Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu chuyển gen cry8db kháng côn trùng vào cây mía

• Tác giả: Phan Thị Thu Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Viện Công nghệ Sinh học
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen cry8Db kháng côn trùng vào cây mía
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ sinh học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI ĐẦU
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
• 1.5. Đóng góp mới của luận án
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
• 2.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền
• 2.3. Giá trị của cây mía và tình hình sản xuất mía đường
• 2.4. Bọ hung hại mía và biện pháp phòng trừ
• 2.5. Hệ thống nuôi cấy in vitro của cây mía
• 2.6. Các nghiên cứu tạo cây mía chuyển gen
• 2.7. Nguồn gen kháng côn trùng của Bt
• 2.8. Cơ chế gây độc của các độc tố Bt lên sâu hại
• 2.9. Nhóm gen cry8 và đặc tính kháng bọ hung gây hại cây trồng
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 3.1.1. Vector và chủng khuẩn
• 3.1.2. Cặp mồi sử dụng
• 3.1.3. Hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Biểu hiện protein độc tố cry8 b trong vi khuẩn E.coli Rossetta amy-B và thử hoạt tính kháng ấu trùng
• 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen vào cây mía
• 3.2.3. Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro ở cây mía
• 3.2.4. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây mía thông qua chuyển gen gus
• 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng phản ứng PCR
• 3.2.6. Phân tích sự tích lũy protein cry8 b tái tổ hợp trong các dòng mía mang gen chuyển bằng kĩ thuật L S
• 3.2.7. Phương pháp Western blot
• 3.2.8. Thử nghiệm sinh học đánh giá khả năng kháng ấu trùng
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Biểu hiện protein cry8Db trong vi khuẩn E.coli Rossetta Gamy B và thử hoạt tính ấu trùng
• 4.1.1. Thiết kế vector biểu hiện pT-21a (+) mang gen cry8Db
• 4.1.2. Biểu hiện gen cry8Db trong tế bào E.coli Rossetta Gamy B
• 4.1.3. Tối ưu sự biểu hiện gen cry8Db trong vi khuẩn E.coli Rossetta gamy B
• 4.1.4. Tinh sạch và kiểm tra bằng Western Blot protein tái tổ hợp Cry8Db
• 4.1.5. Đánh giá tình hình phân bố của ấu trùng thu được ở vùng nguyên liệu mía Sơn Nam, Tuyên Quang
• 4.1.6. Đánh giá hoạt lực kháng ấu trùng cry8 b tái tổ hợp
• 4.2. Thiết kế vector chuyển gen cry8Db vào cây mía
• 4.2.1. Thiết kế vector pB 121/35S/cry8 b/NOST
• 4.2.2. Thiết kế vector p MB 1300/aMV35S/cry8 b/NOST
• 4.3. Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro ở mía
• 4.3.1. Sự tái sinh in vitro qua chồi đỉnh
• 4.3.2. Sự tái sinh in vitro qua chồi nách
• 4.3.3. Sự tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non
• 4.3.4. Sự tái sinh chồi in vitro thông qua phôi soma cây mía
• 4.4. Tối ưu quy trình chuyển gen vào mía
• 4.4.1. Quy trình chuyển gen gus in vitro vào cây mía
• 4.4.2. Quy trình chuyển gen gus ex vitro vào cây mía
• 4.5. Đánh giá khả năng kháng ấu trùng bọ hung ở các dòng mía chuyển gen
• 4.5.1. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây mía trong điều kiện in vitro
• 4.5.2. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây mía trong điều kiện ex vitro
• 4.5.3. Đánh giá khả năng kháng ấu trùng của các dòng mía chuyển gen
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ

I. Chuyển gen và ứng dụng trong cải tiến giống cây trồng

Chuyển gen là kỹ thuật quan trọng trong công nghệ sinh học, giúp cải thiện đặc tính nông học của cây trồng. Trong nghiên cứu này, gen cry8Db được chuyển vào cây mía nhằm tăng khả năng kháng côn trùng. Kỹ thuật này không chỉ rút ngắn thời gian tạo giống mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực của thuốc trừ sâu hóa học. Nghiên cứu khoa học đã chứng minh hiệu quả của việc sử dụng kỹ thuật di truyền để tạo ra các giống cây trồng bền vững, đặc biệt trong nông nghiệp bền vững.

1.1. Cơ sở khoa học của chuyển gen

Chuyển gen dựa trên nguyên lý chèn gen mong muốn vào hệ gen của cây trồng. Trong nghiên cứu này, gen cry8Db được chọn vì khả năng tạo ra protein độc tố diệt côn trùng gây hại. Các kỹ thuật di truyền như sử dụng Agrobacterium tumefaciens giúp quá trình chuyển gen hiệu quả hơn. Đây là phương pháp được ưa chuộng trong công nghệ sinh học thực vật.

1.2. Ứng dụng trong cải tiến giống cây mía

Cây mía là cây trồng quan trọng trong nông nghiệp, nhưng thường bị ảnh hưởng bởi côn trùng gây hại. Việc chuyển gen cry8Db vào cây mía giúp tạo ra các giống mía kháng côn trùng, giảm thiệt hại do sâu bệnh. Nghiên cứu này mở ra hướng mới trong bảo vệ thực vật và phát triển nông nghiệp bền vững.

II. Gen cry8Db và cơ chế kháng côn trùng

Gen cry8Db thuộc nhóm gen cry của Bacillus thuringiensis (Bt), có khả năng tạo ra protein độc tố diệt côn trùng gây hại. Protein này tác động lên hệ tiêu hóa của ấu trùng, gây chết chúng. Trong nghiên cứu này, gen cry8Db được biểu hiện trong E. coli và chứng minh hiệu quả kháng ấu trùng bọ hung. Đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng công nghệ gen trong bảo vệ thực vật.

2.1. Cơ chế hoạt động của protein Cry8Db

Protein Cry8Db tác động lên ruột giữa của ấu trùng bọ hung, gây tổn thương tế bào và dẫn đến chết. Nghiên cứu đã xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein này đối với các giai đoạn ấu trùng khác nhau. Kết quả này khẳng định hiệu quả của gen cry8Db trong việc kiểm soát côn trùng gây hại.

2.2. Ứng dụng trong bảo vệ cây mía

Việc chuyển gen cry8Db vào cây mía giúp tạo ra các giống mía kháng côn trùng, đặc biệt là bọ hung. Nghiên cứu đã tạo ra 13 dòng mía chuyển gen, trong đó dòng S3 cho thấy khả năng kháng ấu trùng Lepidiota signata tốt nhất. Đây là bước tiến quan trọng trong bảo vệ thực vật và phát triển nông nghiệp.

III. Kỹ thuật tái sinh và chuyển gen vào cây mía

Nghiên cứu đã xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả cho cây mía, sử dụng các phương pháp như tái sinh từ chồi đỉnh, chồi nách và phôi soma. Quy trình chuyển gen được tối ưu hóa, bao gồm cả in vitro và ex vitro, sử dụng Agrobacterium tumefaciens. Kết quả cho thấy hiệu quả cao trong việc tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db.

3.1. Hệ thống tái sinh in vitro

Hệ thống tái sinh in vitro được thiết lập dựa trên các phương pháp tái sinh từ chồi đỉnh, chồi nách và phôi soma. Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện môi trường và chất kích thích sinh trưởng để đạt hiệu quả cao nhất. Đây là bước quan trọng trong quy trình chuyển gen vào cây mía.

3.2. Tối ưu quy trình chuyển gen

Quy trình chuyển gen được tối ưu hóa cả trong điều kiện in vitro và ex vitro, sử dụng Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen, bao gồm mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone và thời gian lây nhiễm. Kết quả cho thấy hiệu quả cao trong việc tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db.

IV. Đánh giá hiệu quả kháng côn trùng của cây mía chuyển gen

Các dòng cây mía chuyển gen cry8Db được đánh giá khả năng kháng côn trùng thông qua thử nghiệm sinh học. Kết quả cho thấy dòng S3 có khả năng kháng ấu trùng Lepidiota signata tốt nhất, với tỷ lệ bị phá hại thấp và khối lượng ấu trùng giảm đáng kể. Nghiên cứu này khẳng định tiềm năng ứng dụng công nghệ gen trong bảo vệ thực vật và phát triển nông nghiệp.

4.1. Thử nghiệm sinh học

Thử nghiệm sinh học được thực hiện để đánh giá khả năng kháng côn trùng của các dòng cây mía chuyển gen cry8Db. Kết quả cho thấy dòng S3 có khả năng kháng ấu trùng Lepidiota signata tốt nhất, với tỷ lệ bị phá hại thấp và khối lượng ấu trùng giảm đáng kể. Đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng công nghệ gen trong bảo vệ thực vật.

4.2. Ứng dụng trong thực tiễn

Nghiên cứu này mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ gen trong bảo vệ thực vật và phát triển nông nghiệp. Các dòng cây mía chuyển gen cry8Db có thể được sử dụng để giảm thiệt hại do côn trùng gây hại, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.