MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia trên thế giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá góp phần tạo công ăn việc làm và thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động. Ngoài ra, cây thuốc lá còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Hơn nữa, với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai tốt, thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình trong nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản nhƣ: nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở thực vật; nghiên cứu vai trò, chức năng của gene và protein cũng nhƣ làm đối tƣợng để tiếp nhận gene ngoại lai.
Thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên. Cho tới nay, hơn 2000 loại virus gây hại trên thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, trong đó có nhiều loài gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lƣợng cây trồng nhƣ: bệnh khảm lá chủ yếu là do Tobaco mosaic virus (TMV) và Cucumber mosaic virus (CMV) gây nên; bệnh xoăn đọt vàng lá, héo ngọn do virus héo đốm cà chua Tomato spotted wilt (TSWV) và Tomato yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên. Các virus này gây thiệt hại nghiêm trọng tới năng suất cây trồng có thể lên tới 95% thậm chí là 100%, làm ảnh hƣởng lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia và trong đó có Việt Nam [3]. Bệnh do virus gây ra không có biện pháp diệt trừ mà chỉ có thể phòng bệnh.
Các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng để phòng ngừa, hạn chế sự lây lan của virus nhƣ: loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, trồng luân canh giữa các cây trồng, vệ sinh đồng ruộng. đều không mang lại hiệu quả cao mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Việc tìm ra các biện pháp để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn cấp bách. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng dụng sinh học phân tử trong chọn tạo giống cây trồng kháng virus, trong đó, công nghệ RNA interference (RNAi) là một giải pháp hữu hiệu nhất thông 1 z qua việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gene mã hóa protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để chuyển vào cây trồng tạo cây trồng chuyển gene kháng lại chính virus đó.
Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo ra giống cây trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh nhƣ kiểm soát virus Y ở khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV (Rice yellow mottle virus) vào cây lúa [34]; kháng virus khảm dƣa chuột (CMV) [11][26], virus khảm thuốc lá (TMV) [12]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình đã công bố chỉ là chuyển đơn gene hoặc gene kép để tạo cây trồng kháng một hoặc hai loài virus nhất định, cây trồng vẫn có thể bị nhiễm các loài virus khác. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thiết kế đƣợc cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây bệnh hại trên cây thuốc lá hiện nay.
- Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang các cấu trúc gene đa đoạn. - Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc gene chuyển. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus - Sử dụng các trình tự gene CP của các virus để thiết kế mồi đặc hiệu.
- Ghép nối các đoạn gene. - Xác định trình tự gene 2. Thiết kế vector RNAi - Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP của 4 loại virus. - Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II) bằng kỹ thuật Gateway.
- Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A. Chuyển gene vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A. tumefaciens - Chuyển gene - Phân tích cây chuyển gene 2 z Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.
Lịch sử phát triển của cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum và Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ châu Mỹ, là cây nhiệt đới và á nhiệt đới, có hƣơng vị đặc trƣng và đƣợc ngƣời bản địa sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo và dùng làm thuốc chữa bệnh [6]. Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dƣơng, ông đã phát hiện ngƣời bản xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là Tabaccos. Các thông tin về sự phân bố rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác nhau đã đƣợc một số tác giả đƣa ra [13]. Thuốc lá bắt đầu đƣợc trồng ở châu Âu vào khoảng những năm 1496 - 1498 do nhà truyền đạo ngƣời Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ về.
Andre Teve mang hạt từ Braxin về trồng ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha năm 1556 [9]. Thuốc lá đƣợc du nhập vào trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản từ giữa thế kỷ thứ XVI, ở Ấn Độ vào khoảng năm 1605. Từ đó, các nƣớc này đã trở thành các nhà sản xuất thuốc lá lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa và thị trƣờng thuốc lá thế giới. Ở Việt Nam, thuốc lá đã đƣợc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh Tông, nhƣng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá mới chính thức đƣợc phát triển tại Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) và ở một số tỉnh miền bắc với giống ban đầu là Virginia Bland Cash [10].
Phân loa ̣i và nguồn gốc Thuố c lá có tên khoa ho ̣c là : Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35]. Chi Nicotiana có khoảng 50-70 loài, đa số là cây da ̣i , căn cứ vào hiǹ h thái , màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính: Loài Nicotiana tabacum L. Có hoa màu hồng , đỏ tƣơi hoă ̣c đỏ thẫm là loài phổ biến nhất chiếm 90% diê ̣n tić h thuố c lá trên thế giới , hầ u hế t các 3 z giố ng thuố c lá sơ ̣i vàng thuô ̣c loa ̣i này. Loài Nicotiana rustica L.
Có hoa màu vàng , chiế m 10% diê ̣n tích, hầ u hế t các giố ng thuố c lá sơ ̣i nâu và sơ ̣i đen thuô ̣c loa ̣i này , thƣờng dùng để nhai, ngƣ̉i, làm thuốc xì gà. Loài Nicotiana petunioide L. Có hoa màu trắng , phớt hồ ng hay tím , thƣờng có trong vƣờn thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c phu ̣c vu ̣ nguồ n dƣ̣ trƣ̃ gene cho lai , íttacọ́o trong sản xuất. Loài Nicotiana polidieide L.
Có hoa màu trắng, trong thƣ̣c tế cũng có ít trong sản sản xuấ t, chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số nƣớc. Các giống thuốc lá sợi vàng có chất lƣợng cao là Virginia gold, Virginia blond cash, Virginia bright… đƣợc trồ ng nhiề u ở Mỹ , Italia, Bungari, Trung Quố c, Ba Lan, Đức và một số nƣớc khác ở Nam Mỹ. Ở Việt Nam, các giống thuốc lá sợi vàng đƣợc trồng lâu năm ở Ba Vì và Cao Bằ ng, giố ng Trung Hoa Bài trồ ng ở các tỉnh phiá Bắ c , các giống C-83, K 51E, Coker 176, K326, C9-1, Burley và Flue-Cured virginia trồng phổ biế n ở Nam và Trung bô. ̣ Hiện nay, giống thuốc lá N.
K326 và C9-1 đƣợc trồng phổ biến nhất [3]. Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá Thuốc lá là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm quan trọng bậc nhất đối với nền kinh tế thế giới.Việc trồng thuốc lá không chỉ trực tiếp tạo công ăn việc làm cho trên 33 triệu nông dân của hơn 120 quốc gia trên thế giới mà còn đóng vai trò quan trọng cho toàn bộ nền công nghiệp thuốc lá [13]. Các hãng sản xuất thuố c lá trên thế giới đề u phải thƣ̀a nhâ ̣n rằng thuố c lá đem đến cho họ nguồn lợi nhuận khổng lồ. Ở một số nƣớc nhƣ Brazil , Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari… thuố c lá là mô ̣t mă ̣t hàng chiế n lƣơ ̣c, cho thu nhâ ̣p lớn hơn các các loa ̣i cây trồ ng khác.
Các số liệu thống kê đã ƣớc tiń h khoảng ¼ sản lƣơ ̣ng thuố c lá trên thế giới đã đƣa vào kim nga ̣ch xuấ t khẩ u. Ngoài ra, cây thuố c còn giải quyế t nhiề u vấ n đề khác nhƣ luân canh , tăng vu ̣, tâ ̣n du ̣ng đấ t đai, lao đô ̣ng và thu nhâ ̣p cao hơn mô ̣t số cây trồ ng khác. 4 z Ở Việt Nam, cây thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ và Nam Bộ. Đây là cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập cho quốc gia.
Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam (Vinataba) [3] trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu của thuốc lá đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nƣớc đƣợc 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của ngƣời lao động đƣợc bảo đảm, đời sống từng bƣớc đƣợc nâng cao. Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị về mặt khoa học, thuốc lá là một trong những cây mô hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối tƣợng thực vật nhƣ: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… vì nó dễ tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trƣởng và chống chịu tốt [40]. Trong y dƣợc học, thuốc lá là dƣợc liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng nhƣ chấy, rận, ghẻ, lá khô giã đắp vào vết thƣơng để cầm máu [50]. MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.
Bệnh virus trên cây thuốc lá Hiện nay, năng suất và chất lƣợng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do bệnh virus hoành hành. Trong đó, phổ biến và nghiêm trọng nhất là các bệnh khảm lá do TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm ngọn do các loài virus TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) và TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1. Năm 2008, theo thống kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích thuộc Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMV và CMV là hai loài virus gây hại chủ yếu trên cây thuốc lá ở Việt Nam.