CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung về vi khuẩn B.subtilis natto Nattokinase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Bacillus khác nhau bao gồm B. Đáng chú ý trong các chủng thì B.subtilis không gây bệnh và có khả năng sinh tổng hợp protein ngoại bào trực tiếp ra môi trường nuôi cấy.subtilis đảm nhiệm như vật chủ hấp dẫn để sản xuất nattokinase.subtilis cũng là một probiotic điển hình. Thứ nhất là sản phẩm probiotic B.subtilis dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.
Ưu điểm thứ hai là bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày [84][85]. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, nhiều sản phẩm probiotic B.subtilis đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng B.subtilis natto để có thể khai thác cả hai chức năng: chức năng probiotic của sinh khối và enzyme nattokinase ngoại bào. Loài Bacillus được phân loại như sau [60]: Giới (regnum): Bacteria Ngành (phylum): Protophyta Lớp (class): Schyzomycetes Bộ (ordo): Eubacillales Họ (familia):Bacillaceae Chi (genus): Bacillus Loài (species): Bacillus subtilis Bacillus subtilis natto còn gọi tên khác: Bacillus subtilis sp.
natto, Bacillus subtilis var. Khi giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy DNA của B.subtilis natto và B.subtilis có mức độ tương đồng cao [23]. Điều này chứng tỏ chúng cùng một l oài. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn B.subtilis natto Theo phân loại của Bergey (1974), B.subtilis natto có những đặc điểm sau: là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que ngắn, kích thước 3 – 5 × 0,5 – 0,8µm, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính với nhau tạo thành chuỗi ngắn.
Nhiệt độ phát triển từ 36 – 500C, 4 nhiệt độ tối thích là 37 0C. Chịu ngưỡng pH từ 5,8 – 8,5 [41]. Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, về sau tiêm mao rụng khi tế bào già nên vi khuẩ n mất khả năng di động trong môi trường.subtilis natto dưới kính hiển vi [5] Hình 1.2: Đặc điểm khuẩn lạc của B.subtilis natto [117] Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào B.subtilis sẽ tạo bào tử. Khác với nấm m ốc, bào tử vi khuẩn (nha bào) không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục.
Bào tử có chứa acid dipicolinic (5 – 10% so với chất khô), được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài. Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào nên vi khuẩn giữ nguyên hình dạng khi hình thành bào tử. Kích thước bào tử 0,8 – 1,8µm. Bào tử chịu nhiệt khá cao và phát triển bằng cách nảy mầm.
5 Chúng phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây).subtilis natto phát triển rất nhiều trong đậu nành. Vi khuẩn này cũng phát triển trên loại đậu khác, trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật khác nh ư tảo biển,… B.subtilis natto sử dụng nguồn carbon là glucose, sucrose, fructose, … trong đ ó sucrose cần thiết cho vi khuẩn phát triển và sản xuất chất nhớt.subtilis natto cũng cần biotin, trong môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm được.subtilis natto cần oxy, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh bào tử là 40 0C, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển 39 – 430C. Ở 55 0C vi khuẩn ngừng phát triển và có sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra.subtilis natto phát triển ở pH trung tính, sự nảy chồi và ức chế ở pH = 4,5 hoặc thấp hơn [39][50].
Các sản phẩm trao đổi chất của B.subtilis natto rất phong phú và đa dạng. Trong đó có enzyme tiêu hóa như amylase, protease, cellulase, … và enzyme chức năng như nattokinase, … được sinh ra trong quá trình hoạt đ ộng sống, có ý nghĩa thương mại rất lớn. Sinh tổng hợp nattokinase Nattokinase được mã hóa bởi gen aprE (subtilisin E từ B.subtilis), aprN (subtilisin nattokinase từ Bacillus subsp natto), gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha ổn định trong tăng trưởng ở B.subtilis natto dưới sự kiểm soát của promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-porulation). Ps chỉ hoạt động khi có sự gắn kết với Spo0A, là một DNA-binding-protein giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) - điều hòa trực tiếp và gián tiếp khoảng 500 gen và có liên quan chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử và hiện tượng khả nạp ở B.
Do có vai trò điều hòa khá quan trọng, lượng Spo0A ở dạng hoạt hóa (dạ ng phosphoryl hóa) đượ c kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phosphorelay (chuỗi các protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop). Vì vậy, thực nghiệm đã cho thấy rằ ng sự tổ ng hợp nattokinase (subtilisin) trong tự nhiên ở B. subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn.3: Cơ chế tổng hợp và tiết protein ở vi khuẩn [32] Vi khuẩn là sinh vật đơn bào, chưa có sự phân hóa thành các hệ màng nội bào. Nên ribosome 70S (gồm hai tiểu đơn vị 30S, 50S) là nơi diễn ra quá trình sinh tổng hợp protein, nằm rải rác trong tế bào chất.
Khi nhận tín hiệu tổng hợp protein, vùn g tương tự nhân chứa một phân tử DNA trần thực hiện quá trình phiên mã tạo mRNA. mRNA di chuyển ra tế bào chất cùng với ribosome tổng hợp nên protein. Protein được sản xuất theo hình thức preproprotein trong đó presequence và prosequence được gắn vào đầu N của protein trưởng thành. Ribosome tổng hợp protein còn phụ thuộc vào sự hiện diện (+SP) hoặc vắng mặt ( -SP) của một peptide tín hiệu N -terminal và tín hiệu duy trì đặc hiệu.
Presequence đóng vai trò như một tín hiệu peptide cho tiết protein ra ngoài môi trường và prosequence là chaperone nội nguyên tử, điều khiển việc gấp cuộn chính xác protein trưởng thành và bị phân cắt bởi autoproteolysis. Protein sau khi biệt hóa kết hợp với màng sinh chất và giải phóng ra ngoài tế bào (xuất bào). Protein ngoại bào đư ợc tiết trực tiếp ra môi trường ngoài qua con đường Sec hoặc Tat hoặc vận chuyển qua ABC. Từ trước đến nay nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn chủng B.subtilis natto trên cơ chất đậu nành hấp chín hay lên men dịch thể.
Để thu 7 được nattokinase có hàm lượng cao và hoạt tính ổn định, người ta thường sử dụng chủng bằng con đường tái tổ hợp (loại bỏ yếu tố giới hạn, sử dụng vector biểu hiện với cấu trúc ổn định cao, tối ưu hóa promotor) [10] hoặc tiếp cận với các thông số đã được ng hiên cứu tối ưu hóa trong môi trường lên men bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology) [59][34]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase Lựa chọn các thành phần môi trường là một yếu tố quan trọ ng trong công nghiệp lên men nói chung. Do các loài vi sinh vật khác nhau có các đặc tính sinh lý khác nhau, nên rất cần thiết để tối ưu hóa thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường cho sự phát triển và sản xuất enzyme thủy phân fibrin [37]. Để có thể ứng dụng thành công trên quy mô công nghiệp cần phải đưa ra được lựa chọn tối ưu cho hoạt tính enzyme và giá thành sản phẩm.
Thành phần môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chi phí của sản xuất. Lựa chọn tối ưu nhất đó là tìm kiếm những nguồn dinh dưỡng sẵn có, giá thành thấp mà cho hoạt lực enzyme cao. Các yếu tố dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme là nguồn carbon, nguồn nitơ, muối khoáng. Các chủng khác nhau thì thành phần môi trường và nguồn dinh dưỡng cũ ng tương đối khác nhau.
Nguồn carbon là nguồn năng lượng chính để vi sinh vật sinh trưởng, phát triển [119] và tổng hợp enzyme protease. Tuy nhiên, tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà B.subtilis sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau để phân giải chúng và cung cấp năng lượng cho tế bào. Các nghiên cứu của K. Nhiều tối ưu hóa về tối ưu h óa nguồn carbohydrate cho vi khuẩn B.subtilis natto sản xuất nattokinase đều xác định maltose là nguồn carbohydrate thích hợp nhất.
Nhưng nồng độ maltose ở các nghiên cứu chưa thống nhất như Junguo Liu (2005) tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổ ng hợp nattokinase từ chủng B.subtilis natto NLSSE sử dụng maltose 2% [87], Dja-Shin Wang xác định maltose 3% là nguồn carbohydrate tốt nhất cho B.subtilis natto sản xuất nattokinase [88], Hu Ling -li 8 (2011) xác định maltose 1% là nguồn carbohydrate thích h ợp nhất [89]. Nguồn nitơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm bột đậu nành, cao thịt, cao nấm men. Đây là chất quan trọng trong hầu hết các đại phân tử sinh học (protein, acid nucleic, enzyme, …) và trong cấu tạo tế bào.subtilis natto có thể sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Việc thiếu nitơ sẽ làm cho quá trình sinh tổng hợp protein và các đại phân tử sinh học bị hạn chế.
Tuy nhiên nếu hàm lượng nitơ dư thừa thì quá trình sinh tổng hợp có xu hướng giảm. Vì khi nồng độ nitơ bên ngoài tế bào vượt quá ngưỡng cho phép sẽ xảy ra hiện tượng chênh lệch áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào, làm hạn chế sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào trong tế bào, làm giảm quá trình sinh tổng hợp các đại phân tử sinh học. Trong đó peptone soya bean vừa cung cấp nguồn nitơ cho B.subtilis natto vừa là chất cảm ứng kích thích tế bào tiết nattokinase. Các yếu tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nattokinase.
Deepak (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp nattokinase từ B.subtilis cho hoạt tính enzyme cao nhất khi có mặt 0,2% MgSO4, 0,5% CaCl2 [59]. Ngoài ra, Ca2+ tham gia vào trung tâm hoạt động và làm bền enzyme nattokinase [119], nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Ca 2+ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase [59]. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng tích cực của muối vô cơ đến khả năng sinh protease của vi khuẩn. Tuy nhiên, nồng độ muối cao có thể kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn [12].
Chất cảm ứng được xem như yếu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật.