỷ lệ chết ở thể cấp tính có thể lên tới 15%; Rohrbach và cs. chỉ ra thể mãn tính làm giảm 84 g tăng trọng/ngày và kéo dài thời gian nuôi thêm 6 ngày. Các nghiên cứu về vacxin của Nielsen (1985), Jolie và cs. (1995), Higgins và cs. (1985) cho thấy vacxin vô hoạt toàn khuẩn thế hệ đầu có khả năng bảo hộ chéo kém giữa các serotype; trong khi các nghiên cứu vacxin tiểu phần RTX của Van Den Bosch và Frey (2003), Van Overbeke và cs. (2002), Cruijsen và cs. (1995) cùng các tiếp cận vacxin nhược độc (Prideaux và cs., 1998; Tonpitak và cs., 2009) hay vacxin ADN (Ramjeet và cs., 2008a) vẫn gặp những rào cản nhất định về an toàn sinh học hoặc chi phí sản xuất.

Về Pasteurella multocida, Carter (1967) đã phân loại vi khuẩn thành 5 serotype kháng nguyên giáp mô (A, B, D, E, F) và 16 serotype kháng nguyên thân. Trong bệnh học lợn, serotype A và D là phổ biến nhất gây viêm phổi thùy và viêm teo mũi tiến triển (PAR). Khảo sát của Bahnson (1994) tại Mỹ cho thấy 74% lợn có bệnh tích viêm phổi và 13% viêm màng phổi khi kiểm tra tại lò mổ. Các nghiên cứu của Pijoan và cs. (1984), Kielstein (1986), Jacques và cs. (1991), Jacques và Foiry (1987), Pijoan và Trigo (1990) đã làm sáng tỏ cơ chế bám dính của vi khuẩn lên lớp dịch nhầy và biểu mô đường hô hấp khi lợn bị cảm nhiễm kế phát sau Mycoplasma hyopneumoniae hoặc các virus đường hô hấp.

Về Streptococcus suis, De Moor (1963) phân lập và xếp vi khuẩn vào các nhóm Lancefield R, S, RS, T; Elliott (1966) và Windsor & Elliott (1975) đề xuất tên gọi S. suis serotype 1 và serotype 2; Kilpper-Bälz và Schleifer (1987) chính thức công nhận S. suis là loài riêng biệt. Đến nay đã có 35 serotype được ghi nhận (Perch và cs., 1983; Gottschalk và cs., 1989). Các nghiên cứu dịch tễ của Clifton-Hadley (1984), Kataoka và cs. (1993), Higgins và Gottschalk (1996) khẳng định serotype 2 chiếm ưu thế toàn cầu, gây các bệnh cảnh đa dạng như viêm màng não, viêm khớp, bại huyết và viêm phổi ở lợn sau cai sữa (3–16 tuần tuổi). Nghiên cứu của Wisselink và cs. (2001) chỉ rõ vacxin vô hoạt vi khuẩn S. suis sử dụng chất bổ trợ nhũ tương nước trong dầu cho hiệu quả kích thích miễn dịch vượt trội so với chất bổ trợ nhôm hydroxit.

Tại Việt Nam, các công trình của Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007), Bùi Quang Anh và cs. (2008), Cù Hữu Phú (2005, 2011), Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2017), Lê Văn Dương (2013), Phan Kim Thanh và cs. (2018), Bùi Thị Hiền và cs. (2015) đã xác định cơ cấu vi khuẩn gây PRDC tại các vùng chăn nuôi trọng điểm gồm: A. pleuropneumoniae (chủ yếu là serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (serotype A, D) và S. suis (serotype 2). Về vacxin học, nghiên cứu của Khương Thị Bích Ngọc (1996) chế tạo vacxin cầu khuẩn keo phèn đạt tỷ lệ bảo hộ 70–80%; tuy nhiên vacxin đa giá phối hợp cả ba loài vi khuẩn ở dạng nhũ dầu có độ dài miễn dịch cao vẫn chưa được sản xuất hoàn chỉnh trong nước.

Vị trí của luận án được xác lập tại điểm giao thoa giữa nhu cầu thực tiễn dịch tễ học thú y Việt Nam và công nghệ bào chế vacxin: thay thế chất bổ trợ keo phèn truyền thống bằng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS nhằm nâng cao hiệu giá kháng thể, kéo dài thời gian bảo hộ trên đàn lợn và làm chủ quy trình sản xuất vacxin vô hoạt đa giá ở quy mô phòng thí nghiệm tiến tới sản xuất công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án được triển khai trên nền tảng lý thuyết bệnh lý học truyền nhiễm, miễn dịch học thú y và công nghệ vi sinh - vacxin học hiện đại.

Khung phân tích miễn dịch học dựa trên lý thuyết về cơ chế tác động của chất bổ trợ nhũ dầu: chất bổ trợ Montanide IMS (vi nhũ tương nước tích hợp do hãng Seppic - Pháp sản xuất) đóng vai trò chất mang tạo hiệu ứng kho (depot effect), giúp phóng thích kháng nguyên chậm và bền vững tại vị trí tiêm; tăng cường thu hút các tế bào trình diện kháng nguyên (APC); kích hoạt các phân tử đồng kích thích và phức hợp tương hợp mô chính (MHC lớp II); từ đó kích hoạt đồng thời đáp ứng miễn dịch dịch thể (tạo hiệu giá kháng thể IgG huyết thanh cao, kéo dài) và miễn dịch qua trung gian tế bào mạnh hơn so với các muối khoáng vô cơ (nhôm hydroxit/keo phèn).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế bao gồm:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Công cụ cụ thể	Mục đích thực hiện
Vi sinh vật học	- Nuôi cấy trên môi trường thạch máu (bổ sung NAD, cấy vạch tụ cầu S. aureus), BHI, TSB, THB, TYE, TW. - Nhuộm soi kính hiển vi quang học. - Giám định sinh hóa: Catalase, Oxidase, Indol, Urease, khả năng lên men các loại đường.	- Xác định đặc tính hình thái, đặc tính nuôi cấy và tính chất sinh hóa của các chủng giống vi khuẩn.
Sinh học phân tử	- Phản ứng PCR khuếch đại gen omlA và các gen quy định ngoại độc tố RTX (apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD) của A. pleuropneumoniae. - Phản ứng multiplex PCR xác định serotype A và D của P. multocida. - PCR xác định gen gdh (theo TCVN 8400-2:2010), các gen độc lực (sly, mrp, arcA) và xác định serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis.	- Giám định độ thuần khiết di truyền, xác định serotype và kiểm tra sự hiện diện của các yếu tố độc lực ở mức độ phân tử của bộ giống sản xuất.
Bệnh lý học thực nghiệm	- Gây nhiễm thực nghiệm trên lợn khỏe mạnh và chuột nhắt trắng. - Mổ khám bệnh tích đại thể, ghi nhận triệu chứng lâm sàng và chỉ số bệnh lý.	- Đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn giống; mô tả biến đổi bệnh lý đặc trưng do từng loài vi khuẩn gây ra.
Công nghệ sản xuất vacxin	- Nuôi cấy sinh khối bằng hệ thống lên men sục khí. - Vô hoạt vi khuẩn bằng Formalin. - Phối trộn kháng nguyên đa giá với chất bổ trợ Montanide IMS.	- Thiết lập quy trình tạo bán thành phẩm và thành phẩm vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu.
Kiểm nghiệm vacxin	- Kiểm tra vô trùng, thuần khiết trên môi trường nuôi cấy. - Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng và lợn. - Thử hiệu lực bảo hộ trên chuột nhắt trắng (phương pháp thay thế) và trên lợn (phương pháp trọng tài). - Định lượng hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA. - Thử nghiệm độ ổn định bảo quản ở nhiệt độ 18–25°C và 4–8°C.	- Đánh giá chất lượng bán thành phẩm và thành phẩm; so sánh đáp ứng miễn dịch giữa vacxin nhũ dầu và vacxin keo phèn; xác định liều tiêm và độ bền sinh học của vacxin.
Xử lý số liệu	- Phương pháp thống kê sinh học trong thú y, xác định tỷ lệ phần trăm (%), giá trị trung bình, khoảng tin cậy (95% CI).	- Phân tích, đánh giá độ tin cậy của các chỉ tiêu miễn dịch và hiệu lực bảo hộ.

Nguồn dữ liệu của luận án là số liệu thực nghiệm gốc thu nhận trực tiếp từ các lô thí nghiệm trên động vật (chuột nhắt trắng, lợn), các kết quả điện di sản phẩm PCR, kết quả đo quang phổ ELISA và các biên bản kiểm nghiệm chất lượng vacxin theo quy chuẩn thú y hiện hành.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày hệ thống hóa cơ sở lý luận và tình hình nghiên cứu về ba loài vi khuẩn đường hô hấp ở lợn (A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis) trên quy mô quốc tế và tại Việt Nam. Luận án phân tích sâu về hình thái học, phân loại serotype, cấu trúc kháng nguyên thân, kháng nguyên giáp mô và các độc tố chính: độc tố RTX của A. pleuropneumoniae, độc tố dermonecrotic của P. multocida, cùng các yếu tố độc lực suilysin (sly), protein giải phóng muramidase (mrp) của S. suis. Chương 1 cũng phân tích lịch sử phát triển các loại vacxin phòng bệnh đường hô hấp ở lợn (vacxin toàn khuẩn vô hoạt, vacxin bóng vi khuẩn, vacxin tiểu phần, vacxin nhược độc, vacxin ADN), đồng thời tổng kết cơ chế tác động của các hệ chất bổ trợ muối khoáng (keo phèn) và chất bổ trợ nhũ tương (Montanide ISA, Montanide IMS, Montanide GEL), qua đó làm rõ tính tất yếu của việc phát triển vacxin đa giá nhũ dầu tại Việt Nam.

Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu nghiên cứu gồm các chủng giống gốc A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (serotype A, D) và S. suis (serotype 2); động vật thí nghiệm (lợn con, lợn nái, lợn đực giống và chuột nhắt trắng); các hóa chất, sinh phẩm, cặp mồi PCR và môi trường nuôi cấy. Chương này trình bày chi tiết các quy trình kỹ thuật: quy trình nuôi cấy giám định sinh hóa; quy trình phản ứng PCR và chu trình nhiệt cho từng loại mồi; quy trình gây bệnh thực nghiệm; quy trình nuôi cấy lên men sục khí; quy trình bất hoạt bằng dung dịch Formalin; công thức phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ Montanide IMS; phương pháp kiểm tra vô trùng, an toàn, hiệu lực bảo hộ và kỹ thuật ELISA xác định động thái kháng thể.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 là phần thực nghiệm trọng tâm của luận án, được chia thành các nhóm nội dung kết quả chính:

1. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm thực nghiệm

Các chủng vi khuẩn được lựa chọn để gây bệnh thực nghiệm trên lợn đều thể hiện độc lực cao, làm phát sinh bệnh cảnh cấp tính và gây chết động vật thí nghiệm trong thời gian ngắn:

• Lợn gây nhiễm A. pleuropneumoniae: Biểu hiện sốt cao, khó thở nghiêm trọng, thở thể bụng, ho, hắt hơi, bỏ ăn; khi mổ khám thấy bệnh tích đại thể đặc trưng là viêm dính màng phổi với thành ngực, xuất huyết và hoại tử nhu mô phổi, có nhiều dịch bọt khí nhầy lẫn máu tràn ngập trong khí quản.
• Lợn gây nhiễm P. multocida: Biểu hiện sốt cao, ho kéo dài, thở thể ngực - bụng, da vùng bụng và tai đỏ tím (do nhiễm độc tố); mổ khám thấy hiện tượng viêm phổi thùy điển hình, tổ chức phổi đông đặc chuyển màu từ đỏ sang xám xanh, ranh giới giữa vùng phổi bệnh và lành rõ rệt.
• Lợn gây nhiễm S. suis: Biểu hiện sốt, ho, thở khó, kèm theo các triệu chứng thần kinh rõ rệt (đi loạng choạng, run rẩy, co giật, nằm nghiêng co giật chân), sưng đau các khớp; bệnh tích mổ khám gồm viêm phổi, viêm khớp có dịch mủ, viêm màng não và màng não xung huyết.

2. Đánh giá tính ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản xuất vacxin

Bộ giống sản xuất gồm 6 chủng vi khuẩn thuộc ba loài đã được kiểm tra nghiêm ngặt qua nhiều đời cấy truyền:

• Đặc tính hình thái và sinh hóa: Các chủng A. pleuropneumoniae (2, 5a, 5b) thể hiện đặc tính phụ thuộc yếu tố V (NAD), tạo vòng dung huyết $\beta$ trên thạch máu khi cấy kèm tụ cầu; các chủng P. multocida (A, D) cho phản ứng Oxidase (+), Indol (+), Urease (-), không mọc trên MacConkey; chủng S. suis serotype 2 cho phản ứng Catalase (-), Oxidase (-), lên men Glucose, Lactose, Trehalose.
• Kết quả phân tích gen độc lực và serotype bằng PCR:
  • Chủng A. pleuropneumoniae mang gen omlA đặc hiệu; các chủng A1, A2, A3 mang đầy đủ các gen mã hóa độc tố Apx tương ứng với serotype (apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD).
  • Chủng P. multocida được định type chính xác bằng PCR: mẫu P4 thuộc serotype A, mẫu P5 thuộc serotype D.
  • Chủng S. suis (ký hiệu St) mang gen gdh, thuộc serotype 2 và mang đầy đủ các gen độc lực sly, mrp, arcA.
• Độc lực trên động vật thí nghiệm: Các chủng giống đều gây chết 100% chuột nhắt trắng ở liều thử nghiệm quy chuẩn và gây bệnh lý điển hình trên lợn, chứng minh tính ổn định sinh học và khả năng đáp ứng tiêu chuẩn giống sản xuất vacxin.

3. Nghiên cứu quy trình sản xuất và kiểm nghiệm vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

Luận án đã tối ưu hóa các thông số kỹ thuật sản xuất sinh khối bằng phương pháp lên men sục khí, giúp tăng mật độ vi khuẩn lên gấp nhiều lần so với nuôi cấy tĩnh truyền thống. Các lô giống đơn giá sau lên men đạt độ thuần khiết, vô trùng và mật độ vi khuẩn theo quy định trước khi vô hoạt bằng Formalin. Bán thành phẩm vacxin được chế tạo bằng cách phối trộn ba loại kháng nguyên đơn giá vô hoạt (A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis serotype 2) với chất bổ trợ Montanide IMS theo tỷ lệ tối ưu.

Kết quả kiểm nghiệm chất lượng vacxin bán thành phẩm và thành phẩm cho thấy:

• Độ thuần khiết và vô trùng: 100% các lô vacxin kiểm tra không có tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí hay nấm mốc.
• Độ an toàn: Thử nghiệm tiêm liều gấp đôi trên chuột nhắt trắng và lợn đều không gây phản ứng cục bộ nghiêm trọng, không hình thành ổ áp xe hay u hạt tại vị trí tiêm, con vật sinh trưởng bình thường.
• Hiệu lực bảo hộ: Thử nghiệm công cường độc bằng phương pháp thay thế trên chuột nhắt trắng và phương pháp trọng tài trên lợn chứng minh vacxin có khả năng bảo vệ đàn lợn chống lại sự xâm nhiễm của cả ba loài vi khuẩn cường độc.

4. So sánh đáp ứng miễn dịch giữa vacxin bổ trợ nhũ dầu và vacxin bổ trợ keo phèn

Kết quả phân tích huyết thanh học bằng kỹ thuật ELISA so sánh động thái hình thành kháng thể trên lợn thí nghiệm được tổng hợp trong bảng sau:

Tiêu chí so sánh	Vacxin đa giá bổ trợ keo phèn (Nhôm hydroxit)	Vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu (Montanide IMS)
Tốc độ sản sinh kháng thể	Kháng thể xuất hiện sớm từ ngày 7–10 sau tiêm.	Kháng thể xuất hiện ổn định từ ngày 10–14 sau tiêm.
Đỉnh cao hiệu giá kháng thể	Đạt đỉnh ở tuần thứ 3–4, sau đó giảm nhanh.	Đạt đỉnh cao hơn rõ rệt ở tuần thứ 4–6 và duy trì ở mức cao.
Thời gian duy trì miễn dịch bảo hộ	Kéo dài khoảng 3–4 tháng.	Kéo dài trên 6 tháng.
Phản ứng tại vị trí tiêm	Dễ xuất hiện u cục, lắng đọng muối khoáng cục bộ.	Phân tán tốt, mô liên kết phục hồi nhanh, không để lại tổn thương hạt.
Hiệu lực bảo hộ khi công cường độc	Đạt mức bảo hộ trung bình (70–80%).	Đạt tỷ lệ bảo hộ cao hơn đối với cả ba tác nhân gây bệnh.

5. Xây dựng quy trình sử dụng và bảo quản vacxin

• Quy trình tiêm phòng: Luận án xác định liều tiêm tối ưu là 2 ml/con tiêm bắp cho các đối tượng lợn:
  • Lợn con từ 21 ngày tuổi (sau cai sữa): Tiêm một mũi duy nhất 2 ml/con vào giai đoạn 21–28 ngày tuổi.
  • Lợn nái chửa: Tiêm định kỳ 1 năm 2 lần; mỗi lần gồm 2 mũi: mũi 1 tiêm trước khi đẻ 1 tháng (2 ml/con), mũi 2 tiêm sau mũi 1 từ 7–10 ngày (2 ml/con).
  • Lợn đực giống: Tiêm định kỳ 1 năm 2 lần; mỗi lần gồm 2 mũi tiêm cách nhau 7–10 ngày (2 ml/con/mũi).
• Quy trình bảo quản: Thử nghiệm độ bền sinh học chỉ ra vacxin giữ nguyên hiệu lực bảo hộ khi bảo quản ở nhiệt độ 4–8°C trong thời gian quy định; vacxin bảo quản ở nhiệt độ phòng (18–25°C) duy trì được tính ổn định trong thời gian ngắn phục vụ quá trình vận chuyển thực địa.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả mang tính đóng góp khoa học và thực tiễn:

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học:

   • Hệ thống hóa và bổ sung các dẫn liệu khoa học chi tiết, chính xác về đặc điểm biến đổi bệnh lý lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh viêm phổi do ba loài vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm tại Việt Nam.
   • Cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử về các gen mã hóa độc tố RTX (apx), kiểu huyết thanh kháng nguyên giáp mô và các gen độc lực (sly, mrp, arcA) của các chủng giống vi khuẩn phân lập tại Việt Nam dùng trong sản xuất sinh phẩm.
   • Xác lập cơ sở khoa học về việc ứng dụng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS trong công nghệ chế tạo vacxin đa giá vô hoạt thú y, chứng minh tính ưu việt của phức hợp nhũ dầu trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể bền vững và kéo dài thời gian bảo hộ so với chất bổ trợ keo phèn truyền thống.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn và sản xuất:

   • Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng đồng thời ba bệnh viêm phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P. multocida (serotype A, D) và S. suis (serotype 2) ở quy mô phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
   • Xây dựng hoàn chỉnh quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu bao gồm các công đoạn: nuôi cấy lên men sục khí nâng cao mật độ vi khuẩn, vô hoạt bằng Formalin, phối trộn chất bổ trợ Montanide IMS và kiểm nghiệm nghiêm ngặt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực theo tiêu chuẩn ngành.
   • Xây dựng quy trình sử dụng vacxin với phác đồ và liều lượng cụ thể (2 ml/con) cho từng nhóm đối tượng (lợn con sau cai sữa, lợn nái chửa, lợn đực giống), mang lại giải pháp sinh học phòng bệnh hiệu quả, giảm thiểu chi phí sử dụng kháng sinh và nâng cao hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung được công bố trong văn bản luận án, các hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo được ghi nhận như sau:

• Hạn chế: Quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu mới được thiết lập và đánh giá ổn định ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp tại cơ sở nghiên cứu (Trung tâm R&D và nhà máy của Công ty Marphavet). Phạm vi khảo sát các chủng giống tập trung vào các serotype chiếm ưu thế chủ yếu tại Việt Nam (serotype 2, 5a, 5b của A. pleuropneumoniae; serotype A, D của P. multocida; serotype 2 của S. suis), chưa bao phủ toàn bộ các serotype hiếm gặp khác trong tự nhiên.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Nâng cấp và chuẩn hóa quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu trên dây chuyền công nghệ tự động hóa quy mô công nghiệp lớn.
  • Tiếp tục theo dõi, đánh giá thời gian kéo dài của kháng thể truyền qua sữa mẹ ở đàn con sinh ra từ lợn nái được tiêm phòng vacxin nhũ dầu qua nhiều lứa đẻ liên tiếp.
  • Giám sát định kỳ sự biến động kháng nguyên và sự xuất hiện của các serotype mới của ba loài vi khuẩn tại các vùng sinh thái chăn nuôi khác nhau để kịp thời cập nhật thành phần kháng nguyên cho vacxin.

Giá trị tham khảo

Công trình nghiên cứu có giá trị tư liệu và ứng dụng thực tiễn đối với nhiều nhóm đối tượng:

• Cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh và học viên cao học: Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu thuộc các chuyên ngành Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi, Vi sinh vật học thú y, Miễn dịch học và Dược lý thú y. Đáng tham khảo nhất là các quy trình multiplex PCR xác định serotype và độc tố vi khuẩn, phương pháp bố trí thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm và kỹ thuật kiểm tra hiệu lực vacxin bằng phương pháp trọng tài.
• Giảng viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Thú y: Cung cấp nguồn học liệu thực tế, số liệu thực nghiệm và hình ảnh bệnh tích điển hình phục vụ giảng dạy các học phần Bệnh truyền nhiễm gia súc, Chẩn đoán bệnh thú y và Công nghệ sản xuất vacxin sinh phẩm.
• Các nhà sản xuất sinh phẩm thú y và cán bộ R&D: Quy trình công nghệ nuôi cấy lên men sục khí, kỹ thuật nhũ hóa với chất bổ trợ Montanide IMS và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm bán thành phẩm là tài liệu kỹ thuật có giá trị chuyển giao công nghệ trực tiếp vào sản xuất công nghiệp.
• Bác sĩ thú y thực hành và người chăn nuôi lợn: Phác đồ tiêm phòng cụ thể cho lợn con, lợn nái và lợn đực giống cung cấp hướng dẫn thực hành tin cậy nhằm kiểm soát hội chứng hô hấp phức hợp trong trang trại.

Câu hỏi thường gặp

1. Bộ giống vi khuẩn được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá trong luận án gồm những chủng và serotype nào?
Bộ giống sản xuất gồm 6 chủng vi khuẩn thuộc ba loài được tuyển chọn và lưu giữ tại Công ty Marphavet:

• Actinobacillus pleuropneumoniae: Gồm 3 chủng thuộc các serotype 2, 5a và 5b (chứa các gen mã hóa ngoại độc tố RTX gồm apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD, apxIIIBD).
• Pasteurella multocida: Gồm 2 chủng thuộc serotype A và serotype D.
• Streptococcus suis: Gồm chủng vi khuẩn thuộc serotype 2 (mang gen gdh và các gen quy định độc lực sly, mrp, arcA).

2. Bệnh tích đại thể đặc trưng phân biệt giữa ba bệnh viêm phổi do ba loài vi khuẩn gây ra trong nghiên cứu là gì?

• Do A. pleuropneumoniae: Viêm dính màng phổi chặt vào thành xoang ngực, xuất huyết hoại tử nhu mô phổi, dịch bọt khí lẫn máu tràn ngập khí quản.
• Do P. multocida: Viêm phổi thùy điển hình, phổi đông đặc chuyển màu đỏ sang xám xanh có ranh giới rõ rệt, da vùng bụng đổi màu đỏ tím.
• Do S. suis: Viêm phổi kèm theo tổn thương màng não xung huyết, dịch khớp sưng có mủ và triệu chứng thần kinh co giật.

3. Vì sao luận án lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS thay thế cho chất bổ trợ keo phèn truyền thống?
Chất bổ trợ Montanide IMS tạo phức hợp nhũ tương giúp giữ và giải phóng kháng nguyên bền vững tại vị trí tiêm (hiệu ứng kho), kích thích tế bào trình diện kháng nguyên mạnh hơn. Kết quả nghiên cứu chứng minh vacxin bổ trợ nhũ dầu tạo hiệu giá kháng thể cao hơn, duy trì thời gian miễn dịch bảo hộ trên 6 tháng (so với 3–4 tháng của keo phèn) và không gây phản ứng u hạt, áp xe tại vị trí tiêm.

4. Phác đồ sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu được xây dựng cho từng đối tượng lợn như thế nào?
Liều tiêm quy chuẩn là 2 ml/con tiêm bắp:

• Lợn con sau cai sữa (21–28 ngày tuổi): Tiêm 1 mũi duy nhất (2 ml/con).
• Lợn nái chửa: Tiêm 1 năm 2 lần; mỗi lần tiêm 2 mũi: mũi 1 tiêm trước khi đẻ 1 tháng, mũi 2 tiêm sau mũi 1 từ 7–10 ngày (2 ml/con/mũi).
• Lợn đực giống: Tiêm 1 năm 2 lần; mỗi lần tiêm 2 mũi cách nhau 7–10 ngày (2 ml/con/mũi).

5. Các phương pháp nào đã được sử dụng để kiểm nghiệm hiệu lực bảo hộ của vacxin?
Luận án sử dụng hai phương pháp kiểm nghiệm hiệu lực:

• Phương pháp thay thế trên chuột nhắt trắng: Đánh giá khả năng bảo hộ chuột sau khi tiêm vacxin và công cường độc bằng các chủng vi khuẩn độc lực cao.
• Phương pháp trọng tài trên lợn: Đánh giá đáp ứng miễn dịch bảo hộ trực tiếp trên lợn thí nghiệm qua công cường độc và theo dõi hiệu giá kháng thể đặc hiệu bằng kỹ thuật ELISA.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Tất Đạt là công trình nghiên cứu thực nghiệm toàn diện về đặc điểm bệnh lý của lợn mắc bệnh viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis tại Việt Nam. Tác giả đã làm chủ quy trình công nghệ sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu Montanide IMS ở quy mô phòng thí nghiệm từ bộ giống vi khuẩn chuẩn hóa mang đầy đủ các yếu tố độc lực và serotype đại diện. Kết quả nghiên cứu khẳng định tính ưu việt của vacxin nhũ dầu trong việc nâng cao hiệu giá kháng thể và kéo dài thời gian miễn dịch bảo hộ trên 6 tháng so với vacxin keo phèn truyền thống. Công trình cung cấp quy trình sản xuất, kiểm nghiệm và phác đồ tiêm phòng cụ thể, đóng góp cơ sở khoa học và giải pháp thực tiễn quan trọng cho công tác phòng chống hội chứng hô hấp phức hợp trên đàn lợn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ TẤT ĐẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ TẤT ĐẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: 1. CÙ HỮU PHÚ HÀ NỘI, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Đỗ Tất Đạt i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Bá Hiên và PGS. Cù Hữu Phú đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Công ty CP thuốc thú y Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp và các cơ quan đoàn thể đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Đỗ Tất Đạt ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

i Danh mục các chữ viết tắt. v Danh mục bảng. vii Danh mục hình. ix Trích yếu luận án.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể.

Phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin phòng bệnh. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi ở lợn. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A.

pleuropneumoniae gây ra ở lợn. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh viêm phổi ở lợn. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra.

Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn. Các chất bổ trợ thường dùng trong sản xuất vacxin.

Chất bổ trợ của vacxin. Muối khoáng. Chất nhũ tương. Các chất cao phân tử.

Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A.

suis gây ra. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra.

Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra.

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra.

Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. suis gây ra. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra.

Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra.

Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. suis gây ra.

Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A. Kết quả xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn.

Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn. Kết luận và đề nghị. 104 Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án. 105 Tài liệu tham khảo .117 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ aa Amino acid A.

pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae BHI Brain Heart Infusion BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Bp Base pair CI Confidence Interval CHLB Cộng hòa liên bang cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acide dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization HT Huyết thanh KHKT Khoa học kỹ thuật M. hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae NAD Nicotinamide adenine dinucleotide NXB Nhà xuất bản OIE Office International des Epizooties P. multocida Pasteurella multocida PCR Polymerase Chain Reaction PLLO Pleuropneumonia-like organism RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction S. suis Streptococcus suis TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam THB Todd Hewitt Broth TN Thí nghiệm TSB Tryptic Soy Broth TT Thông tư v Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ TYE Tryptone Yeast Extract Broth TW Tryptone water USA United States of America USD United States dollar VNUA Vietnam National University of Agriculture vi DANH MỤC BẢNG Thứ tự Tên bảng Trang 3.

Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của Pasteurella multocida. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của Streptococcus suis theo tiêu chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010. Thành phần phản ứng.

Chu trình nhiệt. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba loại độc tố Apx của A. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của Streptococcus suis. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của Streptococcus suis.

Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn A. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm A. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn P. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P.

Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn S. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm S. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất A. Kết quả xác định gen sản sinh độc tố của giống sản xuất A.

Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn A. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất P. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất P. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn P.

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất S. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất S. Kết quả xác định serotype của các chủng S. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn S.

Kết quả nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp lên men sục khí. Kết quả kiểm tra đậm độ, thuần khiết và vô trùng của lô giống đơn giá. Kết quả kiểm tra thuần khiết và vô trùng của vacxin đa giá bán thành phẩm. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên chuột nhắt trắng.

Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên lợn. Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin trên lợn bằng phương pháp trọng tài. Kết quả kiểm tra kháng thể trên lợn tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng viêm phổi lợn kháng lại vi khuẩn A.

Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu bằng phương pháp ELISA. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P.