MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp đƣợc trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017) đƣợc canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lƣợng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015) ây m a đƣợc sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm: sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá, thân đã đƣợc ép đƣờng; tạo n ng lƣợng: n ng lƣợng sinh học tái tạo từ rỉ đƣờng…; công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al. Việc cải thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã đƣợc nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lƣợng đƣờng, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress nhƣ: hạn hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số đặc thù của cây m a nhƣ: k ch thƣớc hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức tạp (2n 70-140 , và sự tƣơng tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trƣờng (Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phƣơng pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất. ây m a đƣợc biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng (bọ hung, xén tóc , sâu đục thân, rệp nhƣng phần lớn chúng thƣờng b giới hạn bởi sự phân bố đ a lý.
Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thƣơng mại giữa các nƣớc cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây hại trên mía ngày càng khó kiểm soát. Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm trọng. ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hƣởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trƣởng thành Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996. Việc tạo ra cây trồng biến đổi 2 gen là bƣớc đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng cƣờng hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hƣởng tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và các loài sinh vật khác (James, 2014).
Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae. Ấu trùng bọ hung thƣờng đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trƣởng thành chúng n các bộ phận nhƣ thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al. Kết quả nghiên cứu cho thấy, không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng gây hại (James, 2014). Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ cry8 đã đƣợc chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong đó có bọ hung (Zhang et al.
ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra nhờ sử dụng hai phƣơng pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A. Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen thực vật là phƣơng pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D t nh kháng n tr ng v o m ”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ hung hại m a 3.
Nội dung nghiên cứu 1. Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a 4.
Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A. Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8Db. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận nghiên cứu t ng cƣờng khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua A.Ý nghĩ lý luận Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt. Ý nghĩ thực tiễn 1.
Tạo đƣợc protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua vi khuẩn E.coli Rosetta - amy B, chứng minh đƣợc protein tinh sạch có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang. Tạo đƣợc các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a 5. Đóng góp mới của luận án 1. Đã chứng minh đƣợc protein ry8 b k ch thƣớc phân tử khoảng 73 K a có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau.
Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngƣỡng cao nhất với giá tr LC50 = 345,4 ng/g. Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db. ông trình đã tạo đƣợc 13 dòng m a chuyển gen cry8Db. Protein Cry8Db ở các dòng mía chuyển gen đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg protein tổng số.
Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp (12,91% , khối lƣợng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày. 4 ƯƠ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. guồn gốc và vị trí phân loại Cây mía (Saccharum officinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum, họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín (Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006). Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011).
Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S. Trong số này, S. (loài hoang dại với bộ NST thể d bội đƣợc cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay (Sandhu et al. Các giống m a thƣơng mại ngày nay là con lai giữa S.
(chiếm 10–20% hệ gen) (Hoarau et al.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th ng mại ngày nay A: Loài S. đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới ở châu và châu Phi, có môi trƣờng sống đa dạng Đây là một loài trong tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m Hầu hết loài S. spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lƣợng đƣờng thấp, và tỷ lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014) ác ngành công nghiệp m a đƣờng trên thế giới đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S. officinarum L , đặc trƣng của loài này là hàm lƣợng đƣờng cao, lƣợng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al.
Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền Đặc điểm hình thái M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đƣờng và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và xantophin hợp thành màu sắc đặc trƣng của từng giống m a iữa các dóng thân là các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trƣởng, r , chồi bên và sẹo lá Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc theo đƣờng vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng 5 -7 cm (Taparia et al.